Khi tách RNA luôn có lẫn một lƣợng DNA nhất định ở trong mẫu nên phải loại bỏ lƣợng DNA này, vì để kết quả phân tích Real-time PCR đòi hỏi mẫu RNA tách chiết có độ tinh sạch cao và đặc biệt không bị lẫn DNA [30], nếu mẫu RNA còn lẫn DNA sẽ ảnh hƣởng trực tiếp tới kết quả thì nghiệm do DNA đó sẽ đƣợc nhân lên, nên việc loại bỏ DNA là yêu cầu bắt buộc.
Mẫu đƣợc xử lý bằng enzyme DNaseI ở 37°C trong 30 phút để enzyme hoạt động loại bỏ toàn bộ DNA còn lại trong mẫu. Tiếp đó là bất hoạt enzyme bằng
38 EDTA 25mM và cho mẫu qua cột để thu sản phẩm RNA có độ tinh sạch cao và không lẫn DNA.
Để kiểm tra và đánh giá đƣợc chúng tôi dùng các phƣơng pháp sau: - PCR với mẫu RNA tổng số với cặp mồi đặc trƣng cho gene il-2.
- Điện di so sánh kết quả trƣớc và sau khi loại DNA bằng enzyme DNaseI. - Thực hiện Real-time PCR với mẫu RNA để kiểm tra chất lƣợng của RNA có đảm bảo hay không.
a. Điện di kiểm tra mẫu RNA tổng số trước và sau khi xử lý loại DNA bằng enzyme DNaseI.
Mẫu RNA tổng số trƣớc và sau khi xử lý loại DNA đƣợc lấy từ tủ -80°C để tan từ từ trên đá và tiến hành điện di trên gel agarose 1,5%.
Qua ảnh điện di chúng ta thấy trên băng chạy số 1 là mẫu RNA chƣa đƣợc xử lý bằng enzyme DNaseI nên có nhiều dải băng chứng tỏ mẫu chƣa xử lý vẫn còn có nhiều DNA trong quá trình tách chiết. Ở băng chạy điện di thứ 2 là mẫu RNA tổng số đã đƣợc xử lý bằng enzyme DNaseI cho thấy, mẫu sản phẩm RNA tổng số sau
Hình 3.5. Điện di mẫu RNA tổng số trƣớc và sau khi xử lý loại DNA;1 - RNA
39 khi xử lý loại DNA và làm sạch qua cột RNeasy-mini của QiaGene có độ sạch cao hơn và vạch băng sáng rõ nét hơn.
b. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của DNA trong mẫu RNA tách chiết.
Khi mẫu RNA đã đƣợc xử lý bằng enzyme DNaseI thì các DNA lẫn sẽ bị phân giải hết, để khẳng định đƣợc điều này và đồng thời thử đánh giá sảm phẩm tách, chúng tôi tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu của gene il-2 để chứng minh mẫu có DNA hay không và chạy Real-time PCR để kiểm tra mRNA trong mẫu.
Kết quả thí nghiệm này sẽ cho chúng ta đánh giá đƣợc chất lƣợng của mẫu RNA về cả phƣơng diện mẫu có lẫn DNA hay không và mẫu có đủ tiêu chuẩn thực hiện phản ứng Real-time PCR hay không.
Mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris mang gene il-2 đƣợc tách chiết ở thời điểm 24 giờ đƣợc xử lý loại DNA, cho tiến hành phản ứng PCR và Real-time PCR, điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Chúng tôi tiến hành thí nhiệm với 7 mẫu nhƣ hình 3.6
Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA;1 - Sản
phẩm Real-time PCR mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris mang gene il-2; M: Marker DNA 1kb; 2,3 - Sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris
mang gene il-2 thời điểm 24h, 72h; 4, 5 - Sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris mang gene Amy thời điểm 24h, 72h; 6 - Sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris control; 7 – Đối chứng âm.
40 Kết quả điện di cho thấy trên đƣờng chạy 1 là sản phẩm Real-time PCR với mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA cho sản phẩm là 1 băng sáng rõ nét. Điều này chứng tỏ chất lƣợng RNA tổng số chúng tôi thu đƣợc đảm bảo chất lƣợng cho chạy Real-time PCR. Còn trên đƣờng chạy số 2, 3 là sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA ở các chủng P. pastoris mang gene il-2. Trên đƣờng chạy 4,5 là sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA ở các chủng P. pastoris
mang gene mã hóa cho amylase. Các băng điện di không xuất hiện chứng tỏ không còn DNA trong mẫu RNA tổng số. Trên đƣờng chạy số 6 là chạy PCR với mẫu RNA tổng số của chủng control. Trên đƣờng chạy điện di số 7 là chạy Real-time PCR với mẫu con đối chứng âm không mang gene ngoại lai nên không có băng nào. Nhƣ vậy, mẫu RNA tổng số có độ tinh sạch cao và không bị lẫn DNA đủ điều kiện để tiến hành cho phản ứng Real-time PCR sau này.
3.2.3. Đo hàm lƣợng các mẫu RNA tổng số
Sản phẩm RNA tổng số để làm phản ứng Real-time PCR khi tách chiết là phải thu đƣợc lƣợng RNA vừa đủ với độ tinh khiết cao. Do đó sau khi đã tối ƣu đƣợc điều kiện tách chiết mẫu RNA tổng số và kiểm tra bằng điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Chúng tôi hành kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch thông qua hệ thống Thermo Scientific NanoDrop 2000.
Các phân tử nucleic acid (DNA và RNA) hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm, thông thƣờng các sản phẩm tách chiết RNA hay DNA sẽ có lẫn một lƣợng protein nhất định, nên khi đánh giá mức độ sạch và hàm lƣợng RNA trong mẫu tách chiết chúng ta dựa vào chỉ số A260/ A280. Một sản phẩm RNA hay DNA đƣợc coi là tinh kiết nếu chỉ số A260/ A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0.
41
Bảng 3.1: Kết quả đo hàm lƣợng RNA bằng máy đo NanoDrop Mẫu Lần lên men 1 Lần lên men 2 Lần lên men 3
ng/µL A260/280 ng/µL A260/280 ng/µL A260/280 A-0h 471,12 2,17 913,80 2,21 391,02 2,20 A-6h 619,37 2,24 620,53 2,21 385,47 2,20 A-12h 324,97 2,20 614,46 2,21 326,78 2,22 A-24 585,05 2,23 142,87 2,20 507,42 2,23 A-48h 672,98 2,21 449,67 2,18 617,99 2,22 A-72h 521,02 2,19 1130,69 2,19 598,58 2,21 A-96h 742,32 2,20 631,76 2,20 466,49 2,19 C-0h 399,88 2,18 802,78 2,21 457,88 2,15 C-6h 470,05 2,15 730,30 2,19 408,68 2,18 C-12h 356,63 2,19 600,96 2,20 559,64 2,21 C-24h 566,20 2,22 35,59 2,30 470,52 2,15 C-48h 587,18 2,22 672,00 2,18 730,92 2,22 C-72h 593,21 2,19 982,23 2,20 408,52 2,21 C-96h 706,83 2,20 655,07 2,19 355,59 2,20 I-0h 581,65 2,23 717,58 2,21 361,24 2,18 I-6h 387,81 2,19 697,24 2,22 503,49 2,23 I-12h 320,96 2,20 604,04 2,22 776,55 2,22 I-24h 569,91 2,21 193,63 2,18 181,14 2,07 I-48h 686,00 2,23 1002,05 2,20 391,02 2,20 I-72h 704,15 2,21 1291,58 2,19 395,47 2,20 I-96h 916,15 2,22 656,81 2,19 336,78 2,22
Trong đó: A, C, I-(0h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h): Lần lƣợt là các mẫu của các chủng Amylase, control, Interleukin-2 thu tại các thời điểm 0h, 6h, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h.
Từ bảng 3.1 trên có thể thấy nồng độ mRNA trong các mẫu đều khá cao, với mẫu thấp nhất đạt 320 ng/µL, các mẫu đều có chỉ số A260/A280 lớn hơn 1,8 phần lớn các mẫu cao hơn 2,0 đây là kết quả hợp lý vì sản phẩm chứa phần lớn là RNA. Với kết quả trên cho thấy RNA thu đƣợc đủ điều kiện để sử dụng cho Real-time PCR.
42
3.3. Tối ƣu điều kiện cho phản ứng Real-time PCR
Một phản ứng PCR thành công phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ khuôn...Riêng với nhiệt độ gắn mồi chúng tôi tham khảo hƣớng đẫn của bộ kit Real-time PCR và lấy các mốc nhiệt độ quanh tính toán theo nhiệt độ gắn của từng mồi.
3.3.1. Tối ƣu điều kiện Real-time PCR với gene chuẩn IPP1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tối ưu nồng độ mRNA trong phản ứng Real-time PCR
Tiến hành phản ứng PCR với các nồng độ 50, 100, 250, 500 ng/µL. Kết quả điện di cho thấy, ở nồng độ mRNA khuôn là 100 ng/µL cho kết quả Real-time PCR tốt nhất.
Kết quả Real-time PCR khi thay đổi nhiệt độ gắn mồi
Chúng tôi tiến hành phản ứng Real-time PCR với nồng độ mRNA 100ng/µL đƣợc tiến hành với chƣơng trình chạy ban đầu có điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi từ 54°C lên 58°C, và nhận thấy ở nhiệt độ 58°C cho kết quả tốt nhất.
Quan sát băng điện di cho thấy, sản phẩm Real-time PCR với gene chuẩn IPP1 cho kết quả là vệt băng sáng rõ nét và đúng kích thƣớc. Nhƣ vậy, đã thành công trong việc thiết lập chƣơng trình và phản ứng Real-time PCR với gene chuẩn IPP1.
Hình 3.7: Kết quả Real-time PCR với gene chuẩn IPP1;M - Thang chuẩn DNA
100 bp; 1 - Sản phẩm Real-time PCR của gene chuẩn IPP1 100 bp
200 bp
M 1
43
3.3.2. Tối ƣu phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1
Phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gene MF(ALPHA)1. Chúng tôi khảo sát một mồi xuôi và 2 mồi ngƣợc.
Chƣơng trình chạy giống với gene IPP1, tuy nhiên đƣợc tiến hành ở nhiệt độ gắn mồi là 58°C và 59°C.
Quan sát băng điện di cho thấy, ở nhiệt độ gắn mồi là 58°C thì với cả 2 loại mồi ngƣợc đều cho sản phẩm Real-time PCR là vệt băng rõ nét đúng kích thƣớc. Tuy nhiên, quan sát thấy với mồi ngƣợc thứ nhất cho băng đậm hơn, kích thƣớc geneđúng với kích thƣớc của geneMF(ALPHA)1, chứng tỏ mồi ngƣợc này có độ đặc hiệu cao hơn và chính xác hơn. Do vậy, với phản ứng Real-time PCR tiến hành trên gene đích MF(ALPHA)1 sẽ sử dụng mồi ngƣợc thứ nhất và chƣơng trình chạy sử dụng nhiệt độ gắn mồi là 59°C.
Hình 3.8. Kết quả sản phẩm Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 sử dụng 2 loại mồi ngƣợc và ở 2 nhiệt độ gắn mồi 58°C và 59°C;M - Thang chuẩn
DNA 100 bp; 1 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ nhất ở 59°C; 2 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ nhất ở 58°C; 3 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ hai ở nhiệt độ 59°C; 4 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ hai ở nhiệt độ 58°C.
202
bp 200
bp
100
44
3.4. Kết quả Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1
Để so sánh tƣơng đối hàm lƣợng RNA của đoạn gene MF(ALPHA)1 của các chủng nấm men P. pastoris tại các thời điểm khác nhau, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp Real-time PCR định lƣợng tƣơng đối. Trong thí nghiệm real time PCR định lƣợng tƣơng đối, các gene nội chuẩn thƣờng đƣợc sử dụng. Các gene nội chuẩn (reference gene hay internal standard) là các gene mà sự biểu hiện phiên mã của chúng là không đổi ở các trạng thái tế bào khác nhau. Trong Real-time PCR, biểu hiện của gene đích thƣờng đƣợc so sánh với sự biểu hiện của một gene nội chuẩn nào đó để loại bỏ sai số trong quá trình làm thí nghiệm.
Thực chất, việc tìm đƣợc một gene nội chuẩn tốt là rất khó. Một số nghiên cứu sâu về một số gene nội chuẩn truyền thống nhƣ GAPDH, GPD, PBGD, ACT1, cho thấy rằng thực tế các sự biểu hiện của các gene này không phải là không đổi ở các điều kiện khác nhau [32]. Bên cạnh đó, do geneome của P. pastoris mới đƣợc công bố cách đây không lâu, các nghiên cứu chuyên sâu về sự biểu hiện phiên mã còn hạn chế, việc tìm đƣợc một gene nội chuẩn tốt càng khó khăn.
Nhiều nghiên cứu về gene nội chuẩn ở P. pastoris và S. cerevisiae đã đƣợc sử dụng trƣớc đó nhƣ HPRT, PBGD, GAPDH, G6PDH, RPL10, ALG9, ARG4, UBC6, TAF10, IPP1, chúng tôi chỉ tìm thấy một gene duy nhất dƣờng nhƣ là phù hợp với yêu cầu là gene IPP1 mã hóa cytoplasmic inorganic pyrophosphatase. Trình tự của gene IPP1 ở P. pastoris và S. cerevisiae giống nhau khoảng 70%. Tuy nhiên, các bộ mẫu dò đặc hiệu cho gene IPP1 ở S. cerevisiae khá tƣơng thích với IPP1 ở
P. pastoris.
Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm với gene đích cần nghiên cứu là MF(ALPHA)1, chúng tôi đã thực hiện Real-time PCR nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của gene nội chuẩn IPP1 trong các chủng control, Amy và IL-2 tại các thời điểm nghiên cứu 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ (Hình 3.9, Hình 3.10, Bảng 3.3).
45 1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, 6 - Mẫu phản ứng của chủng Amylase tại 0, 24 và 48h; 7, 10, 11 - Mẫu phản ứng của chủng Control tại 0, 24 và 48h.
Hình 3.9: Biểu đồ khuếch đại gene IPP1 của các mẫu trong Real-time PCR;
Hình 3.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy sản phẩm khuếch đại gene IPP1 trong Real-time PCR; 1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, 6 - Mẫu phản ứng của chủng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Amylase tại 0, 24 và 48h; 7, 10, 11 - Mẫu phản ứng của chủng Control tại 0, 24 và 48h; 12, 15, 16 - Mẫu phản ứng của chủng IL-2 tại 0, 24 và 48h.
46
Bảng 3.2: Giá trị chu kỳ ngƣỡng trong Real-time PCR kiểm tra sự biểu hiện của gene nội chuẩn IPP1 ở các chủng P. pastoris nghiên cứu ở các thời
điểm khác nhau của quá trình lên men Chu kỳ ngƣỡng (Ct) Mẫu Lên men lần I Lên men lần II
Control 0h 16.35 16.51 24 h 18.47 18.67 48 h 20.21 19.79 Amy 0h 15.96 16.55 24 h 18.64 18.51 48 h 20.43 19.65 IL-2 0 h 14.91 16.51 24 h 18.79 18.91 48 h 19.26 20.09
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần với mẫu RNA đƣợc tách chiết từ các lần lên men khác nhau. Kết quả cho thấy rằng sự biểu hiện của gene nội chuẩn trên thực tế không đƣợc nhƣ mong muốn (Bảng 3.2). Cụ thể là, so với thời điểm 0 giờ, ở chủng control và chủng Amy, sự biểu hiện gene IPP1 giảm khoảng 5 lần tại thời điểm 24 giờ và khoảng 10 lần tại thời điểm 48 giờ. Bên cạnh đó, ở chủng IL-2 biểu hiện phiên mã của gene IPP1 cũng giảm hơn 10 lần ở thời điểm 24 giờ và 48 giờ khi so sánh với thời điểm 0 giờ. Do sự biểu hiện của gene IPP1 có thay đổi theo thời gian, thực chất gene này không phù hợp với tiêu chuẩn của gene nội chuẩn.
Khi không tìm đƣợc gene nội chuẩn thích hợp, một số nhà nghiên cứu cũng đã tiến hành Real-time PCR mà không dùng gene nội chuẩn [29]. Từ thực tế thí nghiệm, chúng tôi quyết định tiến hành thí nghiệm Real-time PCR định lƣợng tƣơng đối biểu hiện đoạn gene MF(ALPHA)1 không dùng gene nội chuẩn. Thay vào đó, chúng tôi cố gắng chuẩn hóa các điều kiện thí nghiệm để loại bỏ các sai số hệ thống.
3.5. Real-time PCR về biểu hiện của gene MF(ALPHA)1
Do không tìm đƣợc gen nội chuẩn để so sánh sự biểu hiện gen giữa các chủng
47
MF(ALPHA)1 đƣợc chúng tôi tiến hành chạy Real-time PCR 3 lần với các mẫu RNA của các chủng control, amy, Il-2 và đối chứng.
3.5.1. Kết quả Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1
Giá trị chu kỳ ngƣỡng phụ thuộc rất lớn vào nồng độ DNA đích và đƣờng nên huỳnh quang. Những sự khác biệt đó sẽ ảnh hƣởng tới đƣờng cong khuếch đại và đƣợc ghi lại.
Dựa vào biểu đồ trên ta có thể thấy ở các chủng mang gene ngoại lai interleukin-2 và amylase, có đƣờng cong khuếch đại đi vào pha log rất sớm từ chu kỳ thứ 12 đến chu kỳ thứ 15 với các mẫu A-0h, A-6h, A-12h, A-24h, A-48h, A-72h, A-96h và I-0h, I-6h, I-12h, I-24h, I-48h, I-72h, I-96h, với cƣờng độ huỳnh quanh nhận giá trị khá cao gần 5,6. Riêng với mẫu A3-0h và I3-0h pha log đi chậm hơn ở chu kỳ 18 của phản ứng, điều này đƣợc gải thích là do tại thời điểm 0h các gene ngoại lai mới đƣợc cảm ứng nên số lƣơng phân tử RNA đƣợc tạo ra ít. Ở chủng đối chứng và các chủng control đi vào pha log rất chậm sau chu kỳ thứ 25, cƣờng độ huỳnh quang thu nhận đƣợc chỉ đạt khoảng thấp hơn các chủng khác.
Biểu đồ (Hình 3.11) đã cho chúng ta thấy sự khác biệt rất rõ ràng ở hai nhóm chủng mang gene ngoại lai và chủng không mang gene ngoại lại và cho thấy sự phụ