Giá trị chu kỳ ngƣỡng phụ thuộc rất lớn vào nồng độ DNA đích và đƣờng nên huỳnh quang. Những sự khác biệt đó sẽ ảnh hƣởng tới đƣờng cong khuếch đại và đƣợc ghi lại.
Dựa vào biểu đồ trên ta có thể thấy ở các chủng mang gene ngoại lai interleukin-2 và amylase, có đƣờng cong khuếch đại đi vào pha log rất sớm từ chu kỳ thứ 12 đến chu kỳ thứ 15 với các mẫu A-0h, A-6h, A-12h, A-24h, A-48h, A-72h, A-96h và I-0h, I-6h, I-12h, I-24h, I-48h, I-72h, I-96h, với cƣờng độ huỳnh quanh nhận giá trị khá cao gần 5,6. Riêng với mẫu A3-0h và I3-0h pha log đi chậm hơn ở chu kỳ 18 của phản ứng, điều này đƣợc gải thích là do tại thời điểm 0h các gene ngoại lai mới đƣợc cảm ứng nên số lƣơng phân tử RNA đƣợc tạo ra ít. Ở chủng đối chứng và các chủng control đi vào pha log rất chậm sau chu kỳ thứ 25, cƣờng độ huỳnh quang thu nhận đƣợc chỉ đạt khoảng thấp hơn các chủng khác.
Biểu đồ (Hình 3.11) đã cho chúng ta thấy sự khác biệt rất rõ ràng ở hai nhóm chủng mang gene ngoại lai và chủng không mang gene ngoại lại và cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính mức độ biểu hiện của gene MF(ALPHA)1 với mức độ biểu hiện của các gene ngoại lai (il-2 và amy).
Kết quả trên phản ánh đúng với những đánh giá biểu hiện protein ở phần 3.1 của chƣơng này. Kết quả điện di protein đều cho thấy ở thời điểm 0h chƣa có protein ngoại lai đƣợc tạo ra. Nhƣng khi phân tích bằng Real-time PCR chúng ta nhận thấy rất rõ các chủng A-0h và I-0h có đƣờng khuếch đại đi vào pha log sớm hơn hẳn (ở chu kỳ thứ 20,55 và 19,84) so với các chủng đối chứng và control (khoảng chu kỳ 25,85 -26,07). Điều này chứng tỏ ở thời điểm 0h tế bào nấm men đã đáp ứng cảm ứng methanol để tạo ra các phân tử mRNA nhiều hơn ở các chủng không mang gene ngoại lai. Điều này chứng tỏ các gene ngoại lai có ảnh hƣởng mạnh tới sự biểu hiện của các gene trong promoter AOX1, qua đấy cũng chứng tỏ
48 khả năng hoạt động mạnh của promoter AOX1. Tuy nhiên do tại thời điểm này chƣa biểu hiện thành protein nên kỹ thuật phân tích protein không thể phát hiện đƣợc.
Biểu đồ đỉnh nóng chảy (Hình 3.12) cho thấy mẫu đối chứng âm và các mẫu phản ứng của chủng control tại tất cả các thời điểm có chung một điểm nóng chảy ở khoảng trên 74°C, là đỉnh nóng chảy của sản phẩm primer dimers khi không có RNA. Ngƣợc lại, các mẫu của chủng P. Pastoris mang geneAmy và gene IL-2 chỉ cho thấy một đỉnh nóng chảy duy nhất ở khoảng 80°C, là đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1.
Hình 3.11: Biểu đồ khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1 của các mẫu nghiên cứu trong real time PCR;1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, 6 - Mẫu phản ứng của
chủng Amylase tại 0, 24 và 48h; 9, 12, 13 - Mẫu phản ứng của chủng Control tại 0, 24 và 48h; 16, 19, 20 - Mẫu phản ứng của chủng IL-2 tại 0, 24 và 48h.
49 Cuối cùng chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm của phẩn ứng Real-time PCR bằng cách điện di trên gel agarose 1% (hình 3.13).
Hình 3.12: Biểu đồ đỉnh chảy sản phẩm khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1
của các mẫu nghiên cứu trong real time PCR; 1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, 6 -
Mẫu phản ứng của chủng Amylase tại 0, 24 và 48h; 9, 12, 13 - Mẫu phản ứng của chủng Control tại 0, 24 và 48h; 16, 19, 20 - Mẫu phản ứng của chủng IL-2 tại 0, 24 và 48h.
Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Real-time PCR với đoạn geneMF(ALPHA)1 ở các mẫu phản ứng
50 Kết quả ảnh điện di sản phẩm Real-time PCR trên gel agarose 1% cho thấy các geneMF(ALPHA)1 đƣợc nhân lên ở các chủng P. Pastoris mang gene Amy và Il-2 và. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích đỉnh nóng chảy bên trên. Điều này một lần nữa khẳng định tính chính xác của kỹ thuật Real-time PCR.
3.5.2. Phân tích so sánh mức độ biểu hiện geneMF(ALPHA)1
Giái trị Ct phản ánh số lƣợng DNA đích ban đầu của mẫu do đó chúng ta có thể so sánh đƣợc số lƣợng DNA đích của các mẫu với nhau. Để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm chúng tôi tiến hành phản ứng Real-time PCR ba lần và lấy giá trị trung bình (bảng 3.3).
Bảng 3.3: Giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình trong Real-time PCR của geneMF(ALPHA)1 ở các chủng P. pastoris ở các thời điểm lên men Thời điểm thu mẫu Giá trị Ct trung bình
Control Amy IL-2
0h 25,60 ± 1,41 20,70 ± 0,26 20,02 ± 0,23 6h 26,77 ± 0,90 14,75 ± 0,48 16,26 ± 1,19 12h 26,56 ± 0,98 15,22 ± 0,47 15,61 ± 0,77 24h 26,40 ± 0,59 15,96 ± 0,78 16,84 ± 0,83 48h 26,52 ± 0,89 16,45 ± 0,31 17,01 ± 0,72 72h 26,51 ± 0,90 16,65 ± 0,35 17,19 ± 0,53 96h 26,72 ± 1,00 17,16 ± 0,35 17,64 ± 0,65
3.5.2.1. So sánh mức độ biểu hiện của gene theo thời gian lên men trong từng chủng
Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có chu kỳ ngƣỡng chênh nhau 1 đơn vị tƣơng đƣơng với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lƣợng RNA của gene đích. Trong thí nghiệm của chúng tôi, việc so sánh lƣợng RNA trong các mẫu thí nghiệm đƣợc tiến hành phƣơng pháp định lƣợng tƣơng đối dựa trên đơn vị khối lƣợng. Tỷ lệ lƣợng RNA giữa mẫu thử và mẫu đối chứng đƣợc tính theo công thức: Tỷ lệ mẫu thử/đối chứng = 2Ct(C)-Ct(T) . Trong đó,
51 Ct(C) là chu kỳ ngƣỡng của mẫu đối chứng, và Ct(T) là chu kỳ ngƣỡng của mẫu thí nghiệm.
Đoạn geneMF(ALPHA)1 và gene tái tổ hợp (Amy/IL-2) đều chịu sự điều hòa bởi AOX1 promoter. Do mRNA của tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 gắn liền với mRNA của gene ngoại lai, sự khác biệt về tín hiệu tiết có thể coi nhƣ là sự phản ánh khác biệt về mức độ biểu hiện protein ngoại lai ở các chủng khác nhau.
Qua bảng 3.5trên ta thấy chủng nấm men P. pastoris biểu hiện amylase, tín hiệu tiết α đã đƣợc biểu hiện tại thời điểm 0 giờ, sau đó tăng lên rất cao ở 6 giờ (tới 61,8 lần) rồi giảm dần theo thời gian. Tƣơng tự, ở bảng 3.3 ta thấy ở chủng nấm men P. pastoris biểu hiện Interleukin-2, geneMF(ALPHA)1 đã đƣợc biểu hiện tại thời điểm 0 giờ.So với chủng Amy, lƣợng mRNA của đoạn geneMF(ALPHA)1 ở chủng IL-2 cao khoảng 13,55 lần ở 6 giờ; và tiếp tục tăng mạnh tới 21,36 ở thời điểm 24 giờ. Đồng thời, phân tích Real-time PCR cũng cho thấy rằng lƣợng mRNA tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 ở các IL-2 và Amy là khác nhau.
Những sự khác nhau kể trên là bằng chứng cho thấy có sự khác nhau đáng kể về thời gian và mức độ biểu hiện của hai geneAmy và geneIL-2 khi đƣợc biểu hiện trên P. pastoris. Sự khác nhau này có thể có nhiều nguyên nhân: do sự tƣơng tác giữa gene biểu hiện và MF(ALPHA)1, do sự khác nhau về hiệu quả biểu hiện của mỗi gene khi chịu sự điều hòa của promoter AOX1, do kích thƣớc khác nhau của hai gene, do vai trò khác nhau của hai gene đối với bản thân tế bào P. pastoris khi biểu hiện…
52
Bảng 3.4: Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P. pastoris control theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình
So sánh Control 0h 6h 12h 24h 48h 72h 6h 0,30 - - - - - 12h 0,34 1,16 - - - - 24h 0,38 1,29 1,11 - - - 48h 0,35 1,19 1,03 0,92 - - 72h 0,36 1,20 1,04 0,93 1,01 - 96h 0,31 1,04 0,90 0,80 0,87 0,86
Bảng 3.5: Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P. pastoris mang gene mã hóa cho amylase theo giá trị chu kỳ
ngƣỡng trung bình Thời gian thu mẫu Amy 0h 6h 12h 24h 48h 72h 6h 61,82 - - - - - 12h 44,74 0,72 - - - - 24h 26,78 0,43 0,60 - - - 48h 19,03 0,31 0,43 0,71 - - 72h 16,60 0,27 0,37 0,62 0,87 - 96h 11,67 0,19 0,26 0,44 0,61 1,42
Bảng 3.6: Tỷ lệ khác biệt của geneMF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P. pastoris mang gene mã hóa cho interleukin-2 theo giá trị chu kỳ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
ngƣỡng trung bình Thời gian thu mẫu IL-2 0h 6h 12h 24h 48h 72h 6h 13,55 - - - - - 12h 21,26 1,57 - - - - 24h 9,04 0,67 0,43 - - - 48h 8,07 0,60 0,38 0,89 - - 72h 7,11 0,52 0,33 0,79 0,88 - 96h 5,21 0,38 0,24 0,58 0,64 0,73
53
3.5.2.2. So sánh mức độ biểu hiện của geneMF(ALPHA)1 theo thông số về chủng.
Tƣơng tự nhƣcách so sánh ở trong từng chủng, chúng tôi so sánh mức độ biểu hiện của geneMF(ALPHA)1 giữa các chủng với nhau. Kết qủa đƣợc thể hiện trên (Hình 3.14).Ở thời điểm 0 giờ, lƣợng mRNA của geneMF(ALPHA)1 trong chủng P. Pastoris mang gen ngoại lai Amy và IL-2 có tỷ lệ khác biệt là 1 và 1,6 tƣơng ứng, tiếp đến thời điểm 6 giờ giá trị này ở chủng Amy tăng cao 61,8 đạt giá trị cao nhất và sau đó giảm dần ở các thời điểm lấy mẫu tiếp theo, trong khi đó, ở chủng sinh IL-2 ở thời điểm 6 giờ đạt 21,7 và cao nhất ở thời điểm 12 giờ nhƣng chỉ đạt 34,1 rồi giảm dần ở các thời điểm sau đó.
3.6. So sánh kết quả Real-time PCR và Microarray
Khi phân tích biểu hiện của tất cả các gene có thể đƣợc tạm đánh giá bằng các kỹ thuật microarray, để phát hiện ra những thay đổi trong mẫu và lựa chọn các gene thay đổi đó. Nhƣng sự biểu hiện của gene đƣợc lựa chọn có thể đƣợc đo với độ chính xác rất cao bởi Real-time PCR.
Phân tích Real-time PCR đều cho ra các kết quả khá tƣơng đồng nhau về xu hƣớng biểu hiện của đoạn geneMF(ALPHA)1 ở các chủng nghiên cứu. Cụ thể là biểu hiện của chủng control tại các thời điểm rất thấp so với chủng Amy và IL-2.
Hình 3.14: Biểu đồ so sánh mức độ biểu hiện của đoạn geneMF(ALPHA)1giữa các
chủng P. Pastoris tái tổ hợp; A- Chủng P. Pastoris mang gene mã hóa amylase; C-
54 Bên cạnh đó, lƣợng mRNA của MF(ALPHA)1 ở chủng Amy và IL-2 thấp nhất tại thời điểm 0 giờ, cao vƣợt trội ở thời điểm 24 giờ sau đó có giảm xuống một chút ở thời điểm 48 giờ.
Điều này phà hợp vơi những kết quả phân tích so sánh hệ transcriptome trong nghiên cứu của Dƣơng Cẩm Thúy và cộng sựở các chủng P. pastoris đối chứng, chủng sinh tổng hợp IL-2, chủng sinh tổng hợp amylase sử dụng YEAST_2 array trong hê ̣ geneome của S. cerevisiae và Schizosaccharomyces pombe. Khi chỉ ra gene MF(ALPHA)1 có sự khác biệt trong biểu hiện gene giữa các chủng [15].
So với phân tích microarray, kết quả phân tích real-time PCR cho thấy một số khác biệt. Theo phân tích microarray, lƣợng mRNA của đoạn geneMF(ALPHA)1 ở chủng đối chứng dù thấp hơn rất nhiều so với chủng mang gene ngoại lai Amy và IL-2 nhƣng vẫn đƣợc nhận biết. Trong khi đó, theo phân tích real-time PCR, mRNA của đoạn geneMF(ALPHA)1 không đƣợc xác định trong chủng đối chứng. Kết quả phân tích mRNA đối với geneMF(ALPHA)1có sự khác biệt theo cả yếu tố chủng và yếu tố thời gian. Ở cùng một thời điểm nghiên cứu, kết quả microarray cho thấy lƣợng mRNA của đoạn geneMF(ALPHA)1 ở hai chủng Amy và IL-2 khá giống nhau (hình 3.15), còn phân tích real-time PCR cho thấy lƣợng mRNA của đoạn geneMF(ALPHA)1 ở chủng IL-2 thấp hơn chủng Amy (Hình 3.14).
76 1187 1472 99 14453 15118 84 13419 13585 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
Control Amy IL-2
Tí n hi ệu la i flo ur es ce nt Các chủng nghiên cứu
Kết quả microarray so sánh lượng mRNA của đoạn gen
MF(ALPHA)1
0 h 24 h 48 h
Hình3.15: Kết quả phân tích microarray về biểu hiện phiên mã của đoạn geneMF(ALPHA)1[15]
55
KẾT LUẬN
Với những kết quả thu nhận đƣợc trong quá trình thực hiện đề tài chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
1. Đã tách chiết thành công các mẫu RNA tổng sốphục vụ cho tiến hành thí nghiệm Real-time PCR. Các mẫu đều đạt chất lƣợng về nồng độ và độ tinh sạch cao, đảm bảo yêu cầu.
2. Đã tối ƣu hóa thành công điều kiện phản ứng Real-time PCRvà thiết lập thành công chƣơng trình chạy Real-time PCR sử dụng SYBR GREEN I, trên hệ máy LightCycler 2.0cho hai là gene IPP1 và gene đích MF(ALPHA)1.
3. Đã phân tích định lƣợng tƣơng đối sự biểu hiện phiên mã của tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 trong các chủng tái tổ hợp sinh amylase và interleukin-2 trên phần mềm LightCycler 4.0 của Roche.
4. Kết quả phân tích Real-time PCR đãcho thấymức độ biểu hiện của geneMF(ALPHA)1ở các chủng P. pastoris mang gene Amy/IL-2 cao hơn nhiều lần so với chủng đối chứng không mang gene ngoại lai.
KIẾN NGHỊ
Nghiên cứu mức độ biểu hiện ở cấp độ protein của các chủng P. Pastoristái tổ hợp sinh amylase và interleukin-2 ở các thời điểm khác nhau trong nuôi cấy bằng kĩ thuật ELISA.
56
TÀI LIỆU THAM KHẢO (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tài liệu tham khảo tiếng Việt:
1. Nguyên Văn Hùng (2010), PCR và Real-time PCR các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp, NXB Y học.
2. Võ Thị Thƣơng Lan (2009), Sinh học phân tử tế bào và ứng dụng, NXB Giáo dục, Hà Nội.
Tài liệu tham khảo tiếng Anh:
3. Dorak MT (2006), Real-time PCR, Taylor & Francis, New York.
4. Higgins DR, Cregg JM (1998), Pichia protocols, Humana Press, Totowa, N.J.
5. Bengtsson M, Karlsson HJ, Westman G, Kubista M (2003), "A new minor groove binding asymmetric cyanine reporter dye for real-time PCR".Nucleic Acids Res, 31 (8), p. 21-45.
6. Bustin SA (2000), "Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays".J Mol Endocrinol, 25 (2), p. 169-193.
7. Bustin SA (2002), "Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems".J Mol Endocrinol, 29 (1), p. 23-39.
8. Caplan S, Kurjan J (1991), "Role of alpha-factor and the MF alpha 1 alpha- factor precursor in mating in yeast".Genetics, 127 (2), p. 299-307.
9. Catala C, Rose JK, York WS, Albersheim P, Darvill AG, Bennett AB (2001), "Characterization of a tomato xyloglucan endotransglycosylase gene that is down-regulated by auxin in etiolated hypocotyls".Plant Physiol, 127 (3), p. 1180-1192.
10. Cereghino JL, Cregg JM (2000), "Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris".FEMS Microbiol Rev, 24 (1), p. 45-66.
57 11. Cha HJ, Dalal NN, Bentley WE (2005), "Secretion of human interleukin-2 fused with green fluorescent protein in recombinant Pichia pastoris".Appl Biochem Biotechnol, 126 (1), p. 1-11.
12. Cregg JM, Cereghino JL, Shi J, Higgins DR (2000), "Recombinant protein expression in Pichia pastoris".Mol Biotechnol, 16 (1), p. 23-52.
13. Daly R, Hearn MT (2005), "Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production".J Mol Recognit, 18 (2), p. 119-138.
14. Du J, Yang H, Zhang D, Wang J, Guo H, Peng B, Guo Y, Ding J (2010), "Structural basis for the blockage of IL-2 signaling by therapeutic antibody basiliximab".J Immunol, 184 (3), p. 1361-1368.
15. Duong CT, Le TTH, Nguyen TN, Nguyen HT, Le TLA, Truong NH (2011), "Microarray-Based Transcriptome Analysis of Recombinant Pichia Pastoris
Strains Overexpressing Alpha-Amylase and Interleukin-2".International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics (IJBBB), 2 (1), p. 6. 16. Fuller RS, Sterne RE, Thorner J (1988), "Enzymes required for yeast
prohormone processing".Annu Rev Physiol, 50 p. 345-362.
17. Ginzinger DG (2002), "Gene quantification using real-time quantitative PCR: an emerging technology hits the mainstream".Exp Hematol, 30 (6), p. 503-512.
18. Han MJ, Jeong KJ, Yoo JS, Lee SY (2003), "Engineering Escherichia coli
for increased productivity of serine-rich proteins based on proteome profiling".Appl Environ Microbiol, 69 (10), p. 5772-5781.
19. Jahic M, Veide A, Charoenrat T, Teeri T, Enfors SO (2006), "Process technology for production and recovery of heterologous proteins with Pichia pastoris".Biotechnol Prog, 22 (6), p. 1465-1473.
20. Jelicks LA, Naider FR, Shenbagamurthi P, Becker JM, Broido MS (1988), "A type II beta-turn in a flexible peptide: proton assignment and conformational analysis of the alpha-factor from Saccharomyces cerevisiae
in solution".Biopolymers, 27 (3), p. 431-449.
21. Klein D (2002), "Quantification using real-time PCR technology: applications and limitations".Trends Mol Med, 8 (6), p. 257-260.