Các phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phƣơng pháp lên men và nuôi cấy các chủng P. pastoris tái tổ hợp

Chủng P. pastorisSMD1168 tái tổ hợp đƣợc lựa chọn từ môi trƣờng đĩa thạch từ qui trình sàng lọc khuẩn lạc sẽ đƣợc cấy chuyển vào 5 ml môi trƣờng BMGY nuôi trong điều kiện lắc 200 vòng/phút ở 280C qua đêm (khoảng 24h). Dịch tế bào nuôi cấy đƣợc kiểm tra OD600 trên máy quang phổ để xác định hệ số pha loãng và lƣợng dịch nuôi cấy cần thiết cho bƣớc cấy chuyển sang môi trƣờng mới để đạt OD600= 0.1. Dịch nuôi cấy đƣợc chuyển sang bình tam giác mới và đƣợc nuôi cấy lắc ở điều kiện 200 vòng/phút, nhiệt độ 280C trong khoảng 16-18h để đạt OD600 cảm ứng xấp xỉ 15. Sử dụng gạc bông vô trùng để bọc miệng bình tam giác, đảm bảo cho việc lƣu thông khí tối đa.

Qui trình biểu hiện đƣợc tiến hành nhƣ sau:

Nuôi cấy lắc qua đêm từ 16-18h để đạt OD600 cảm ứng xấp xỉ 13-16. Bổ sung methanol 100% để cảm ứng ở nồng độ cuối cùng 1%. Sau 12 h tiếp tục phải bổ sung methanol.Nuôi cấy lắc 230rpm ở nhiệt độ 30°C và thu mẫu theo thời điểm xác định để phân tích kết quả biểu hiện. Thời gian thu mẫu là 0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h.

2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch mRNA từ P. pastoris

a. Phƣơng pháp xử lý dụng cụ thí nghiệm để loại bỏ mRNA

- Toàn bộ dụng cụ thí nghiệm nhƣ: pipet, đầu tip, ống ly tâm, không có RNase. Pipet đƣợc chúng tôi lau sạch bằng dung dịch DEPC 1%. Đầu tip và ống ly tâm là sản phẩm đã đƣợc chứng nhận không có RNase và DNase.

- Các dụng cụ khác nhƣ bể chứa, khay đổ điện di, chai thủy tinh pha dung dịch cũng đƣợc ngâm dung dịch DEPC 1% trong khoảng 2h trƣớc khi khử trùng ƣớt.

- Nƣớc cất 1 lần, 2 lần và các dung dịch cần thiết khác đƣợc bổ sung DEPC trƣớc khi khử trùng để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn RNase trong dung dịch.

28

b. Phƣơng pháp tách chiết mRNA tổng số

Dịch tế bào nuôi cấy đƣợc kiểm tra OD600 trên máy quang phổ để xác định lƣợng tế bào cần thiết cho việc tách chiết. Số lƣợng tế bào tối đa theo khuyến cáo của QiaGen là khoảng 5.107 tế bào cho một cột tách chiết. Mẫu RNA tổng số của tế bào nấm men đƣợc tách chiết dựa trên kit tách chiết của Qiagen (RNeasy Mini Kit), trong đó tế bào đƣợc phá theo phƣơng pháp dung giải enzyme. Lấy 5x107 tế bào ly tâm ở 5000 vòng/ phút(v/p) trong 5 phút ở 40C, sau đó hòa trong 2 ml đệm Y1 (1M Sorbitol, 0.1 M EDTA, pH 7.4; 0.1% β-ME and 250 unit lyticase). Hỗn hợp lắc nhẹ trong 30 phút ở 30°C để tạo tế bào trần. mẫu đƣợc ly tâm trong 5 phút ở 8000 v/p để thu tế bào trần. Kết tủa thu đƣợc hòa trong 350 μl buffer RLT có chứa 1.43 M β- mercapto ethanol rồi khuấy mạnh nhằm dung giải tế bào trần. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 1 thể tích cồn ethanol 70%, đảo đều rồi đƣa lên cột RNeasy có chƣ́ a màng lo ̣c Cartridges có tác du ̣ng cố đi ̣nh RNA . Cột RNeasy sau đó đƣợc ly tâm ở 13000 vòng trong 15 giây và phần dịch đi qua màng sau đó sẽ bị loại bỏ. Màng lọc gắn RNA của cột RNeasy đƣợc rửa lần 1 với 700μl dung dịch đệm RW1 và rửa lần 2 và lần 3 mỗi lần với 500 μl dung dịch đệm RPE qua ly tâm 1 phút ở 13000v/p. Sau đó, màng lọc đƣợc ly tâm thêm 1 phút nữa ở 13000v/p để loại bỏ đệm dƣ thừa. Màng lọc đƣợc đƣa sang ống eppendorf mới; bổ sung 50 μl nƣớc đã đƣợc xử lý với DEPC và ly tâm trong 1 phút ở 13000v/p để thu mẫu mRNA tổng số. Để quá trình thu mẫu hiê ̣u quả, bƣớc thôi mẫu có thể đƣợc tiến hành 2 lần.

Mẫu RNA đƣợc xử lý với DNaseI (6 units) để loại bỏ DNA tạp. Hỗn hợp phản ứng ủ ở 37°C trong thời gian 30 phút. Thêm 11 ul dung dịch EDTA 25mM, trộn đều ủ ở 65°C trong 10 phút để dừng phản ứng bất hoạt enzyme DNase I.Cuối cùng, mẫu tinh sạch qua cột lần nữa để loại bỏ enzyme DNaseI và dung dịch đệm phản ứng.

Mẫu RNA đƣợc kiểm tra trên gel agarose, định lƣợng và xác định độ sạch bằng máy đo quang phổ NanoDrop. Sau khi đo nồng độ, mẫu đƣợc pha loãng đến nồng độ 100 ng/μl. Mẫu RNA tổng số sau khi pha loãng đƣợc đo nồng độ lần 2

29 bằng máy Nanodrop rồi tiếp tục đƣợc pha loãng tới nồng độ 20 ng/μl. Mẫu mRNA tổng số sau đó đƣợc giữ ở -80oC cho đến khi tiến hành thí nghiệm Real-time PCR.

2.2.3.Kỹ thuật PCR

 Cơ sở lý thuyết của PCR:

PCR (Polymerase chain reaction) là phƣơng pháp tổng hợp lƣợng lớn DNA in vitro trên cơ sở mẫu khuôn. Quá trình tổng hợp DNA kéo dài mồi dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và khả năng kéo dài chuỗi của enzyme polymerase bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba bƣớc: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Kết quả sau đến 2-3 giờ lƣợng DNA sẽ đƣợc khuếch đại lên khoảng 225-30 lần.

 Thành phần phản ứng: TT Thành phần phản ứng Thể tích (µL) 1 Nƣớc 15,5 2 DNA khuôn 1 3 DreamTaq Buffer 10x 2,5 4 Mồi xuôi 1,5 5 Mồi ngƣợc 1,5 6 dNTP 2,5 mM 2,5

7 Dream Taq polymerase 0,5

Tổng thể tích phản ứng 25

 Chƣơng trình chạy:

Bƣớc 1: Biến tính sợi DNA ở 94°C trong 2 phút. Bƣớc 2: Biến tính ở 94°C trong 10 giây.

Bƣớc 3: Gắn mồi trên sợi khuôn ở nhiệt độ thích hợp trong 30 giây. Bƣớc 4: Tổng hợp, kéo dài chuỗi ở 72°C trong 30 giây.

Lặp lại 30 chu kỳ từ bƣớc 2 đến bƣớc 4.

30

2.2.4. Kỹ thuật Real-time PCR

 Nguyên lý

Phản ứng Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green I. Chất này có đặc điểm là khi trong dung dịch có DNA mạch kép thì nó sẽ gắn vào các sợi kép này và phát quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Ƣu điểm của SYBR Green I là có nhiễu nền thấp và không gắn quá chặt vào sợi kép nên không làm ảnh hƣởng nhiều đến hiệu suất của PCR. Máy LightCycler đƣợc lập trình để thu nhận các tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu trong thời gian phản ứng. Lƣợng sản phẩm PCR càng lớn, tín hiệu thu đƣợc sẽ càng mạnh. Từ những tín hiệu này, máy sẽ số hóa và lƣu lại dƣới dạng dữ liệu thô.

 Tiến hành:

Phản ứng Real-time PCR tiến hành sử dụng bộ kit LightCycler RNA Master SYBR Green I của Roche với các cặp mồi đặc hiệu cho các geneMF(ALPHA)1.

 Thành phần phản ứng: TT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích hút (µL) 1 H2O 4.2 2 Mn(OAc)2 25 µM 1.3 3 Mồi xuôi 10 µM 1.0 4 Mồi ngƣợc 10 µM 1.0

5 RNA khuôn 20 ng/ul 5.0

6 RNA master mix 7.5

Tổng thể tích phản ứng 20

 Chƣơng trình chạy:

Bƣớc 1: Phiên mã ngƣợc ở 61°C trong 30 phút Bƣớc 2: Biến tính ở 95°C trong 2 phút

Bƣớc 3: Khuếch đại: 40 chu kỳ, chế độ Quantification Biến tính ở 95°C trong 10 giây

Gắn mồi ở 58°C cho gene IPP1 và 59°C cho gene MF(ALPHA)1 trong 30 giây Kéo dài ở 72°C trong 30 giây (chế độ single)

31 Bƣớc 4: Xây dựng đƣờng cong nóng chảy:

95°C trong 0 giây, 65°C trong 30 giây, 95°C trong 0 giây (Slope 0.1oC/s, continuous)

Bƣớc 5: Làm mát ở 40°C trong 30 giây

2.2.5. Xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0

 Nguyên lý

Phần mềm LightCycler 4.0 đƣợc thiết kế bởi Roche, cho phép xử lý trực tiếp số liệu thô thu đƣợc từ máy LightCycler Version 2.0. Các bộ số liệu thô đƣợc lƣu trong phần mềm dƣới dạng các “thí nghiệm” và có thể đƣợc trích xuất dƣới định dạng file chuyên dụng là .ixo. Chức năng “Analysis” của phần mềm đƣợc dùng để xử lý số liệu theo nhiều cách khác nhau và đƣa ra kết quả cuối cùng.

 Tiến hành: Chúng tôi sử dụng các phƣơng pháp xử lý số liệu sau:

Xác định chỉ số Ct (Crossing Point) của mẫu. Trong một phản ứng Real-time PCR, chu trình mà ở đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vƣợt lên trên mức huỳnh quang nền đƣợc gọi là Ct (Crossing Point) của mẫu đó. Trong đồ thị, Ct đƣợc thể hiệu khi đƣờng cong đi lên đột ngột, là điểm mà sản phẩm PCR bắt đầu hiện diện trong số liệu. Ct của một mẫu phụ thuộc vào nồng độ DNA ban đầu của mẫu đó. Một mẫu có nồng độ DNA ban đầu thấp sẽ cần nhiều chu trình hơn và có chỉ số Ct cao, trong khi mẫu có nồng độ cao hơn sẽ cần ít chu trình hơn và có Ct thấp.

Định lƣợng tƣơng đối đơn sắc/đơn kênh (Relative Quantification-Mono Color): Phân tích định lƣợng tƣơng đối dựa trên cơ sở là nồng độ DNA tại Crossing Point là nhƣ nhau với tất cả các mẫu chứa cùng một loại DNA đích. Mỗi mẫu đòi hỏi một số chu trình khác nhau để đạt tới Crossing Point, tùy thuộc vào nồng độ DNA ban đầu trong mẫu. Đến cuối thí nghiệm, nồng độ DNA của các mẫu cũng khác nhau, phụ thuộc vào số chu trình đã đƣợc hoàn thành sau khi mẫu đó đạt tới Crossing Point. Phƣơng pháp định lƣợng tƣơng đối sử dụng Ct, mức độ hiệu quả của phản ứng, số chu trình, và một số giá trị khác để xác định nồng độ DNA của các

32 mẫu đã tăng nhƣ thế nào khi kết thúc PCR. Các tính toán sau đó sẽ đƣợc sử dụng để so sánh giữa các mẫu và tính ra tỉ lệ cuối cùng giữa gene đích và gene tham chiếu.

Đƣờng cong nóng chảy (Melting Curves) và đỉnh nóng chảy (Melting Peak): Nhiệt độ nóng chảy của DNA có thể thay đổi trong một khoảng rộng, phụ thuộc vào trình tự, độ dài, và thành phần GC của chuỗi. Chỉ cần sai khác một base giữa hai DNA đã có thể dẫn tới sự thay đổi nhiệt độ nóng chảy. Chính bởi vậy, các chỉ số về nhiện độ nóng chảy có thể đƣợc sử dụng để nhận diện sản phẩm DNA. Để phân tích nhiệt độ nóng chảy, sự phát huỳnh quang của các mẫu cần đƣợc theo dõi trong khi nhiệt độ của máy LightCycler tăng lên chậm và đều. Khi nhiệt độ tăng, mức độ phát huỳnh quang sẽ giảm. Trong trƣờng hợp của chất nhuộm SYBR Green I, sự giảm này xảy ra do sự tách nhau của các mạch đơn trong DNA mạch kép, dẫn tới sự giải phóng các phân tử SYBR Green I.

33

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lên men các chủng P. pastoris tái tổ hợp

Các chủng P. pastoris SMD1168 mang vector pPIC9 nhƣ chủng đối chứng, chủng P. pastoris SMD1168 mang geneil-2 và amylase đƣợc lấy ra từ tủ lạnh -80°C đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MD đặc.

Đối chứng âm Chủng P. pastoriscontrol

Chủng P. pastorismang geneamy Chủng P. pastorismang geneil-2

Hình 3.1: Các chủng P. pastoris tái tổ hợp nuôi cấy trên môi trƣờng MD đặc

34 Các khuẩn lạc phát triển tốt nhất đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng, các chủng đƣợc nuôi cấy song song. Dịch lên men tại các thời điểm cảm ứng đƣợc thu lại theo thời gian. Chúng tôi tiến hành đo OD, để kiểm tra sự phát triển của tế bào. Kết quả đo OD phản ánh sự phát triển của tế bào trong quá trình nuôi cấy. Chúng tôi tiến hành đo OD ba lần cho mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình kết quả thu đƣợc nhƣ sau:

Nhìn vào biểu đồ trên cho thấy các chủng phát triển tƣơng đối đồng đều, điều này chứng tỏ quá trình nuối cấy đảm đồng nhất ở ba chủng. Đây là cơ sở ban đầu đảm bảo kết quả biểu hiện gene của các chủng ít bị sai số bởi điều kiện thí nghiệm mà chủ yếu ảnh do chính mức độ biểu hiện của từng chủng.

Để đánh sự biểu hiện protein ngoại của các chủng chúng tôi tiến hành thu mẫu các chủng: C là chủng control, A là chủng nấm men mang gene amylase, I là chủng nấm men mang gene il-2, theo thời gian từ 0h, 24h, 48h, 72h, 96h tính từ thời điểm cảm ứng methanol và ly tâm loại bỏ tế bào, dịch nổi đƣợc thu lại để biến tính và điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE 12.6% (Hình 3.3).

0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 OD 600 time (h) pPIC9 pPICAmylase pPICIL2

35 A (0, 24,48,72,96) - Lần lƣợt là mẫu lên men của chủng amylase, thu tại các thời điểm: 0h, 24h, 48h, 72h, 96h; C (0, 48, 96) - Lần lƣợt là mẫu lên men của chủng control thu tại các thời điểm: oh, 48h, 96h.; I (0, 24,48,72,96) : Lần lƣợt là mẫu lên men của chủng Interleukin-2, thu tại các thời điểm: 0h, 24h, 48h, 72h 96h.

Theo lý thuyết, protein tái tổ hợp Interleukin-2 và α-amylase có kích thƣớc tƣơng ứng là 15 kDa và 55 kDa. Kết quả trên hình điện di cho thấy, tại thời điểm 0h tính từ thời điểm cảm ứng, protein ngoại lai chƣa đƣợc tổng hợp ở cả 3 chủng: đối chứng, amylase, interleukin. Bắt đầu tại thời điểm 24h sau cảm ứng, chúng ta có thể thấy tại đƣờng chạy A24, A48, A72, A96 và I24, I48, I72, I96 xuất hiện một băng protein lạ mà không thấy ở trên đƣờng chạy đối chứng. Dựa trên thang protein chuẩn (tại đƣờng chạy M) chúng ta có thể ƣớc lƣợng kích thƣớc của các băng protein ngoại lai tƣơng ứng là 55 kDa và 15 kDa, phù hợp với kích thƣớc lý thuyết của protein α-amylase và Interleukin-2.

Tại các thời điểm tiếp theo, các protein ngoại lai của Interleukin-2 có hiện tƣợng biểu hiện tăng dần và duy trì biểu hiện ở các thời điểm tiếp theo. Riêng trên các đƣờng chạy của các mẫu amylase băng protein xuất hiện đậm rõ ngay ở thời điểm 24h và có biểu hiện tăng lên ở các thời điểm tiếp theo.

Hình 3.3: Kết quả điện di kiểm tra protein ngoại lai đƣợc biểu hiện ở các chủng P. Pastoris mang gene ngoại lai tại các thời điểmlấy mẫu khác nhau;

36 Đặc biệt trong tất cả các đƣờng chạy đều có chung đặc điểm xuất hiện rất ít các protein tạp điều này phù hợp với đặc điểm biểu hiện protein ngoại lai của P. pastoris là nấm men tiết rất ít protein của chính nó ra môi trƣờng nuôi cấy nên hầu hết protein trong môi trƣờng là protein tái tổ hợp [12].

Kết quả điện di trên đã khẳng định các gene ngoại lai đã đƣợc đƣa vào chủng

P. pastoris MSD1168 và biểu hiện thành protein ngoại lai, đây là cơ sở để có thể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

3.2. Tách chiết và tinh sạch RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men 3.2.1. Tách chiết RNA tổng số

Khi tách RNA có thể sử dụng 2 phƣơng pháp tách là tách theo bộ kit của các hãng sinh học phân tử và phƣơng pháp tách chiết bằng phenol. Tuy nhiên tách chiết theo phƣơng pháp chiết phenol mất nhiều công hơn (chuẩn bị các dung dịch nhiều, sử dụng nhiều loại hóa chất hơn, thao tác nhiều và cần tỉ mỉ hơn), và nguy cơ bị nhiễm trong quá trình thao tác cao. Hơn nữa mRNA dễ bị thủy phân bởi RNase có mặt ở khắp nơi, nên quá trình tách chiết phải đƣợc tiến hành trong điều kiện sạch, các dụng cụ thí nghiệm, bàn làm việc phải đảm bảo đƣợc xử lý sạch RNase trƣớc khi tiến hành làm thí nghiệm. Đây là một trong những yếu tố quyết định sự thành công của quá trình tách RNA. Vì vậy chúng tôi tách chiết theo Rneasy Mini Kit của QiaGene, trong đó tế bào đƣợc phá theo phƣơng pháp dung giải bằng enzyme, để đảm bảo chất lƣợng RNA cho quá trình chạy Real-time PCR sau này.

RNA tổng số bao gồm chủ yếu 3 loại mRNA, tRNA và rRNA. Trong đó, rRNA chiếm 80-85%, tRNA chiếm 15-20%, còn mRNA chiếm 1-5% (trên thực tế tỷ lệ này biến đổi rất khác nhau giữa các loài sinh vật, thậm trí ở trạng thái sinh lý-