Nguyên lý
Phần mềm LightCycler 4.0 đƣợc thiết kế bởi Roche, cho phép xử lý trực tiếp số liệu thô thu đƣợc từ máy LightCycler Version 2.0. Các bộ số liệu thô đƣợc lƣu trong phần mềm dƣới dạng các “thí nghiệm” và có thể đƣợc trích xuất dƣới định dạng file chuyên dụng là .ixo. Chức năng “Analysis” của phần mềm đƣợc dùng để xử lý số liệu theo nhiều cách khác nhau và đƣa ra kết quả cuối cùng.
Tiến hành: Chúng tôi sử dụng các phƣơng pháp xử lý số liệu sau:
Xác định chỉ số Ct (Crossing Point) của mẫu. Trong một phản ứng Real-time PCR, chu trình mà ở đó tín hiệu huỳnh quang của mẫu vƣợt lên trên mức huỳnh quang nền đƣợc gọi là Ct (Crossing Point) của mẫu đó. Trong đồ thị, Ct đƣợc thể hiệu khi đƣờng cong đi lên đột ngột, là điểm mà sản phẩm PCR bắt đầu hiện diện trong số liệu. Ct của một mẫu phụ thuộc vào nồng độ DNA ban đầu của mẫu đó. Một mẫu có nồng độ DNA ban đầu thấp sẽ cần nhiều chu trình hơn và có chỉ số Ct cao, trong khi mẫu có nồng độ cao hơn sẽ cần ít chu trình hơn và có Ct thấp.
Định lƣợng tƣơng đối đơn sắc/đơn kênh (Relative Quantification-Mono Color): Phân tích định lƣợng tƣơng đối dựa trên cơ sở là nồng độ DNA tại Crossing Point là nhƣ nhau với tất cả các mẫu chứa cùng một loại DNA đích. Mỗi mẫu đòi hỏi một số chu trình khác nhau để đạt tới Crossing Point, tùy thuộc vào nồng độ DNA ban đầu trong mẫu. Đến cuối thí nghiệm, nồng độ DNA của các mẫu cũng khác nhau, phụ thuộc vào số chu trình đã đƣợc hoàn thành sau khi mẫu đó đạt tới Crossing Point. Phƣơng pháp định lƣợng tƣơng đối sử dụng Ct, mức độ hiệu quả của phản ứng, số chu trình, và một số giá trị khác để xác định nồng độ DNA của các
32 mẫu đã tăng nhƣ thế nào khi kết thúc PCR. Các tính toán sau đó sẽ đƣợc sử dụng để so sánh giữa các mẫu và tính ra tỉ lệ cuối cùng giữa gene đích và gene tham chiếu.
Đƣờng cong nóng chảy (Melting Curves) và đỉnh nóng chảy (Melting Peak): Nhiệt độ nóng chảy của DNA có thể thay đổi trong một khoảng rộng, phụ thuộc vào trình tự, độ dài, và thành phần GC của chuỗi. Chỉ cần sai khác một base giữa hai DNA đã có thể dẫn tới sự thay đổi nhiệt độ nóng chảy. Chính bởi vậy, các chỉ số về nhiện độ nóng chảy có thể đƣợc sử dụng để nhận diện sản phẩm DNA. Để phân tích nhiệt độ nóng chảy, sự phát huỳnh quang của các mẫu cần đƣợc theo dõi trong khi nhiệt độ của máy LightCycler tăng lên chậm và đều. Khi nhiệt độ tăng, mức độ phát huỳnh quang sẽ giảm. Trong trƣờng hợp của chất nhuộm SYBR Green I, sự giảm này xảy ra do sự tách nhau của các mạch đơn trong DNA mạch kép, dẫn tới sự giải phóng các phân tử SYBR Green I.
33
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Lên men các chủng P. pastoris tái tổ hợp
Các chủng P. pastoris SMD1168 mang vector pPIC9 nhƣ chủng đối chứng, chủng P. pastoris SMD1168 mang geneil-2 và amylase đƣợc lấy ra từ tủ lạnh -80°C đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MD đặc.
Đối chứng âm Chủng P. pastoriscontrol
Chủng P. pastorismang geneamy Chủng P. pastorismang geneil-2
Hình 3.1: Các chủng P. pastoris tái tổ hợp nuôi cấy trên môi trƣờng MD đặc
34 Các khuẩn lạc phát triển tốt nhất đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng lỏng, các chủng đƣợc nuôi cấy song song. Dịch lên men tại các thời điểm cảm ứng đƣợc thu lại theo thời gian. Chúng tôi tiến hành đo OD, để kiểm tra sự phát triển của tế bào. Kết quả đo OD phản ánh sự phát triển của tế bào trong quá trình nuôi cấy. Chúng tôi tiến hành đo OD ba lần cho mỗi mẫu và lấy giá trị trung bình kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
Nhìn vào biểu đồ trên cho thấy các chủng phát triển tƣơng đối đồng đều, điều này chứng tỏ quá trình nuối cấy đảm đồng nhất ở ba chủng. Đây là cơ sở ban đầu đảm bảo kết quả biểu hiện gene của các chủng ít bị sai số bởi điều kiện thí nghiệm mà chủ yếu ảnh do chính mức độ biểu hiện của từng chủng.
Để đánh sự biểu hiện protein ngoại của các chủng chúng tôi tiến hành thu mẫu các chủng: C là chủng control, A là chủng nấm men mang gene amylase, I là chủng nấm men mang gene il-2, theo thời gian từ 0h, 24h, 48h, 72h, 96h tính từ thời điểm cảm ứng methanol và ly tâm loại bỏ tế bào, dịch nổi đƣợc thu lại để biến tính và điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE 12.6% (Hình 3.3).
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 OD 600 time (h) pPIC9 pPICAmylase pPICIL2
35 A (0, 24,48,72,96) - Lần lƣợt là mẫu lên men của chủng amylase, thu tại các thời điểm: 0h, 24h, 48h, 72h, 96h; C (0, 48, 96) - Lần lƣợt là mẫu lên men của chủng control thu tại các thời điểm: oh, 48h, 96h.; I (0, 24,48,72,96) : Lần lƣợt là mẫu lên men của chủng Interleukin-2, thu tại các thời điểm: 0h, 24h, 48h, 72h 96h.
Theo lý thuyết, protein tái tổ hợp Interleukin-2 và α-amylase có kích thƣớc tƣơng ứng là 15 kDa và 55 kDa. Kết quả trên hình điện di cho thấy, tại thời điểm 0h tính từ thời điểm cảm ứng, protein ngoại lai chƣa đƣợc tổng hợp ở cả 3 chủng: đối chứng, amylase, interleukin. Bắt đầu tại thời điểm 24h sau cảm ứng, chúng ta có thể thấy tại đƣờng chạy A24, A48, A72, A96 và I24, I48, I72, I96 xuất hiện một băng protein lạ mà không thấy ở trên đƣờng chạy đối chứng. Dựa trên thang protein chuẩn (tại đƣờng chạy M) chúng ta có thể ƣớc lƣợng kích thƣớc của các băng protein ngoại lai tƣơng ứng là 55 kDa và 15 kDa, phù hợp với kích thƣớc lý thuyết của protein α-amylase và Interleukin-2.
Tại các thời điểm tiếp theo, các protein ngoại lai của Interleukin-2 có hiện tƣợng biểu hiện tăng dần và duy trì biểu hiện ở các thời điểm tiếp theo. Riêng trên các đƣờng chạy của các mẫu amylase băng protein xuất hiện đậm rõ ngay ở thời điểm 24h và có biểu hiện tăng lên ở các thời điểm tiếp theo.
Hình 3.3: Kết quả điện di kiểm tra protein ngoại lai đƣợc biểu hiện ở các chủng P. Pastoris mang gene ngoại lai tại các thời điểmlấy mẫu khác nhau;
36 Đặc biệt trong tất cả các đƣờng chạy đều có chung đặc điểm xuất hiện rất ít các protein tạp điều này phù hợp với đặc điểm biểu hiện protein ngoại lai của P. pastoris là nấm men tiết rất ít protein của chính nó ra môi trƣờng nuôi cấy nên hầu hết protein trong môi trƣờng là protein tái tổ hợp [12].
Kết quả điện di trên đã khẳng định các gene ngoại lai đã đƣợc đƣa vào chủng
P. pastoris MSD1168 và biểu hiện thành protein ngoại lai, đây là cơ sở để có thể tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Tách chiết và tinh sạch RNA tổng số từ dịch nuôi cấy tế bào nấm men 3.2.1. Tách chiết RNA tổng số
Khi tách RNA có thể sử dụng 2 phƣơng pháp tách là tách theo bộ kit của các hãng sinh học phân tử và phƣơng pháp tách chiết bằng phenol. Tuy nhiên tách chiết theo phƣơng pháp chiết phenol mất nhiều công hơn (chuẩn bị các dung dịch nhiều, sử dụng nhiều loại hóa chất hơn, thao tác nhiều và cần tỉ mỉ hơn), và nguy cơ bị nhiễm trong quá trình thao tác cao. Hơn nữa mRNA dễ bị thủy phân bởi RNase có mặt ở khắp nơi, nên quá trình tách chiết phải đƣợc tiến hành trong điều kiện sạch, các dụng cụ thí nghiệm, bàn làm việc phải đảm bảo đƣợc xử lý sạch RNase trƣớc khi tiến hành làm thí nghiệm. Đây là một trong những yếu tố quyết định sự thành công của quá trình tách RNA. Vì vậy chúng tôi tách chiết theo Rneasy Mini Kit của QiaGene, trong đó tế bào đƣợc phá theo phƣơng pháp dung giải bằng enzyme, để đảm bảo chất lƣợng RNA cho quá trình chạy Real-time PCR sau này.
RNA tổng số bao gồm chủ yếu 3 loại mRNA, tRNA và rRNA. Trong đó, rRNA chiếm 80-85%, tRNA chiếm 15-20%, còn mRNA chiếm 1-5% (trên thực tế tỷ lệ này biến đổi rất khác nhau giữa các loài sinh vật, thậm trí ở trạng thái sinh lý- sinh hóa của tế bào). Các RNA này có kích thƣớc, trình tự xác định và có thể kiểm tra đƣợc bằng các kỹ thuật nhƣ: điện di, li tâm, sắc kí thƣờng, sắc ký ái lực... Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra và đánh giá chất lƣợng RNA tổng số vì phƣơng pháp này dễ làm, ít tốn kém và cho hiệu quả cao.
37 Trong các thành phần của RNA tổng số thì rRNA là yếu tố quan trọng giúp ta có thể đánh giá đƣợc sơ bộ chất lƣợng RNA tổng số thông qua các tiểu phần 18S và 28S.
1, 2, 3 - Control, Amy, IL-2 tại 0h; 4,5,6 - Control, Amy, IL-2 tại 6h; 7, 8, 9 - Control, Amy, IL-2 tại 12h; 10, 11, 12 - Control, Amy, IL-2 tại 24h; 13, 14, 15 - Control, Amy, IL-2 tại 48h.
Kết quả trên hình cho thấy trên đƣờng chạy có 2 băng điện di sắc nét, tƣơng ứng với hai băng 28S và 18S của rRNA ribosome. Sự xuất hiện của các băng này chứng tỏ RNA không bị phân cắt.
3.2.2. Tinh sạch mRNA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi tách RNA luôn có lẫn một lƣợng DNA nhất định ở trong mẫu nên phải loại bỏ lƣợng DNA này, vì để kết quả phân tích Real-time PCR đòi hỏi mẫu RNA tách chiết có độ tinh sạch cao và đặc biệt không bị lẫn DNA [30], nếu mẫu RNA còn lẫn DNA sẽ ảnh hƣởng trực tiếp tới kết quả thì nghiệm do DNA đó sẽ đƣợc nhân lên, nên việc loại bỏ DNA là yêu cầu bắt buộc.
Mẫu đƣợc xử lý bằng enzyme DNaseI ở 37°C trong 30 phút để enzyme hoạt động loại bỏ toàn bộ DNA còn lại trong mẫu. Tiếp đó là bất hoạt enzyme bằng
38 EDTA 25mM và cho mẫu qua cột để thu sản phẩm RNA có độ tinh sạch cao và không lẫn DNA.
Để kiểm tra và đánh giá đƣợc chúng tôi dùng các phƣơng pháp sau: - PCR với mẫu RNA tổng số với cặp mồi đặc trƣng cho gene il-2.
- Điện di so sánh kết quả trƣớc và sau khi loại DNA bằng enzyme DNaseI. - Thực hiện Real-time PCR với mẫu RNA để kiểm tra chất lƣợng của RNA có đảm bảo hay không.
a. Điện di kiểm tra mẫu RNA tổng số trước và sau khi xử lý loại DNA bằng enzyme DNaseI.
Mẫu RNA tổng số trƣớc và sau khi xử lý loại DNA đƣợc lấy từ tủ -80°C để tan từ từ trên đá và tiến hành điện di trên gel agarose 1,5%.
Qua ảnh điện di chúng ta thấy trên băng chạy số 1 là mẫu RNA chƣa đƣợc xử lý bằng enzyme DNaseI nên có nhiều dải băng chứng tỏ mẫu chƣa xử lý vẫn còn có nhiều DNA trong quá trình tách chiết. Ở băng chạy điện di thứ 2 là mẫu RNA tổng số đã đƣợc xử lý bằng enzyme DNaseI cho thấy, mẫu sản phẩm RNA tổng số sau
Hình 3.5. Điện di mẫu RNA tổng số trƣớc và sau khi xử lý loại DNA;1 - RNA
39 khi xử lý loại DNA và làm sạch qua cột RNeasy-mini của QiaGene có độ sạch cao hơn và vạch băng sáng rõ nét hơn.
b. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của DNA trong mẫu RNA tách chiết.
Khi mẫu RNA đã đƣợc xử lý bằng enzyme DNaseI thì các DNA lẫn sẽ bị phân giải hết, để khẳng định đƣợc điều này và đồng thời thử đánh giá sảm phẩm tách, chúng tôi tiến hành chạy PCR với cặp mồi đặc hiệu của gene il-2 để chứng minh mẫu có DNA hay không và chạy Real-time PCR để kiểm tra mRNA trong mẫu.
Kết quả thí nghiệm này sẽ cho chúng ta đánh giá đƣợc chất lƣợng của mẫu RNA về cả phƣơng diện mẫu có lẫn DNA hay không và mẫu có đủ tiêu chuẩn thực hiện phản ứng Real-time PCR hay không.
Mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris mang gene il-2 đƣợc tách chiết ở thời điểm 24 giờ đƣợc xử lý loại DNA, cho tiến hành phản ứng PCR và Real-time PCR, điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%. Chúng tôi tiến hành thí nhiệm với 7 mẫu nhƣ hình 3.6
Hình 3.6. Điện di sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA;1 - Sản
phẩm Real-time PCR mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris mang gene il-2; M: Marker DNA 1kb; 2,3 - Sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris
mang gene il-2 thời điểm 24h, 72h; 4, 5 - Sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris mang gene Amy thời điểm 24h, 72h; 6 - Sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số từ chủng P. pastoris control; 7 – Đối chứng âm.
40 Kết quả điện di cho thấy trên đƣờng chạy 1 là sản phẩm Real-time PCR với mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA cho sản phẩm là 1 băng sáng rõ nét. Điều này chứng tỏ chất lƣợng RNA tổng số chúng tôi thu đƣợc đảm bảo chất lƣợng cho chạy Real-time PCR. Còn trên đƣờng chạy số 2, 3 là sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA ở các chủng P. pastoris mang gene il-2. Trên đƣờng chạy 4,5 là sản phẩm PCR mẫu RNA tổng số sau xử lý loại DNA ở các chủng P. pastoris
mang gene mã hóa cho amylase. Các băng điện di không xuất hiện chứng tỏ không còn DNA trong mẫu RNA tổng số. Trên đƣờng chạy số 6 là chạy PCR với mẫu RNA tổng số của chủng control. Trên đƣờng chạy điện di số 7 là chạy Real-time PCR với mẫu con đối chứng âm không mang gene ngoại lai nên không có băng nào. Nhƣ vậy, mẫu RNA tổng số có độ tinh sạch cao và không bị lẫn DNA đủ điều kiện để tiến hành cho phản ứng Real-time PCR sau này.
3.2.3. Đo hàm lƣợng các mẫu RNA tổng số
Sản phẩm RNA tổng số để làm phản ứng Real-time PCR khi tách chiết là phải thu đƣợc lƣợng RNA vừa đủ với độ tinh khiết cao. Do đó sau khi đã tối ƣu đƣợc điều kiện tách chiết mẫu RNA tổng số và kiểm tra bằng điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Chúng tôi hành kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch thông qua hệ thống Thermo Scientific NanoDrop 2000.
Các phân tử nucleic acid (DNA và RNA) hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm, thông thƣờng các sản phẩm tách chiết RNA hay DNA sẽ có lẫn một lƣợng protein nhất định, nên khi đánh giá mức độ sạch và hàm lƣợng RNA trong mẫu tách chiết chúng ta dựa vào chỉ số A260/ A280. Một sản phẩm RNA hay DNA đƣợc coi là tinh kiết nếu chỉ số A260/ A280 nằm trong khoảng 1,8-2,0.
41
Bảng 3.1: Kết quả đo hàm lƣợng RNA bằng máy đo NanoDrop Mẫu Lần lên men 1 Lần lên men 2 Lần lên men 3
ng/µL A260/280 ng/µL A260/280 ng/µL A260/280 A-0h 471,12 2,17 913,80 2,21 391,02 2,20 A-6h 619,37 2,24 620,53 2,21 385,47 2,20 A-12h 324,97 2,20 614,46 2,21 326,78 2,22 A-24 585,05 2,23 142,87 2,20 507,42 2,23 A-48h 672,98 2,21 449,67 2,18 617,99 2,22 A-72h 521,02 2,19 1130,69 2,19 598,58 2,21 A-96h 742,32 2,20 631,76 2,20 466,49 2,19 C-0h 399,88 2,18 802,78 2,21 457,88 2,15 C-6h 470,05 2,15 730,30 2,19 408,68 2,18 C-12h 356,63 2,19 600,96 2,20 559,64 2,21 C-24h 566,20 2,22 35,59 2,30 470,52 2,15 C-48h 587,18 2,22 672,00 2,18 730,92 2,22 C-72h 593,21 2,19 982,23 2,20 408,52 2,21 C-96h 706,83 2,20 655,07 2,19 355,59 2,20 I-0h 581,65 2,23 717,58 2,21 361,24 2,18 I-6h 387,81 2,19 697,24 2,22 503,49 2,23 I-12h 320,96 2,20 604,04 2,22 776,55 2,22 I-24h 569,91 2,21 193,63 2,18 181,14 2,07 I-48h 686,00 2,23 1002,05 2,20 391,02 2,20 I-72h 704,15 2,21 1291,58 2,19 395,47 2,20