1.4.2.1. Biểu đồ khuếch đại của Real-time PCR (amplification graph) [1]
Biểu đồ khuếch đại có trục tung (Y) là cƣờng độ huỳnh quang phát ra từ các ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích, còn trục hoành (X) là các chu kỳ nhiệt. (hình 1.9), biểu đồ này có thể phân thành các giai đoạn:
“Pha ủ”: Cƣờng độ huỳnh quang trong những chu kỳ đầu sẽ rất thấp và hầu nhƣ không thay đổi, hiển thị bằng một đƣờng thẳng nằm ngang, vì trong giai đoạn này dù DNA đích đã có thể đƣợc nhân bản thành các bản sao nhƣng do số lƣợng chƣa đủ để giúp cho chất phát huỳnh quang nhận đƣợc ánh sáng kích thích phát ra ánh sáng huỳnh quang đủ cƣờng độ để máy ghi nhận.
“Pha log”: khi số lƣợng bản sao của DNA đích đạt đến một ngƣỡng nhất định thì ánh sáng huỳnh quang phát ra sẽ đủ cƣờng độ để đƣợc máy ghi nhận và lúc này chúng ta sẽ thấy đƣờng biểu diễn khuếch đại bắt đầu ngóc lên. Cƣờng độ huỳnh quang trong ống phản ứng từ lúc này trở đi sẽ tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt do số lƣợng bản sao của DNA đích tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ. Chúng ta gọi giai đoạn này là “giai đoạn lũy thừa” về cƣờng độ huỳnh quang, không phải là giai đoạn tăng trƣởng lũy thừa về số lƣợng bản sao của DNA đích.
“Pha bình nguyên”: Cƣờng độ huỳnh quang trong ống phản ứng sẽ tăng trƣởng đến một mức nào đó thì độ tăng trƣởng sẽ chậm dần và đạt đến bình nguyên vì các bản sao của DNA đích, do phản ứng đã cạn dần dNTP và enzyme Taq polymerase không hoạt động hiệu quả nữa, nên sẽ không còn gia tăng số lƣợng theo cấp số 2 nữa.
Đƣờng biểu diễn khuếch đại (amplification curve) cho chúng ta sẽ thấy một thông số hết sức quan trọng là chu kì ngƣỡng và biểu đồ nóng chảy.
22
1.4.2.2. Chu kỳ ngƣỡng (Ct)
Chu kỳ ngƣỡng là trị số đƣợc xác định bằng số chu kỳ mà ở đó đƣợc đƣờng biển diễn khuếch đại cắt đƣờng nền (basal cycle). Cƣờng độ huỳnh quang nền đƣợc thiết bị Real-time PCR ghi nhận cƣờng độ tín hiệu huỳnh quang trong một số chu kỳ đầu và lấy trung bình cộng của các cƣờng độ huỳnh quang này làm cƣờng độ huỳnh quang nền.
Giá trị Ct sớm hay muộn phản ánh số lƣợng bản DNA đích ban đầu do đó thông qua đánh giá so sánh giá trị Ct chúng ta có thể so sánh một cách tƣơng đối số lƣợng DNA gốc ở các ống thí nghiệm. Tuy nhiên, vì SYBR Green I bắt cặp cho bất cứ sợi đôi DNA nào xuất hiện trong ống phản ứng sau các chu kỳ nhiệt kể cả các sợi đôi DNA không phải DNA đích, do vậy sự xuất hiện đƣờng biểu diễn khuếch đại trong ống phản ứng sẽ không đặc hiệu 100 % cho sự có mặt của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích.
Do đó để phân biệt đƣờng khuyết đại của AND đích với đƣờng khuếch đại của dimer primer ta dựa vào đỉnh nóng chảy.
Hình 1.9: Biểu đồ một đƣờng biểu diễn khuếch đại ghi nhận cƣờng độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận đƣợc ánh sánh kích thích vào mỗi
23
1.4.2.3. Biểu đồ nóng chảy
Sản phẩm khuếch đại từ dimer primer sẽ khác biệt với sản phẩm DNA đích ở chiều dài, nên có thể phân biệt đƣợc đƣợc đƣờng biểu diễn khuếch đại của ống phản ứng là của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ bản DNA đích hay là từ dimer primer bằng tính chất đặc trƣng đó chính là nhiệt độ chảy (melting To, Tm), Nhiệt độ chảy của sợi đôi DNA tùy thuộc vào thành phần GC và chiều dài của nó: Thành phần GC càng cao thì Tm càng cao, sợi đôi càng dài thì Tm càng cao. Sản phẩm khuếch đại từ DNA đích dài hơn nên sẽ có Tm cao hơn là Tm của sản phẩm khuếch đại từ dimer primer.
1.4.2.4. Phƣơng pháp so sánh định lƣợng tƣơng đối 2ΔCt
Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có chu kỳ ngƣỡng chênh nhau 1 đơn vị tƣơng đƣơng với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lƣợng RNA của gene đích. Tỷ lệ lƣợng RNA giữa mẫu thử và mẫu đối chứng đƣợc tính theo công thức:
Tỷ lệ mẫu thử/đối chứng = 2Ct(C)-Ct(T) .
Trong đó, Ct(C) là chu kỳ ngƣỡng của mẫu đối chứng, và Ct(T) là chu kỳ ngƣỡng của mẫu thí nghiệm.
Hình 1.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy cho phép xác định Tm nhờ các đỉnh biểu đồ chảy của từng ống phản ứng
24
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu
2.1.1. Chủng vi sinh vật và các gene biến nạp
Các chủng vi sinh vật:
- Chủng nấm men P. pastoris SMD1168 [ pep4, his4] đã tích hợp pPIC9. - P.pastoris pPIC9 chủng đối chứng – control.
- P. pastoris pPIC9Amy (chủng Amy). - P. pastoris pPIC9IL-2 (chủng IL-2).
Các gene biến nạp vào các chủng nghiên cứu gồm:
- Gene amy mã hóa cho α-amylase có nguồn gốc từS. Fibuligera. - Gene IL-2 mã hóa cho interleukin-2có nguồn gốc từ ngƣời.
2.1.2. Mồi cho phản ứng PCR và Real-time PCR
STT Tên mồi Trình tự nucleotide
1 IPP1-Fw 5’-TACGGTGCCTTCCCTCAG-3’ IPP1-Rv 5’-TCCCTCATCCAACAAAGCCATAAC-3’ 2 MF(ALPHA)1-Fw 5’-CTGCAGTTTTATTCGCAGCATCC-3’ MF(ALPHA)1-Rv1 5’-GCAGCAATGCTGGCAATAGTAG-3’ MF(ALPHA)1-Rv2 5’ CTTTTCTCGAGAGATACCCCTTCTTC 3’
2.1.3. Hóa chất, enzyme và các thiết bị máy móc
Hóa chất:
SDS, Tris-HCL, EDTA (Seava, Đức), isoamylalcohol, chloroform (Roth, Đức), Phenol, EtBr (Ethidium bromide), glycerol, agarose (Gibco, Mỹ), ethanol, agarose (Fluka, Đức), cao nấm men, bactopeptone, dNTPs (Promega, Mỹ), MgSO4, Magnessium chloride, Calcium chloride, Sodium hydroxide, Sodium chloride, acetic acid, hóa chất trong bộ kít tinh sạch DNA (Qiagen, Đức), DEPC, IPTG, polyacrylamide. Hóa chất trong bộ tách chiết và tinh sạch mRNA tổng số của hãng QiAgen, Bộ kít Real time-PCR light cyler 2.0 one step của hãng Roche.
25
Enzyme:
Taq-DNA Polymerase, (Biolabs, Anh), DNaseI, RNase (Fermentas, Mỹ), lysoyme, Potassium acetate (Qiagen, Đức).
Máy móc và thiết bị:
Máy Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche version 2.0; máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); bể ổn nhiệt (Memmert, Mỹ); máy điện di, máy chiếu tia cực tím (Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ); máy ly tâm ống nhỏ (Sorvall, Mỹ) và máy đo pH (Metler, Thụy Sỹ).
2.1.4. Phần mềm
Phần mềm LightCycler 4.0.
2.1.5. Các loại môi trƣờng và dung dịch
a. Môi trƣờng nuôi cấy chọn lọc và biểu hiện gene ngoại lai trong tế bào nấm menP. pastoris
- Môi trƣờng MD lỏng: 1,34% yeast nitrogen base (YNB); 4x10-5% biotin; 2% dextrose (glucose).
- Môi trƣờng MD đặc: 1,34% yeast nitrogen base (YNB); 4x10-5% biotin; 2% dextrose (glucose), 1.5% agar.
- Môi trƣờng BMGY: 1% cao nấm men, 2% peptone,100 mM potassium phosphate, pH 6,0; 1,34% YNB; 4x10-5 % biotin; 1% glycerol.
- Môi trƣờng BMMY: 1% cao nấm men, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate, pH 6,0; 1,34% YNB; 4x10-5 % biotin; 1% methanol,.
b. Dung dịch tách chiết mRNA từ nấm men
- Dung dịch BY1 gồm có 1M sorbitol, 0.5M EDTA có bổ sung thêm 0.1% mercaptoethanol và zymolase tới nồng độ cuối cùng là 300 µg/ml.
- Dung dịch RLT theo bộ kit đƣợc sử dụng để phá thành tế bào và đƣợc bổ sung 1% mercaptoethanol trƣớc khi sử dụng.
26 - Dung dịch RPE đƣợc bổ sung ethanol theo tỉ lệ 1 RPE: 3 Ethanol đƣợc sử dụng để làm sạch mẫu tách chiết.
c. Dung dịch xử lý DNA lẫn trong các mẫu RNA tách chiết
- Dung dịch EDTA 25mM.
- Dung dịch DEPC 1%: Pha DEPC trong nƣớc đến nồng độ 1% để loại bỏ toàn bộ RNase trong nƣớc, sau đó đem khử trùng dung dịch để loại bỏ DEPC.
- Dung dịch RLT và RPE (kit QiaGen).
d. Dung dịch loại bỏ RNase
- Dung dịch DEPC 1% để đƣợc dung dịch sử dụng cho quá trình loại bỏ RNase trong môi trƣờng.
e. Dung dịch sử dụng điện di DNA trên gel agarose
- Dung dịch đệm TAE pH8: 40mM Tris, 20mM acetic acid, và 1mM EDTA. - Đệm tra mẫu 6x.
- Dung dịch nhuộn gel: EtBr 0,5 µg/ml.
f. Dung dịch sử dụng điện di SDS-PAGE
- Đệm sử lý mẫu 6X: 7ml Tris-HCl 1M, pH 6,8; 3 ml glycerol 100%; 1 g SDS; 0,6 ml 2- mercapto-ethanol; 1,2 mg bromophenol.
- Gel polyacrylamide:
Hoá chất Gel tách Gel cô
Acrylamide 30% 3,5 ml 0,4 ml H2O 1,7 ml 1,6 ml Tris-HCl 2,1 ml [1,5M (pH=8,8)] 1 ml [0,5M (pH=6,8)] Glycerol 50% 1,68 ml 0 ml SDS 10% 90 ml 40 ml APS 10% 50 ml 30 ml TEMED 4 ml 3 ml
27
2.2. Các phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp lên men và nuôi cấy các chủng P. pastoris tái tổ hợp
Chủng P. pastorisSMD1168 tái tổ hợp đƣợc lựa chọn từ môi trƣờng đĩa thạch từ qui trình sàng lọc khuẩn lạc sẽ đƣợc cấy chuyển vào 5 ml môi trƣờng BMGY nuôi trong điều kiện lắc 200 vòng/phút ở 280C qua đêm (khoảng 24h). Dịch tế bào nuôi cấy đƣợc kiểm tra OD600 trên máy quang phổ để xác định hệ số pha loãng và lƣợng dịch nuôi cấy cần thiết cho bƣớc cấy chuyển sang môi trƣờng mới để đạt OD600= 0.1. Dịch nuôi cấy đƣợc chuyển sang bình tam giác mới và đƣợc nuôi cấy lắc ở điều kiện 200 vòng/phút, nhiệt độ 280C trong khoảng 16-18h để đạt OD600 cảm ứng xấp xỉ 15. Sử dụng gạc bông vô trùng để bọc miệng bình tam giác, đảm bảo cho việc lƣu thông khí tối đa.
Qui trình biểu hiện đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Nuôi cấy lắc qua đêm từ 16-18h để đạt OD600 cảm ứng xấp xỉ 13-16. Bổ sung methanol 100% để cảm ứng ở nồng độ cuối cùng 1%. Sau 12 h tiếp tục phải bổ sung methanol.Nuôi cấy lắc 230rpm ở nhiệt độ 30°C và thu mẫu theo thời điểm xác định để phân tích kết quả biểu hiện. Thời gian thu mẫu là 0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h.
2.2.2. Phƣơng pháp tách chiết và tinh sạch mRNA từ P. pastoris
a. Phƣơng pháp xử lý dụng cụ thí nghiệm để loại bỏ mRNA
- Toàn bộ dụng cụ thí nghiệm nhƣ: pipet, đầu tip, ống ly tâm, không có RNase. Pipet đƣợc chúng tôi lau sạch bằng dung dịch DEPC 1%. Đầu tip và ống ly tâm là sản phẩm đã đƣợc chứng nhận không có RNase và DNase.
- Các dụng cụ khác nhƣ bể chứa, khay đổ điện di, chai thủy tinh pha dung dịch cũng đƣợc ngâm dung dịch DEPC 1% trong khoảng 2h trƣớc khi khử trùng ƣớt.
- Nƣớc cất 1 lần, 2 lần và các dung dịch cần thiết khác đƣợc bổ sung DEPC trƣớc khi khử trùng để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn RNase trong dung dịch.
28
b. Phƣơng pháp tách chiết mRNA tổng số
Dịch tế bào nuôi cấy đƣợc kiểm tra OD600 trên máy quang phổ để xác định lƣợng tế bào cần thiết cho việc tách chiết. Số lƣợng tế bào tối đa theo khuyến cáo của QiaGen là khoảng 5.107 tế bào cho một cột tách chiết. Mẫu RNA tổng số của tế bào nấm men đƣợc tách chiết dựa trên kit tách chiết của Qiagen (RNeasy Mini Kit), trong đó tế bào đƣợc phá theo phƣơng pháp dung giải enzyme. Lấy 5x107 tế bào ly tâm ở 5000 vòng/ phút(v/p) trong 5 phút ở 40C, sau đó hòa trong 2 ml đệm Y1 (1M Sorbitol, 0.1 M EDTA, pH 7.4; 0.1% β-ME and 250 unit lyticase). Hỗn hợp lắc nhẹ trong 30 phút ở 30°C để tạo tế bào trần. mẫu đƣợc ly tâm trong 5 phút ở 8000 v/p để thu tế bào trần. Kết tủa thu đƣợc hòa trong 350 μl buffer RLT có chứa 1.43 M β- mercapto ethanol rồi khuấy mạnh nhằm dung giải tế bào trần. Hỗn hợp đƣợc bổ sung 1 thể tích cồn ethanol 70%, đảo đều rồi đƣa lên cột RNeasy có chƣ́ a màng lo ̣c Cartridges có tác du ̣ng cố đi ̣nh RNA . Cột RNeasy sau đó đƣợc ly tâm ở 13000 vòng trong 15 giây và phần dịch đi qua màng sau đó sẽ bị loại bỏ. Màng lọc gắn RNA của cột RNeasy đƣợc rửa lần 1 với 700μl dung dịch đệm RW1 và rửa lần 2 và lần 3 mỗi lần với 500 μl dung dịch đệm RPE qua ly tâm 1 phút ở 13000v/p. Sau đó, màng lọc đƣợc ly tâm thêm 1 phút nữa ở 13000v/p để loại bỏ đệm dƣ thừa. Màng lọc đƣợc đƣa sang ống eppendorf mới; bổ sung 50 μl nƣớc đã đƣợc xử lý với DEPC và ly tâm trong 1 phút ở 13000v/p để thu mẫu mRNA tổng số. Để quá trình thu mẫu hiê ̣u quả, bƣớc thôi mẫu có thể đƣợc tiến hành 2 lần.
Mẫu RNA đƣợc xử lý với DNaseI (6 units) để loại bỏ DNA tạp. Hỗn hợp phản ứng ủ ở 37°C trong thời gian 30 phút. Thêm 11 ul dung dịch EDTA 25mM, trộn đều ủ ở 65°C trong 10 phút để dừng phản ứng bất hoạt enzyme DNase I.Cuối cùng, mẫu tinh sạch qua cột lần nữa để loại bỏ enzyme DNaseI và dung dịch đệm phản ứng.
Mẫu RNA đƣợc kiểm tra trên gel agarose, định lƣợng và xác định độ sạch bằng máy đo quang phổ NanoDrop. Sau khi đo nồng độ, mẫu đƣợc pha loãng đến nồng độ 100 ng/μl. Mẫu RNA tổng số sau khi pha loãng đƣợc đo nồng độ lần 2
29 bằng máy Nanodrop rồi tiếp tục đƣợc pha loãng tới nồng độ 20 ng/μl. Mẫu mRNA tổng số sau đó đƣợc giữ ở -80oC cho đến khi tiến hành thí nghiệm Real-time PCR.
2.2.3.Kỹ thuật PCR
Cơ sở lý thuyết của PCR:
PCR (Polymerase chain reaction) là phƣơng pháp tổng hợp lƣợng lớn DNA in vitro trên cơ sở mẫu khuôn. Quá trình tổng hợp DNA kéo dài mồi dựa trên nguyên tắc bắt cặp đặc hiệu của các đoạn DNA có trình tự bổ sung và khả năng kéo dài chuỗi của enzyme polymerase bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có ba bƣớc: biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi. Kết quả sau đến 2-3 giờ lƣợng DNA sẽ đƣợc khuếch đại lên khoảng 225-30 lần.
Thành phần phản ứng: TT Thành phần phản ứng Thể tích (µL) 1 Nƣớc 15,5 2 DNA khuôn 1 3 DreamTaq Buffer 10x 2,5 4 Mồi xuôi 1,5 5 Mồi ngƣợc 1,5 6 dNTP 2,5 mM 2,5
7 Dream Taq polymerase 0,5
Tổng thể tích phản ứng 25
Chƣơng trình chạy:
Bƣớc 1: Biến tính sợi DNA ở 94°C trong 2 phút. Bƣớc 2: Biến tính ở 94°C trong 10 giây.
Bƣớc 3: Gắn mồi trên sợi khuôn ở nhiệt độ thích hợp trong 30 giây. Bƣớc 4: Tổng hợp, kéo dài chuỗi ở 72°C trong 30 giây.
Lặp lại 30 chu kỳ từ bƣớc 2 đến bƣớc 4.
30
2.2.4. Kỹ thuật Real-time PCR
Nguyên lý
Phản ứng Real-time PCR trên máy LightCycler của Roche sử dụng chất nhuộm huỳnh quang SYBR Green I. Chất này có đặc điểm là khi trong dung dịch có DNA mạch kép thì nó sẽ gắn vào các sợi kép này và phát quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích. Ƣu điểm của SYBR Green I là có nhiễu nền thấp và không gắn quá chặt vào sợi kép nên không làm ảnh hƣởng nhiều đến hiệu suất của PCR. Máy LightCycler đƣợc lập trình để thu nhận các tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu trong thời gian phản ứng. Lƣợng sản phẩm PCR càng lớn, tín hiệu thu đƣợc sẽ càng mạnh. Từ những tín hiệu này, máy sẽ số hóa và lƣu lại dƣới dạng dữ liệu thô.
Tiến hành:
Phản ứng Real-time PCR tiến hành sử dụng bộ kit LightCycler RNA Master SYBR Green I của Roche với các cặp mồi đặc hiệu cho các geneMF(ALPHA)1.
Thành phần phản ứng: TT Thành phần Nồng độ gốc Thể tích hút (µL) 1 H2O 4.2 2 Mn(OAc)2 25 µM 1.3 3 Mồi xuôi 10 µM 1.0 4 Mồi ngƣợc 10 µM 1.0
5 RNA khuôn 20 ng/ul 5.0
6 RNA master mix 7.5
Tổng thể tích phản ứng 20
Chƣơng trình chạy:
Bƣớc 1: Phiên mã ngƣợc ở 61°C trong 30 phút Bƣớc 2: Biến tính ở 95°C trong 2 phút
Bƣớc 3: Khuếch đại: 40 chu kỳ, chế độ Quantification Biến tính ở 95°C trong 10 giây
Gắn mồi ở 58°C cho gene IPP1 và 59°C cho gene MF(ALPHA)1 trong 30 giây Kéo dài ở 72°C trong 30 giây (chế độ single)
31 Bƣớc 4: Xây dựng đƣờng cong nóng chảy:
95°C trong 0 giây, 65°C trong 30 giây, 95°C trong 0 giây (Slope 0.1oC/s, continuous)
Bƣớc 5: Làm mát ở 40°C trong 30 giây
2.2.5. Xử lý số liệu sử dụng phần mềm LightCycler 4.0
Nguyên lý
Phần mềm LightCycler 4.0 đƣợc thiết kế bởi Roche, cho phép xử lý trực tiếp