Xã hội hiện đại ngày nay cùng với yêu cầu về tuổi thọ phải ngày càng cao đã đặt ra cho các nhà khoa học nhiều bài toán mới nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học đặc biệt là các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên do khả năng gây độc của chúng thấp, độ an toàn trong sử dụng cao để ứng dụng trong điều trị bệnh nhất là các loại bệnh nan y, và hiện nay họ flavonoid nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới do chúng luôn có mặt trong các loại thực phẩm hàng ngày của con người, các nghiên cứu cho thấy các chất thuộc họ này không gây độc cho cơ thể dù dùng ở liều cao và khi sử dụng kết hợp với các loại thuốc khác như thuốc trị ung thư thì giúp làm giảm tác dụng phụ của các loại thuốc này. Rất nhiều các hợp chất được chiết tách đã được nghiên cứu và thử nghiệm, hàng loạt các hợp chất tổng hợp và bán tổng hợp vẫn đang liên tục được tạo ra trên rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc, các chất hóa học có tác dụng mạnh hơn và ít độc hại hơn đối với cơ thể người bệnh. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề ra hướng nghiên cứu cho đề tài là tiến hành tổng hợp dẫn xuất của rutin, một hợp chất có hàm lượng cao trong cây hoa hòe ở Việt Nam, từ đó thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng nhằm có được những nghiên cứu bước đầu cho việc tổng hợp các dẫn xuất khác sau này đồng thời hy vọng có thể tìm thêm được những hợp chất mới có khả năng ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y dược.
Xã hội hiện đại ngày nay cùng với yêu cầu về tuổi thọ phải ngày càng cao đã đặt ra cho các nhà khoa học nhiều bài toán mới nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học đặc biệt là các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên do khả năng gây độc của chúng thấp, độ an toàn trong sử dụng cao để ứng dụng trong điều trị bệnh nhất là các loại bệnh nan y, và hiện nay họ flavonoid nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới do chúng luôn có mặt trong các loại thực phẩm hàng ngày của con người, các nghiên cứu cho thấy các chất thuộc họ này không gây độc cho cơ thể dù dùng ở liều cao và khi sử dụng kết hợp với các loại thuốc khác như thuốc trị ung thư thì giúp làm giảm tác dụng phụ của các loại thuốc này. Rất nhiều các hợp chất được chiết tách đã được nghiên cứu và thử nghiệm, hàng loạt các hợp chất tổng hợp và bán tổng hợp vẫn đang liên tục được tạo ra trên rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc, các chất hóa học có tác dụng mạnh hơn và ít độc hại hơn đối với cơ thể người bệnh. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề ra hướng nghiên cứu cho đề tài là tiến hành tổng hợp dẫn xuất của rutin, một hợp chất có hàm lượng cao trong cây hoa hòe ở Việt Nam, từ đó thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng nhằm có được những nghiên cứu bước đầu cho việc tổng hợp các dẫn xuất khác sau này đồng thời hy vọng có thể tìm thêm được những hợp chất mới có khả năng ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y dược. 1 Flavonoid là một nhóm bao gồm khoảng 4000 hợp chất tự nhiên hiện diện trong nhiều thành phần của cây cối cũng như trong các loại rau quả, nước uống như rượu vang đỏ, trà, cà phê, bia hay cả trong các bài thuốc dân gian. Người ta dự đoán con người tiêu thụ tổng lượng flavonoid trong thực phẩm vào khoảng vài trăm milligram mỗi ngày. Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản là 1,3- diphenylpropan nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối nhau qua một dây có 3 carbon ( C 6 -C 3 -C 6 ). Cấu trúc là một vòng kín hoặc mở. Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3 carbon, gồm có các nhóm: flavon, flavanon, flavonol, auron, neoflavonoid, rotenoid, dihydroflavonol, chalcon, dihydrochalcon, anthocyanidin, leucoanthocyanidin, isoflavon. !"#$ Cấu trúc của một số dạng flavonoid 2 % &'() %*+, /0*12*34"4+567+38+/9:/; Các flavonoid đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển và tự vệ của cây. %%<"#/#=,5>?/2@/0*12*34"4+5 Flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học mà dù ở nồng độ cao cũng không gây độc cho cơ thể như khả năng kháng oxy hóa, kháng khối u, kháng viêm, kháng dị ứng và là tác nhân bảo vệ gan. Vì vậy, nghiên cứu về hoạt tính của các flavonoid luôn nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học đặc biệt là nghiên cứu về khả năng kháng khối u của flavonoid. %%A#B"C"DE#F"D4G:#H*/0*12*34"4+5 Các flavonoid là các chất kháng oxy hóa tự nhiên. Các flavonoid có khả năng bắt các gốc gây oxy hóa như superoxide anion, các gốc hydroxyl, peroxy. %%%F/"#9"/#7"DI"D,#> Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu ở mức độ in vitro và in vivo cũng như các nghiên cứu về dịch tễ học đề cập đến vai trò của flavonoid ở khẩu phần ăn hàng ngày trong việc ngăn ngừa ung thư, một số sự kết hợp trong điều trị được đề cập đến đối với thực phẩm giàu flavonoid như sử dụng đậu nành và ung thư vú thời kỳ tiền mãn kinh, trà xanh và ung thư bao tử, hành và ung thư phổi… Vì vậy, hiểu biết thêm về khả năng chống ung thư của các loại thực phẩm này sẽ giúp bổ sung thói quen trong ăn uống của chúng ta. Ngoài ra, bên cạnh các flavonoid tự nhiên thì các flavonoid tổng hợp là những ứng cử viên cho các loại thuốc chống ung thư trong tương lai, một số các hợp chất này đang ở trong giai đoạn thăm dò 3 lâm sàng như flavopiridol, 5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid, phenoxodiol hay silybin,… Cơ chế kháng ung thư của flavonoid - Flavonoids là tác nhân ngăn ngừa về mặt hóa học - Flavonoid ức chế sự phát triển hoặc tăng sinh của tế bào ung thư - Flavonoid là tác nhân chống lại sự xâm nhập, sự bám dính và sự phát triển mạch - Các dẫn xuất flavonoid có tác dụng ngăn ngừa tác dụng phụ của doxorubicin. %%JA#B"C"DE#F"D3+KL Do khả năng của flavonoid ức chế lại sự tạo thành các chất trung gian của quá trình viêm. %%M*+, ,-4"DN#."D"DO*3P6+QI,-RST"#,+L %%U2*34"4+5V//#W/F/X"Y:L %%ZF/#4[,,<"#E#F//0*12*34"4+5 Flavonoid có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống dị ứng, chống loét, và là tác nhân bảo vệ gan. J\]^_`a Cây hòe là một loại cây có vùng nguyên liệu khá lớn trong nước, lượng nụ hòe chủ yếu chỉ để làm phẩm màu, sắc uống hoặc cung cấp cho các công ty dược để chiết rutin. Vì vậy, trên cơ sở các tính chất dược lý của flavonoid và nguồn nguyên liệu có sẵn trong nước mà chúng tôi chọn nguồn nguyên liệu ban đầu là hoa hòe để tiến hành chiết tách và sau đó là bán tổng hợp các hợp chất có được, xác định các tác dụng sinh học của chúng nhằm góp phần nghiên cứu thêm về các hợp chất này cũng như nâng cao khả năng sử dụng nguồn nguyên liệu thiên nhiên có sẵn trong nước. 4 J4*#.X3P-I,+" Cây hoa hòe mọc ở nhiều nước trên thế giới nhất là ở khu vực châu Á. Ở nước ta hoa hòe được trồng nhiều ở các tỉnh phía Bắc như Hà Nội, Sơn La, Thái Bình,… với một lượng khá dồi dào có thể đáp ứng nhu cầu lớn trong sản xuất các sản phẩm dược. Trong cây hòe chứa 6-35% rutin tùy thuộc vào từng phần của cây (nụ hòe 30 - 35%, vỏ quả 0,5%, lá cây 4,4%). Rutin là một loại vitamin P có tác dụng rất quý, giúp tăng cường sức bền của mao mạch (thành mạch máu), làm giảm tính “dòn” và tính thấm của mao mạch. Khi thủy phân rutin sẽ cho quercetin, glucoz và rhamnoz. Rutin còn có tác dụng rất tốt trong phác đồ điều trị các bệnh viêm gan siêu vi B, C và giúp tăng cường sức đề kháng cho những người có cơ địa gầy yếu, suy nhược cơ thể, lao sơ nhiễm Chúng tôi tiến hành chiết rutin trong nụ hoa hòe để làm nguyên liệu cho cả quá trình nghiên cứu sau này. J%IX-/X,+" Quercetin là một hợp chất phenol được tìm thấy trong nhiều loài cây thiên nhiên, trong nhiều sản phẩm thực phẩm, các loại thuốc nhuộm tự nhiên…. Trong những năm gần đây, quercetin được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới do nó có hoạt tính mạnh so với các loại flavonoid khác. Tuy nhiên nguồn quercetin có sẵn trong thiên nhiên tương đối thấp, đòi hỏi quá trình trích chiết lâu dài và kém hiệu quả do đó người ta đã sử dụng phương pháp thủy phân rutin, một loại flavonoid có hàm lượng cao trong một số loại cây để tạo ra quercetin. Phương pháp này đặc biệt phù hợp với điều kiện của Việt Nam, là nơi trồng nhiều cây Hòe, loại cây có hàm lượng rutin lên đến 30%. Vì vậy, trong khuôn 5 khổ đề tài nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp thủy phân rutin thành quercetin để tạo ra nguyên liệu ban đầu cho các phản ứng tổng hợp tiếp theo. Một số tác dụng dược lý của quercetin Quercetin làm giảm nguy cơ ung thư Quercetin giúp ngăn ngừa bệnh tim Là chất chống oxy hóa Hoạt tính kháng viêm, kháng virus Đối với bệnh đục thủy tinh thể Quercetin và một số dẫn xuất của nó có khả năng ứng dụng trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh suy thoái xương. Đa số các nghiên cứu cho thấy không có bằng chứng nào chứng tỏ quercetin là chất có thể gây những biến đổi về mặt sinh học. Quercetin có khả năng là nguyên liệu ban đầu trong các chương trình nghiên cứu phát triển về thuốc. Ảnh hưởng tích cực của quercetin lên các tế bào ung thư đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu tổng hợp cũng như thử nghiệm các dẫn xuất của quercetin để nhằm tìm kiếm các tác nhân chống ung thư hiệu quả nhất và đã đạt được một số kết quả khả quan. Các kết quả tương tự có thể đạt được trong quá trình phát triển các tác nhân chống tích tụ các tiểu huyết cầu, kháng virus, kháng viêm…dựa trên nền tảng của quercetin. M bc`) Mục tiêu của đề tài là tổng hợp các dẫn xuất của rutin và quercetin và xác định các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn và khả năng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này để từ đó làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm đưa vào sử dụng các flavonoid và dẫn xuất của chúng cho các ngành y tế, thực phẩm. 6 d % e`fgh Nụ hoa hòe khô và vỏ quýt được mua rồi đem sàng để loại tạp đất cát, loại bỏ cành, lá… chỉ giữ lại nụ hoa và vỏ quýt đem sấy khô ở nhiệt độ 50- 60 o C, độ ẩm 8%. Sau đó đem nghiền thành bột mịn, bảo quản trong hũ thủy tinh kín đặt ở nơi mát, tránh ánh sáng và tránh hút ẩm trở lại để dùng cho quá trình nghiên cứu tiếp theo. • i,2+TIj+"##k/3P#H*/#=, - Sử dụng ba dòng tế bào ung thư người là MCF-7 (ung thư vú), HeLa (ung thư cổ tử cung), NCI-H460 (ung thư phổi) trong sàng lọc tính gây độc tế bào. - Các mẫu thử nghiệm gồm các flavonol và các dẫn xuất được tổng hợp theo phương pháp được mô tả trong đề tài. - Các hóa chất, môi trường, … đều đạt tiêu chuẩn phân tích. %% lm] Các thiết bị máy móc được áp dụng bao gồm: điểm nóng chảy, phổ hấp thu tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) bao gồm các loại phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC. %J nf %JF/#/#+W,-I,+",O#4*#.X3P,#0:N#9",[4oIX-/X,+" Chiết rutin từ nụ hoa hòe trong dung môi ethanol 80% bằng phương pháp đun hồi lưu, tiếp tục thủy phân rutin thành quercetin trong môi trường axit: 7 %J%p"D#?N/F/5q"GI=,Xj,X-/0*oIX-/X,+"$ 'r6s%%$ Tổng hợp các dẫn xuất ester của quercetin i) n-butyl isocyanat, pyridin, nhiệt độ phòng ii) thiophene-2-carboxylic chlorid, pyridin, nhiệt độ phòng iii) Benzoyl chlorid, pyridin, nhiệt độ phòng iv) 4-morpholine-carbonylchlorid, pyridin, nhiệt độ phòng v) Propionyl chlorid, pyridin, nhiệt độ phòng vi) Anhydric acetic, pyridin, nhiệt độ phòng %JJp"D#?N/F/5q"GI=,X,#X-/0*oIX-/X,+"$ 8 'r6s%J$ Tổng hợp các dẫn xuất ether của quercetin i) Dimethyl sulfat, K 2 CO 3 , aceton, đun hồi lưu ii) Benzyl bromid, K 2 CO 3 , aceton, đun hồi lưu iii) 1-brompropan, K 2 CO 3 , aceton, đun hồi lưu iv) Dimethyl sulfat, K 2 CO 3 , aceton, đun hồi lưu v) HCl 5%, đun hồi lưu %JM#>r"DN#FNGF/6R"#E#B"C"DE#F"D4G:#H* %JMA#B4jF,E#B"C"DSt,D7/,u54Sv"D,#w"D#+TL Gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do bền do có hiệu ứng liên hợp trong toàn phân tử, cho màu tím trong etanol và có độ hấp thu cực đại tại 517 nm. (màu tím) (màu vàng) Nguyên tắc: các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH. Xác định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu của dung dịch khảo sát ở bước sóng có hấp thu cực đại tại 517 nm. %JM%\F/6R"#jB"N#xL/0*oIF,-!"#NX-4G:#H*2+N+, Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipit thông qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyt (MDA) theo phương pháp của Makarova. Nguyên tắc: MDA là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipit màng tế bào. MDA có khả năng phản ứng với axit thiobarbituric (TBA) để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu 9 cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng này thực hiện trong môi trường pH = 2-3, ở nhiệt độ 90-100 o C trong vòng 15 phút. Các chất chống oxy hóa sẽ ức chế quá trình peroxy hóa lipit màng tế bào, ngăn chặn sự tạo thành MDA. Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ với hàm lượng MDA. HN N O S OH 2 + CC O H C H O H H t 0 -2H 2 O HN N O S OH H H C H CH CH N NH SO O H MDA acid thiobarbituric trimethin %JU#>r"DN#FNGF/6R"#E#B"C"DE#F"D"=LyE#F"DE#Ix" Các mẫu được thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tại phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam bằng phương pháp của Vanden Bergher và Vlietlinck trên phiến 96 giếng theo hai bước: Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính, Bước 2: tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn, Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm: - Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus. - Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum. Mẫu thô có MIC ≤ 200 µg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50 µg/ml là có hoạt tính. %JZ#w"D#+TLE#B"C"DD9:6z/,WSP4,#X4N#>r"DN#FN 'm (thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử- Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM) Sử dụng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) là một phương pháp nhuộm màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của 10 [...]... trọng lượng phân tử < 500 là tốt nhất cho một hợp chất được nghiên cứu để trở thành thuốc Các hợp chất có giá trị logP và khối lượng phân tử lớn hoặc logP 50%) ở dòng MCF-7 tiếp tục được đem thử ở các nồng độ khác... nhau để tìm giá trị IC50 của các hợp chất này I (%) là phần trăm ức chế tăng trưởng của tế bào STT 1 2 3 4 5 6 Tªn mÉu Q Q-1 Q-5 Q-6 Q-9 R-2 IC50 ± §LC (µg/ml) 39,04 ± 4,91 25,09 ± 7,82 28,56 ± 1,73 43,06 ± 2,24 77,72 ± 5,83 98,58 ± 5,53 Đồ thị 3.18: Kết quả giá trị IC50 (µg/ml) của một số flavonol và dẫn xuất 21 Nhận xét: Một trong những nguyên tắc cần thiết để một hợp chất có thể tấn công vào tế bào... với MIC là 25 µg/ml, các hợp chất R, Q-2, Q-5 kháng được 1 dòng vi sinh vật với các giá trị MIC lần lượt là 12,5; 50; 50 µg/ml, còn lại các hợp chất khác không có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1- Đã tổng hợp được 10 dẫn xuất từ rutin và quercetin, trong đó theo tìm kiếm trên công cụ Sci Finder tháng 5 năm 2008 thì có 3 hợp chất chưa có tài liệu công bố (3,3’,4’,7-tetrabutylcarbamoyloxy-5hydroxyflavone.. .một chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng. .. đòi hỏi hợp chất đó phải tương tác được với cả hai môi trường khác nhau: ưa béo (ví dụ: màng tế bào) và ưa nước (ví dụ: tế bào chất) Nhóm của GS Hansch đã đưa ra một thông số có thể giúp cho việc tính toán này đó là logP - là hệ số chỉ sự phân bố giữa 1-octanol, được xem như có tính chất gần giống với màng tế bào tự nhiên Khi một hợp chất tan trong nước nhiều hơn, logP sẽ âm, nếu tan nhiều hơn trong. .. 23,83 4 R 173,19 19 Nhận xét: Sự kết hợp của nhóm 5-OH ở vòng A với nhóm 3-OH và 4-oxo ở vòng C và sự có mặt của liên kết đôi 2,3 cho khả năng bắt gốc tự do cao nhất ở hợp chất quercetin Tuy nhiên khi nhóm 3-OH bị khóa bởi gốc đường (rutin) thì hoạt tính lại giảm, lúc này vòng A và vòng B đóng góp độc lập vào khả năng chống oxy hóa Khi thay thế toàn bộ nhóm OH của quercetin bằng nhóm OMe (Q-9) thì... sẽ có khuynh hướng làm tăng hoạt tính gây độc tế bào, và ngược lại các nhóm ether -ORlàm giảm hoạt tính gây độc tế bào ĐỀ NGHỊ 1 Cần tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thêm các dẫn xuất mới trên cơ sở những kết luận đã rút ra, đặc biệt cần chú ý đến việc thay thế nhóm 3-OH trong họ flavonoid bằng các nhóm có khả năng làm tăng hoạt tính gây độc tế bào 2 Nghiên cứu quá trình tổng hợp toàn phần các dẫn xuất. .. 3-OH kết hợp với liên kết đôi 2,3 đóng vai trò là cấu trúc cơ bản trong việc làm tăng khả năng bắt gốc tự do Việc thay nhóm OH bằng nhóm eter hoặc ester đã làm mất khả năng nhường điện tử của nhóm nên cũng đã làm mất đi khả năng bắt gốc tự do của các hợp chất Bên cạnh đó, do có liên kết H nội phân tử nên nhóm 5-OH có năng lượng liên kết lớn, khó nhường điện tử nên khả năng bắt gốc tự do của các chất Q-1, . phân rutin, một loại flavonoid có hàm lượng cao trong một số loại cây để tạo ra quercetin. Phương pháp này đặc biệt phù hợp với điều kiện của Việt Nam, là nơi trồng nhiều cây Hòe, loại cây có hàm. rutin, một hợp chất có hàm lượng cao trong cây hoa hòe ở Việt Nam, từ đó thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng nhằm có được những nghiên cứu bước đầu cho việc tổng hợp các dẫn xuất khác sau này. Bình,… với một lượng khá dồi dào có thể đáp ứng nhu cầu lớn trong sản xuất các sản phẩm dược. Trong cây hòe chứa 6-35% rutin tùy thuộc vào từng phần của cây (nụ hòe 30 - 35%, vỏ quả 0,5%, lá cây 4,4%).