Đánh giá sự biểu hiện Gen mã hóa Pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1) ở các chủng Pichia pastoris tái tổ hợp sinh Amylase và Interleukin - 2 bằng kỹ thuật Real - ti

́ ĐẠI HỌC QUÔC GIA HÀ NỘI ̀ TRƢƠNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN - THÂN VĂN MINH ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PHEROMONE LAI ALPHA (MF(ALPHA)1) Ở CÁC CHỦNG Pichia pastoris TÁI TỔ HỢP SINH AMYLASE VÀ INTERLEUKIN-2 BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội –Năm 2012 i ́ ĐẠI HỌC QUÔC GIA HÀ NỘI ̀ TRƢƠNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN - THÂN VĂN MINH ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PHEROMONE LAI ALPHA (MF(ALPHA)1) Ở CÁC CHỦNG Pichia pastoris TÁI TỔ HỢP SINH AMYLASE VÀ INTERLEUKIN-2 BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS Trƣơng Nam Hải Hà Nội – Năm 2012 ii LỜICẢM ƠN Tơixinbày tỏlịngbiếtơnsâusắctới:GS.TS.TrươngNamHải-Trƣởng phịngKỹthuậtDitruyền,ViệntrƣởngViệnCơngnghệsinhhọc,đãtậntìnhhƣớng dẫn, quan tâm và tạo điều kiện để hoàn thành luận văn này Trongthờigianhọctậpvàlàmviệc,tơiđãnhậnđƣợcsựquantâmgiúpđỡ, bảotậntìnhvềchunmơn,sựđợngviênqbáucủa TS Lê Thị Thu Hồng, TS Dương Cẩm Thúy,ThS.NguyễnHồngThanh, CN Trần Nhật Anhvàcác anh chị tạiphịngKỹthuậtDitruyền–ViệnCơngnghệsinh học,ViệnKhoa vàCơngnghệViệtNam.Nhândịphoànthànhluậnvăn này,tơixin học bàytỏlịng biếtơnsâusắccủamìnhtới sựgiúpđỡvơcùngqbáuđó Tơicũngxintrântrọngcảmơncácthầy giáo,cơgiáotrongKhoaSinhhọc- TrƣờngĐạihọcKhoa họcTựnhiên,ĐạihọcQuốcgiaHàNợi,đãtậntìnhgiảngdạy, dìudắt tơi trongthờigianhọctậptạitrƣờng Cuốicùng,tơixingửilờicảmơnđếnngƣờithântronggiađìnhvàbạnbè đợngviênvàgiúpđỡtơi trongsuốtthờigianhọctậpvànghiêncứuvừaqua Xin chânthànhcảmơn! HàNội,ngày12tháng12năm2012 Họcviên Thân Văn Minh i NHỮNG TỪVIẾTTẮT Amp Ampicillin Amy Amylase AOX Alcochol oxidase ARN RibonucleicAcid DNA DeoxyribonucleicAcid dNTPs Deoxyribonucleotidetriphosphates EDTA Ethylenediaminetetraaceticacid IL-2 Interleukin-2 kDa Kilodalton LB Luria-Bertanimedium MCS Multicloningsite PCR PolymeraseChainReaction PDB Proteindatabank PDF ProbabilityDensityFunction PMSF Phenylmethanesulfonylfluoride Real-time PCR Real-time Polymerase chain reaction SDS SodiumDodecylSulphate TAE Tris-acetate-EDTA TaqDNApolymerase DNAPolymerasecủaThermusaquaticus YNB Yeast Nitrogen Base ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Hệ thống biểu Pichia pastoris .3 1.1.1 Đặc điểm hệ biểu P pastoris 1.1.2 Những ƣu điểm hệ biểu P pastoris 1.1.3 Q trình chuyển hóa methanol P pastoris 1.1.4 Cơ chế tiết protein nấm men .8 1.1.5 Vector biểu gene ngoại lai P pastoris 10 1.2 Tổng quan α-factor và geneMF(ALPHA)1 .12 1.3 Tổng quan protein ngoại lai đề tài 15 1.3.1 Tổng quan Interleukin-2 15 1.3.2 Tổng quan α-amylase: .17 1.4 Kỹ thuật Real-time PCR 18 1.4.1 Tổng quan Real-time PCR 18 1.4.2 Phân tích kết Real-time PCR 21 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Chủng vi sinh vật và gene biến nạp .24 2.1.2 Mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR 24 2.1.3 Hóa chất, enzyme và thiết bị máy móc 24 2.1.4 Phần mềm .25 2.1.5 Các loại môi trƣờng và dung dịch 25 2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Phƣơng pháp lên men và nuôi cấy chủng P pastoris tái tổ hợp 27 2.2.2 Phƣơng pháp tách chiết và tinh mRNA từ P pastoris 27 2.2.3 Kỹ thuật PCR .29 2.2.4 Kỹ thuật Real-time PCR .30 2.2.5 Xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0 .31 iii CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Lên men chủng P pastoris tái tổhợp 33 3.2 Tách chiết và tinh RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men 36 3.2.1 Tách chiết RNA tổng số .36 3.2.2 Tinh mRNA 37 3.2.3 Đo hàm lƣợng mẫu RNA tổng số 40 3.3 Tối ƣu điều kiện cho phản ứng Real-time PCR 42 3.3.1 Tối ƣu điều kiện Real-time PCR với gene chuẩn IPP1 42 3.3.2 Tối ƣu phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 43 3.4 Kết Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1 .44 3.5 Real-time PCR biểu gene MF(ALPHA)1 46 3.5.1 Kết Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1 .47 3.5.2 Phân tích so sánh mức đợ biểu gene MF(ALPHA)1 50 3.6 So sánh kết Real-time PCR và Microarray 53 KẾT LUẬN 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 iv MỤC LỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Các chủng biểu P Pastoris Bảng 3.1: Kết đo hàm lƣợng RNA máy đo NanoDrop 41 Bảng 3.2: Giá trị chu kỳ ngƣỡng Real-time PCR kiểm tra biểu gene nội chuẩn IPP1 chủng P pastoris nghiên cứu thời điểm khác trình lên men 46 Bảng 3.3: Giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình Real-time PCR gene MF(ALPHA)1 chủng P pastoris thời điểm lên men 50 Bảng 3.4: Tỷ lệ khác biệt gene MF(ALPHA)1 theo thời gian một chủng P pastoris control theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình 52 Bảng 3.5: Tỷ lệ khác biệt gene MF(ALPHA)1 theo thời gian mợt chủng P pastoris mang gene mã hóa cho amylase theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình 52 Bảng 3.6: Tỷ lệ khác biệt gene MF(ALPHA)1 theo thời gian một chủng P pastoris mang gene mã hóa cho interleukin-2 theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình 52 v MỤC LỤC HÌNH VẼ Hình 1.1: Hình thái nấm men P pastoris Hình 1.2: Con đƣờng chuyển hóa methanol nấm men P Pastoris Hình 1.3: Sơ đồ khái quát trình phân khu protein sinh vật nhân chuẩn Hình 1.4: Bản đồ vector biểu pPIC9 11 Hình 1.5 Cơ chế trao đổi chéo vị trí his4 12 Hình 1.6: Thiết kế tạo chủng nấm men P pastoris tái tổ hợp 14 Hình 1.7 : Cấu trúc không gian IL-2 16 Hình 1.8: Sơ đồ tiến hành phản ứng Realtime-PCR 20 Hình 1.9: Biểu đồ mợt đƣờng biểu diễn khuếch đại ghi nhận cƣờng độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận đƣợc ánh sánh kích thích vào chu kỳ nhiệt 22 Hình 1.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy cho phép xác định Tm nhờ đỉnh biểu đồ chảy ống phản ứng 23 Hình 3.1: Các chủng P pastoris tái tổ hợp nuôi cấy môi trƣờng MD đặc 33 Hình 3.2: Biểu đồ sinh trƣởng chủng P Pastoris theo thời gian 34 Hình 3.3: Kết điện di kiểm tra protein ngoại lai đƣợc biểu chủng P Pastoris mang gene ngoại lai thời điểm lấy mẫu khác 35 Hình 3.4: Kết điện di RNA tổng số thời điểm lần lên men thứ 37 Hình 3.5 Điện di mẫu RNA tổng số trƣớc và sau xử lý loại DNA 38 Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA 39 Hình 3.7: Kết Real-time PCR với gene chuẩn IPP1 42 Hình 3.8 Kết sản phẩm Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 sử dụng loại mồi ngƣợc và nhiệt độ gắn mồi 58°C và 59°C 43 Hình 3.9: Biểu đồ khuếch đại gene IPP1 mẫu Real-time PCR 45 vi Hình 3.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy sản phẩm khuếch đại gene IPP1 Realtime PCR 45 Hình 3.11: Biểu đồ khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1 mẫu nghiên cứu real time PCR 48 Hình 3.12: Biểu đồ đỉnh chảy sản phẩm khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1 mẫu nghiên cứu real time PCR 49 Hình 3.13: Kết điện di sản phẩm phản ứng Real-time PCR với đoạn gene MF(ALPHA)1 mẫu phản ứng 49 Hình 3.14: Biểu đồ so sánh mức độ biểu đoạn geneMF(ALPHA)1 chủng P Pastoris tái tổ hợp 53 Hình 3.15: Kết phân tích microarray biểu phiên mã đoạn gene MF(ALPHA)1 54 vii MỞ ĐẦU Protein tái tổ hợp ngày càng đƣợc ứng dụng rộng rãi lĩnh vực sản xuất và nghiên cứu khoa học…Việc nghiên cứu phát triển loại protein hay tìm cách nâng cao xuất biểu một hệ thống vật chủ từ lâu đƣợc quan tâm nghiên cứu Một sản phẩm protein tái tổ hợp phụ thuộc nhiều vào việc chọn vật chủ biểu hiện, chƣa có mợt loại vật chủ phù hợp cho biểu loại protein nên trƣớc bắt đầu sản xuất mức độ công nghiệp phải lựa chọn một hệ thống biểu phù hợp Có nhiều hệ thống biểu đƣợc thƣơng mại hóa để biểu protein tái tổ hợp nhƣ sử dụng sinh vật nhân sơ nhƣ E.coli, Bacillus… hay sinh vật nhân chuẩn nhƣ Nấm men Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris … hay tế bào bậc cao nhƣ tế bào côn trùng hay tế bào động vật [3] Nấm men P pastoris đƣợc sử dụng phổ biến nghiên cứu biểu gen ngoại lai, đến có 200 loại protein đƣợc biểu P pastoris Với chủng nấm men này, nhiều protein ngoại lai đƣợc tạo với hàm lƣợng lớn đạt 10g/l, nhiên một số protein lại đƣợc biểu mức độ thấp (dƣới mg/l), không xác định đƣợc Để nâng cao khả biểu protein, một số phƣơng pháp đƣợc sử dụng nhƣ: thay mã bộ ba cho phù hợp, biểu đồng thời với chaperone với protein khác, gây đột biến một số gen chủng biểu tối ƣu điều kiện nuôi cấy … Tuy nhiên tất trƣờng hợp thành công hiểu biết di truyền phân tử và trình lý hóa chủng nấm men này cịn hạn chế Những kết phân tích so sánh hệ transcriptome chủng P pastoris đối chứng, chủng sinh tổng hợp interleukin-2, chủng sinh tổng hợp amylase sử dụng YEAST_2 array, bao gồ m khoảng 12.000 bô ̣ mẫu dò đă ̣c hiê ̣u cho các gen ̣ genome của S cerevisiae và Schizosaccharomyces pombe cho thấy có gene có khác biệt biểu gen chủng nghiên cứu có gene mã hóa pheromone lai alpha (MF(ALPHA)1 [15] Hình 3.9: Biểu đồ khuếch đại gene IPP1 mẫu Real-time PCR; - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, - Mẫu phản ứng chủng Amylase 0, 24 và 48h; 7, 10, 11 - Mẫu phản ứng chủng Control 0, 24 và 48h Hình 3.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy sản phẩm khuếch đại gene IPP1 Real-time PCR; - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, - Mẫu phản ứng chủng Amylase 0, 24 và 48h; 7, 10, 11 - Mẫu phản ứng chủng Control 0, 24 và 48h; 12, 15, 16 - Mẫu phản ứng chủng IL-2 0, 24 và 48h 45 Bảng 3.2: Giá trị chu kỳ ngƣỡng Real-time PCR kiểm tra biểu gene nội chuẩn IPP1 chủng P pastoris nghiên cứu thời điểm khác trình lên men Mẫu Control Amy IL-2 0h 24 h 48 h 0h 24 h 48 h 0h 24 h 48 h Chu kỳ ngƣỡng (Ct) Lên men lần I Lên men lần II 16.35 16.51 18.47 18.67 20.21 19.79 15.96 16.55 18.64 18.51 20.43 19.65 14.91 16.51 18.79 18.91 19.26 20.09 Thí nghiệm đƣợc lặp lại lần với mẫu RNA đƣợc tách chiết từ lần lên men khác Kết cho thấy biểu gene nội chuẩn thực tế không đƣợc nhƣ mong muốn (Bảng 3.2) Cụ thể là, so với thời điểm giờ, chủng control và chủng Amy, biểu gene IPP1 giảm khoảng lần thời điểm 24 và khoảng 10 lần thời điểm 48 Bên cạnh đó, chủng IL-2 biểu phiên mã gene IPP1 giảm 10 lần thời điểm 24 và 48 so sánh với thời điểm Do biểu gene IPP1 có thay đổi theo thời gian, thực chất gene này không phù hợp với tiêu chuẩn gene nợi chuẩn Khi khơng tìm đƣợc gene nợi chuẩn thích hợp, một số nhà nghiên cứu tiến hành Real-time PCR mà không dùng gene nội chuẩn [29] Từ thực tế thí nghiệm, chúng tơi định tiến hành thí nghiệm Real-time PCR định lƣợng tƣơng đối biểu đoạn gene MF(ALPHA)1 không dùng gene nội chuẩn Thay vào đó, chúng tơi cố gắng chuẩn hóa điều kiện thí nghiệm để loại bỏ sai số hệ thống 3.5 Real-time PCR biểu gene MF(ALPHA)1 Do khơng tìm đƣợc gen nợi chuẩn để so sánh biểu gen chủng P pastoris tái tổ hợp, nên việc tiến hành phản ứng Real-time PCR với gen 46 MF(ALPHA)1 đƣợc tiến hành chạy Real-time PCR lần với mẫu RNA chủng control, amy, Il-2 và đối chứng 3.5.1 Kết Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1 Giá trị chu kỳ ngƣỡng phụ tḥc lớn vào nồng đợ DNA đích và đƣờng nên huỳnh quang Những khác biệt ảnh hƣởng tới đƣờng cong khuếch đại và đƣợc ghi lại Dựa vào biểu đồ ta thấy chủng mang gene ngoại lai interleukin-2 và amylase, có đƣờng cong khuếch đại vào pha log sớm từ chu kỳ thứ 12 đến chu kỳ thứ 15 với mẫu A-0h, A-6h, A-12h, A-24h, A-48h, A-72h, A-96h và I-0h, I-6h, I-12h, I-24h, I-48h, I-72h, I-96h, với cƣờng độ huỳnh quanh nhận giá trị cao gần 5,6 Riêng với mẫu A3-0h và I3-0h pha log chậm chu kỳ 18 phản ứng, điều này đƣợc gải thích là thời điểm 0h gene ngoại lai đƣợc cảm ứng nên số lƣơng phân tử RNA đƣợc tạo Ở chủng đối chứng và chủng control vào pha log chậm sau chu kỳ thứ 25, cƣờng độ huỳnh quang thu nhận đƣợc đạt khoảng thấp chủng khác Biểu đồ (Hình 3.11) cho thấy khác biệt rõ ràng hai nhóm chủng mang gene ngoại lai và chủng không mang gene ngoại lại và cho thấy phụ tḥc tuyến tính mức độ biểu gene MF(ALPHA)1 với mức độ biểu gene ngoại lai (il-2 và amy) Kết phản ánh với đánh giá biểu protein phần 3.1 chƣơng này Kết điện di protein cho thấy thời điểm 0h chƣa có protein ngoại lai đƣợc tạo Nhƣng phân tích Real-time PCR nhận thấy rõ chủng A-0h và I-0h có đƣờng khuếch đại vào pha log sớm hẳn (ở chu kỳ thứ 20,55 và 19,84) so với chủng đối chứng và control (khoảng chu kỳ 25,85 -26,07) Điều này chứng tỏ thời điểm 0h tế bào nấm men đáp ứng cảm ứng methanol để tạo phân tử mRNA nhiều chủng không mang gene ngoại lai Điều này chứng tỏ gene ngoại lai có ảnh hƣởng mạnh tới biểu gene promoter AOX1, qua chứng tỏ 47 khả hoạt động mạnh promoter AOX1 Tuy nhiên thời điểm này chƣa biểu thành protein nên kỹ thuật phân tích protein khơng thể phát đƣợc Hình 3.11: Biểu đồ khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1 mẫu nghiên cứu real time PCR;1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, - Mẫu phản ứng chủng Amylase 0, 24 và 48h; 9, 12, 13 - Mẫu phản ứng chủng Control 0, 24 và 48h; 16, 19, 20 - Mẫu phản ứng chủng IL-2 0, 24 và 48h Biểu đồ đỉnh nóng chảy (Hình 3.12) cho thấy mẫu đối chứng âm và mẫu phản ứng chủng control tất thời điểm có chung mợt điểm nóng chảy khoảng 74°C, là đỉnh nóng chảy sản phẩm primer dimers khơng có RNA Ngƣợc lại, mẫu chủng P Pastoris mang geneAmy và gene IL-2 cho thấy mợt đỉnh nóng chảy khoảng 80°C, là đỉnh nóng chảy sản phẩm khuếch đại Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1 48 Hình 3.12: Biểu đồ đỉnh chảy sản phẩm khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1 mẫu nghiên cứu real time PCR; - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, Mẫu phản ứng chủng Amylase 0, 24 và 48h; 9, 12, 13 - Mẫu phản ứng chủng Control 0, 24 và 48h; 16, 19, 20 - Mẫu phản ứng chủng IL-2 0, 24 và 48h Cuối tiến hành kiểm tra sản phẩm phẩn ứng Real-time PCR cách điện di gel agarose 1% (hình 3.13) Hình 3.13: Kết điện di sản phẩm phản ứng Real-time PCR với đoạn geneMF(ALPHA)1 mẫu phản ứng 49 Kết ảnh điện di sản phẩm Real-time PCR gel agarose 1% cho thấy geneMF(ALPHA)1 đƣợc nhân lên chủng P Pastoris mang gene Amy và Il-2 và Kết này phù hợp với kết phân tích đỉnh nóng chảy bên Điều này một lần khẳng định tính xác kỹ thuật Real-time PCR 3.5.2 Phân tích so sánh mức độ biểu geneMF(ALPHA)1 Giái trị Ct phản ánh số lƣợng DNA đích ban đầu mẫu so sánh đƣợc số lƣợng DNA đích mẫu với Để đảm bảo tính xác thí nghiệm chúng tơi tiến hành phản ứng Real-time PCR ba lần và lấy giá trị trung bình (bảng 3.3) Bảng 3.3: Giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình Real-time PCR geneMF(ALPHA)1 chủng P pastoris thời điểm lên men Thời điểm thu mẫu 0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 3.5.2.1 Giá trị Ct trung bình Control Amy IL-2 25,60 ± 1,41 20,70 ± 0,26 20,02 ± 0,23 26,77 ± 0,90 14,75 ± 0,48 16,26 ± 1,19 26,56 ± 0,98 15,22 ± 0,47 15,61 ± 0,77 26,40 ± 0,59 15,96 ± 0,78 16,84 ± 0,83 26,52 ± 0,89 16,45 ± 0,31 17,01 ± 0,72 26,51 ± 0,90 16,65 ± 0,35 17,19 ± 0,53 26,72 ± 1,00 17,16 ± 0,35 17,64 ± 0,65 So sánh mức độ biểu gene theo thời gian lên men chủng Phản ứng khuếch đại Real-time PCR diễn theo cấp số nhân, mẫu có chu kỳ ngƣỡng chênh đơn vị tƣơng đƣơng với khác biệt khoảng lần hàm lƣợng RNA gene đích Trong thí nghiệm chúng tơi, việc so sánh lƣợng RNA mẫu thí nghiệm đƣợc tiến hành phƣơng pháp định lƣợng tƣơng đối dựa đơn vị khối lƣợng Tỷ lệ lƣợng RNA mẫu thử và mẫu đối chứng đƣợc tính theo cơng thức: Tỷ lệ mẫu thử/đối chứng = 2Ct(C)-Ct(T) Trong đó, 50 Ct(C) là chu kỳ ngƣỡng mẫu đối chứng, và Ct(T) là chu kỳ ngƣỡng mẫu thí nghiệm Đoạn geneMF(ALPHA)1 và gene tái tổ hợp (Amy/IL-2) chịu điều hịa AOX1 promoter Do mRNA tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 gắn liền với mRNA gene ngoại lai, khác biệt tín hiệu tiết coi nhƣ là phản ánh khác biệt mức độ biểu protein ngoại lai chủng khác Qua bảng 3.5trên ta thấy chủng nấm men P pastoris biểu amylase, tín hiệu tiết α đƣợc biểu thời điểm giờ, sau tăng lên cao (tới 61,8 lần) giảm dần theo thời gian Tƣơng tự, bảng 3.3 ta thấy chủng nấm men P pastoris biểu Interleukin-2, geneMF(ALPHA)1 đƣợc biểu thời điểm giờ.So với chủng Amy, lƣợng mRNA đoạn geneMF(ALPHA)1 chủng IL-2 cao khoảng 13,55 lần giờ; và tiếp tục tăng mạnh tới 21,36 thời điểm 24 Đồng thời, phân tích Real-time PCR cho thấy lƣợng mRNA tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 IL-2 và Amy là khác Những khác kể là chứng cho thấy có khác đáng kể thời gian và mức độ biểu hai geneAmy và geneIL-2 đƣợc biểu P pastoris Sự khác này có nhiều nguyên nhân: tƣơng tác gene biểu và MF(ALPHA)1, khác hiệu biểu gene chịu điều hòa promoter AOX1, kích thƣớc khác hai gene, vai trò khác hai gene thân tế bào P pastoris biểu hiện… 51 Bảng 3.4: Tỷ lệ khác biệt gene MF(ALPHA)1 theo thời gian chủng P pastoris control theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình So sánh 0h 0,30 0,34 0,38 0,35 0,36 0,31 6h 12h 24h 48h 72h 96h 6h 1,16 1,29 1,19 1,20 1,04 Control 12h 24h 1,11 1,03 0,92 1,04 0,93 0,90 0,80 48h 1,01 0,87 72h 0,86 Bảng 3.5: Tỷ lệ khác biệt gene MF(ALPHA)1 theo thời gian chủng P pastoris mang gene mã hóa cho amylase theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình Thời gian thu mẫu 6h 12h 24h 48h 72h 96h 0h 61,82 44,74 26,78 19,03 16,60 11,67 6h 0,72 0,43 0,31 0,27 0,19 Amy 12h 24h 0,60 0,43 0,71 0,37 0,62 0,26 0,44 48h 0,87 0,61 72h 1,42 Bảng 3.6: Tỷ lệ khác biệt geneMF(ALPHA)1 theo thời gian chủng P pastoris mang gene mã hóa cho interleukin-2 theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình Thời gian thu mẫu 6h 12h 24h 48h 72h 96h 0h 13,55 21,26 9,04 8,07 7,11 5,21 6h 1,57 0,67 0,60 0,52 0,38 IL-2 12h 24h 0,43 0,38 0,89 0,33 0,79 0,24 0,58 48h 0,88 0,64 72h 0,73 52 3.5.2.2 So sánh mức độ biểu geneMF(ALPHA)1 theo thông số chủng Tƣơng tự nhƣcách so sánh chủng, so sánh mức độ biểu geneMF(ALPHA)1 chủng với Kết qủa đƣợc thể (Hình 3.14).Ở thời điểm giờ, lƣợng mRNA geneMF(ALPHA)1 chủng P Pastoris mang gen ngoại lai Amy và IL-2 có tỷ lệ khác biệt là và 1,6 tƣơng ứng, tiếp đến thời điểm giá trị này chủng Amy tăng cao 61,8 đạt giá trị cao và sau giảm dần thời điểm lấy mẫu tiếp theo, đó, chủng sinh IL-2 thời điểm đạt 21,7 và cao thời điểm 12 nhƣng đạt 34,1 giảm dần thời điểm sau Hình 3.14: Biểu đồ so sánh mức độ biểu đoạn geneMF(ALPHA)1giữa chủng P Pastoris tái tổ hợp; A- Chủng P Pastoris mang gene mã hóa amylase; C- chủng P Pastoris control; I- chủng P Pastoris mang gene mã hóa interleukin-2 3.6 So sánh kết Real-time PCR Microarray Khi phân tích biểu tất gene đƣợc tạm đánh giá kỹ thuật microarray, để phát thay đổi mẫu và lựa chọn gene thay đổi Nhƣng biểu gene đƣợc lựa chọn đƣợc đo với đợ xác cao Real-time PCR Phân tích Real-time PCR cho kết tƣơng đồng xu hƣớng biểu đoạn geneMF(ALPHA)1 chủng nghiên cứu Cụ thể là biểu chủng control thời điểm thấp so với chủng Amy và IL-2 53 Bên cạnh đó, lƣợng mRNA MF(ALPHA)1 chủng Amy và IL-2 thấp thời điểm giờ, cao vƣợt trội thời điểm 24 sau có giảm xuống mợt chút thời điểm 48 Điều này phà hợp vơi kết phân tích so sánh hệ transcriptome nghiên cứu Dƣơng Cẩm Thúy và cộng sựở chủng P pastoris đối chứng, chủng sinh tổng hợp IL-2, chủng sinh tổng hợp amylase sử dụng YEAST_2 array ̣ geneome của S cerevisiae và Schizosaccharomyces pombe Khi gene MF(ALPHA)1 có sựmicroarray so sánhbiểu gene chủng [15] Kết khác biệt lượng mRNA đoạn gen MF(ALPHA)1 16000 15118 14453 Tín hiệu lai flourescent 13585 13419 14000 12000 10000 0h 8000 24 h 6000 48 h 4000 2000 1187 76 99 1472 84 Control Amy IL-2 Các chủng nghiên cứu Hình3.15: Kết phân tích microarray biểu phiên mã đoạn geneMF(ALPHA)1[15] So với phân tích microarray, kết phân tích real-time PCR cho thấy mợt số khác biệt Theo phân tích microarray, lƣợng mRNA đoạn geneMF(ALPHA)1 chủng đối chứng dù thấp nhiều so với chủng mang gene ngoại lai Amy và IL-2 nhƣng đƣợc nhận biết Trong đó, theo phân tích real-time PCR, mRNA đoạn geneMF(ALPHA)1 không đƣợc xác định chủng đối chứng Kết phân tích mRNA geneMF(ALPHA)1có khác biệt theo yếu tố chủng và yếu tố thời gian Ở một thời điểm nghiên cứu, kết microarray cho thấy lƣợng mRNA đoạn geneMF(ALPHA)1 hai chủng Amy và IL-2 giống (hình 3.15), cịn phân tích real-time PCR cho thấy lƣợng mRNA đoạn geneMF(ALPHA)1 chủng IL-2 thấp chủng Amy (Hình 3.14) 54 KẾT LUẬN Với kết thu nhận đƣợc trình thực đề tài rút một số kết luận sau: Đã tách chiết thành công mẫu RNA tổng sốphục vụ cho tiến hành thí nghiệm Real-time PCR Các mẫu đạt chất lƣợng nồng độ và độ tinh cao, đảm bảo yêu cầu Đã tối ƣu hóa thành cơng điều kiện phản ứng Real-time PCRvà thiết lập thành cơng chƣơng trình chạy Real-time PCR sử dụng SYBR GREEN I, hệ máy LightCycler 2.0cho hai là gene IPP1 và gene đích MF(ALPHA)1 Đã phân tích định lƣợng tƣơng đối biểu phiên mã tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 chủng tái tổ hợp sinh amylase và interleukin-2 phần mềm LightCycler 4.0 Roche Kết phân tích Real-time PCR đãcho thấymức độ biểu geneMF(ALPHA)1ở chủng P pastoris mang gene Amy/IL-2 cao nhiều lần so với chủng đối chứng không mang gene ngoại lai KIẾN NGHỊ Nghiên cứu mức độ biểu cấp độ protein chủng P Pastoristái tổ hợp sinh amylase và interleukin-2 thời điểm khác nuôi cấy kĩ thuật ELISA 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo tiếng Việt: Nguyên Văn Hùng (2010), PCR Real-time PCR vấn đề áp dụng thường gặp, NXB Y học Võ Thị Thƣơng Lan (2009), Sinh học phân tử tế bào ứng dụng, NXB Giáo dục, Hà Nội Tài liệu tham khảo tiếng Anh: Dorak MT (2006), Real-time PCR, Taylor & Francis, New York Higgins DR, Cregg JM (1998), Pichia protocols, Humana Press, Totowa, N.J Bengtsson M, Karlsson HJ, Westman G, Kubista M (2003), "A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR".Nucleic Acids Res, 31 (8), p 21-45 Bustin SA (2000), "Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays".J Mol Endocrinol, 25 (2), p 169-193 Bustin SA (2002), "Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems".J Mol Endocrinol, 29 (1), p 23-39 Caplan S, Kurjan J (1991), "Role of alpha-factor and the MF alpha alphafactor precursor in mating in yeast".Genetics, 127 (2), p 299-307 Catala C, Rose JK, York WS, Albersheim P, Darvill AG, Bennett AB (2001), "Characterization of a tomato xyloglucan endotransglycosylase gene that is down-regulated by auxin in etiolated hypocotyls".Plant Physiol, 127 (3), p 1180-1192 10 Cereghino JL, Cregg JM (2000), "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris".FEMS Microbiol Rev, 24 (1), p 45-66 56 11 Cha HJ, Dalal NN, Bentley WE (2005), "Secretion of human interleukin-2 fused with green fluorescent protein in recombinant Pichia pastoris".Appl Biochem Biotechnol, 126 (1), p 1-11 12 Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (2000), "Recombinant protein expression in Pichia pastoris".Mol Biotechnol, 16 (1), p 23-52 13 Daly R, Hearn MT (2005), "Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production".J Mol Recognit, 18 (2), p 119-138 14 Du J, Yang H, Zhang D, Wang J, Guo H, Peng B, Guo Y, Ding J (2010), "Structural basis for the blockage of IL-2 signaling by therapeutic antibody basiliximab".J Immunol, 184 (3), p 1361-1368 15 Duong CT, Le TTH, Nguyen TN, Nguyen HT, Le TLA, Truong NH (2011), "Microarray-Based Transcriptome Analysis of Recombinant Pichia Pastoris Strains Overexpressing Alpha-Amylase and Interleukin-2".International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), (1), p 16 Fuller RS, Sterne RE, Thorner J (1988), "Enzymes required for yeast prohormone processing".Annu Rev Physiol, 50 p 345-362 17 Ginzinger DG (2002), "Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream".Exp Hematol, 30 (6), p 503-512 18 Han MJ, Jeong KJ, Yoo JS, Lee SY (2003), "Engineering Escherichia coli for increased productivity of serine-rich proteins based on proteome profiling".Appl Environ Microbiol, 69 (10), p 5772-5781 19 Jahic M, Veide A, Charoenrat T, Teeri T, Enfors SO (2006), "Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris".Biotechnol Prog, 22 (6), p 1465-1473 20 Jelicks LA, Naider FR, Shenbagamurthi P, Becker JM, Broido MS (1988), "A type II beta-turn in a flexible peptide: proton assignment and conformational analysis of the alpha-factor from Saccharomyces cerevisiae in solution".Biopolymers, 27 (3), p 431-449 21 Klein D (2002), "Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations".Trends Mol Med, (6), p 257-260 57 22 Kurjan J (1985), "Alpha-factor structural gene mutations in Saccharomyces cerevisiae: effects on alpha-factor production and mating".Mol Cell Biol, (4), p 787-796 23 Kurjan J, Lipke PN (1986), "Agglutination and mating activity of the MF alpha 2-encoded alpha-factor analog in Saccharomyces cerevisiae".J Bacteriol, 168 (3), p 1472-1475 24 Li P, Anumanthan A, Gao XG, Ilangovan K, Suzara VV, Duzgunes N, Renugopalakrishnan V (2007), "Expression of recombinant proteins in Pichia pastoris".Appl Biochem Biotechnol, 142 (2), p 105-124 25 Liss B, Roeper J (2004), "Correlating function and gene expression of individual basal ganglia neurons".Trends Neurosci, 27 (8), p 475-481 26 Manfredi JP, Klein C, Herrero JJ, Byrd DR, Trueheart J, Wiesler WT, Fowlkes DM, Broach JR (1996), "Yeast alpha mating factor structureactivity relationship derived from genetically selected peptide agonists and antagonists of Ste2p".Mol Cell Biol, 16 (9), p 4700-4709 27 Michaelis S, Herskowitz I (1988), "The a-factor pheromone of Saccharomyces cerevisiae is essential for mating".Mol Cell Biol, (3), p 1309-1318 28 Murasugi A, Tohma-Aiba Y (2003), "Production of native recombinant human midkine in the yeast, Pichia pastoris".Protein Expr Purif, 27 (2), p 244-252 29 Nevoigt E, Kohnke J, Fischer CR, Alper H, Stahl U, Stephanopoulos G (2006), "Engineering of promoter replacement cassettes for fine-tuning of gene expression in Saccharomyces cerevisiae".Appl Environ Microbiol, 72 (8), p 5266-5273 30 Peters IR, Helps CR, Hall EJ, Day MJ (2004), "Real-time RT-PCR: considerations for efficient and sensitive assay design".J Immunol Methods, 286 (1-2), p 203-217 31 Pfaffl MW (2001), "A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR".Nucleic Acids Res, 29 (9), p 113-45 32 Radonic A, Thulke S, Mackay IM, Landt O, Siegert W, Nitsche A (2004), "Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR".Biochem Biophys Res Commun, 313 (4), p 856-862 58 33 Svanvik N, Stahlberg A, Sehlstedt U, Sjoback R, Kubista M (2000), "Detection of PCR products in real time using light-up probes".Anal Biochem, 287 (1), p 179-182 34 Trimble RB, Atkinson PH, Tschopp JF, Townsend RR, Maley F (1991), "Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris".J Biol Chem, 266 (34), p 22807-22817 35 Walker NJ (2002), "Tech.Sight A technique whose time has come".Science, 296 (5567), p 557-559 36 Wittwer CT, Herrmann MG, Moss AA, Rasmussen RP (1997), "Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification".Biotechniques, 22 (1), p 130-131, 134-138 37 Wright A, Morrison SL (1997), "Effect of glycosylation on antibody function: implications for genetic engineering".Trends Biotechnol, 15 (1), p 26-32 38 Zipper H, Brunner H, Bernhagen J, Vitzthum F (2004), "Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications".Nucleic Acids Res, 32 (12), p 133-103 39 Kurjan J, Herskowitz I (1982), Structure of a yeast pheromone gene (MF alpha): a putative alpha-factor precursor contains four tandem copies of mature alpha-factor 41 http://www.eolss.net/Sample-Chapters/C17/E6-58-04-09.pdf 42 http://www.invitrogen.com 43 http://www.sciencemag.org 44 http://www.yeastgenome.org 59 ... I -2 4 h I-48h I-72h I-96h Lần lên men ng/µL A260 /28 0 471, 12 2,17 619,37 2, 24 324 ,97 2, 20 585,05 2, 23 6 72, 98 2, 21 521 , 02 2,19 7 42, 32 2 ,20 399,88 2, 18 470,05 2, 15 356,63 2, 19 566 ,20 2, 22 587,18 2, 22. .. - THÂN VĂN MINH ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PHEROMONE LAI ALPHA (MF (ALPHA) 1) Ở CÁC CHỦNG Pichia pastoris TÁI TỔ HỢP SINH AMYLASE VÀ INTERLEUKIN- 2 BẰNG KỸ THUẬT REAL- TIME PCR Chuyên... 656,81 2, 19 Lần lên men ng/µL A260 /28 0 391, 02 2 ,20 385,47 2, 20 326 ,78 2, 22 507, 42 2 ,23 617,99 2, 22 598,58 2, 21 466,49 2, 19 457,88 2, 15 408,68 2, 18 559,64 2, 21 470, 52 2,15 730, 92 2 ,22 408, 52 2 ,21