Phản ứng Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 đƣợc thực hiện với cặp mồi đặc hiệu cho gene MF(ALPHA)1. Chúng tôi khảo sát một mồi xuôi và 2 mồi ngƣợc.
Chƣơng trình chạy giống với gene IPP1, tuy nhiên đƣợc tiến hành ở nhiệt độ gắn mồi là 58°C và 59°C.
Quan sát băng điện di cho thấy, ở nhiệt độ gắn mồi là 58°C thì với cả 2 loại mồi ngƣợc đều cho sản phẩm Real-time PCR là vệt băng rõ nét đúng kích thƣớc. Tuy nhiên, quan sát thấy với mồi ngƣợc thứ nhất cho băng đậm hơn, kích thƣớc geneđúng với kích thƣớc của geneMF(ALPHA)1, chứng tỏ mồi ngƣợc này có độ đặc hiệu cao hơn và chính xác hơn. Do vậy, với phản ứng Real-time PCR tiến hành trên gene đích MF(ALPHA)1 sẽ sử dụng mồi ngƣợc thứ nhất và chƣơng trình chạy sử dụng nhiệt độ gắn mồi là 59°C.
Hình 3.8. Kết quả sản phẩm Real-time PCR với gene đích MF(ALPHA)1 sử dụng 2 loại mồi ngƣợc và ở 2 nhiệt độ gắn mồi 58°C và 59°C;M - Thang chuẩn
DNA 100 bp; 1 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ nhất ở 59°C; 2 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ nhất ở 58°C; 3 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ hai ở nhiệt độ 59°C; 4 - Phản ứng với mồi ngƣợc thứ hai ở nhiệt độ 58°C.
202
bp 200
bp
100
44
3.4. Kết quả Real-time PCR với gene nội chuẩn IPP1
Để so sánh tƣơng đối hàm lƣợng RNA của đoạn gene MF(ALPHA)1 của các chủng nấm men P. pastoris tại các thời điểm khác nhau, chúng tôi sử dụng phƣơng pháp Real-time PCR định lƣợng tƣơng đối. Trong thí nghiệm real time PCR định lƣợng tƣơng đối, các gene nội chuẩn thƣờng đƣợc sử dụng. Các gene nội chuẩn (reference gene hay internal standard) là các gene mà sự biểu hiện phiên mã của chúng là không đổi ở các trạng thái tế bào khác nhau. Trong Real-time PCR, biểu hiện của gene đích thƣờng đƣợc so sánh với sự biểu hiện của một gene nội chuẩn nào đó để loại bỏ sai số trong quá trình làm thí nghiệm.
Thực chất, việc tìm đƣợc một gene nội chuẩn tốt là rất khó. Một số nghiên cứu sâu về một số gene nội chuẩn truyền thống nhƣ GAPDH, GPD, PBGD, ACT1, cho thấy rằng thực tế các sự biểu hiện của các gene này không phải là không đổi ở các điều kiện khác nhau [32]. Bên cạnh đó, do geneome của P. pastoris mới đƣợc công bố cách đây không lâu, các nghiên cứu chuyên sâu về sự biểu hiện phiên mã còn hạn chế, việc tìm đƣợc một gene nội chuẩn tốt càng khó khăn.
Nhiều nghiên cứu về gene nội chuẩn ở P. pastoris và S. cerevisiae đã đƣợc sử dụng trƣớc đó nhƣ HPRT, PBGD, GAPDH, G6PDH, RPL10, ALG9, ARG4, UBC6, TAF10, IPP1, chúng tôi chỉ tìm thấy một gene duy nhất dƣờng nhƣ là phù hợp với yêu cầu là gene IPP1 mã hóa cytoplasmic inorganic pyrophosphatase. Trình tự của gene IPP1 ở P. pastoris và S. cerevisiae giống nhau khoảng 70%. Tuy nhiên, các bộ mẫu dò đặc hiệu cho gene IPP1 ở S. cerevisiae khá tƣơng thích với IPP1 ở
P. pastoris.
Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm với gene đích cần nghiên cứu là MF(ALPHA)1, chúng tôi đã thực hiện Real-time PCR nhằm nghiên cứu sự biểu hiện của gene nội chuẩn IPP1 trong các chủng control, Amy và IL-2 tại các thời điểm nghiên cứu 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ (Hình 3.9, Hình 3.10, Bảng 3.3).
45 1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, 6 - Mẫu phản ứng của chủng Amylase tại 0, 24 và 48h; 7, 10, 11 - Mẫu phản ứng của chủng Control tại 0, 24 và 48h.
Hình 3.9: Biểu đồ khuếch đại gene IPP1 của các mẫu trong Real-time PCR;
Hình 3.10: Biểu đồ đỉnh nóng chảy sản phẩm khuếch đại gene IPP1 trong Real-time PCR; 1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, 6 - Mẫu phản ứng của chủng
Amylase tại 0, 24 và 48h; 7, 10, 11 - Mẫu phản ứng của chủng Control tại 0, 24 và 48h; 12, 15, 16 - Mẫu phản ứng của chủng IL-2 tại 0, 24 và 48h.
46
Bảng 3.2: Giá trị chu kỳ ngƣỡng trong Real-time PCR kiểm tra sự biểu hiện của gene nội chuẩn IPP1 ở các chủng P. pastoris nghiên cứu ở các thời
điểm khác nhau của quá trình lên men Chu kỳ ngƣỡng (Ct) Mẫu Lên men lần I Lên men lần II
Control 0h 16.35 16.51 24 h 18.47 18.67 48 h 20.21 19.79 Amy 0h 15.96 16.55 24 h 18.64 18.51 48 h 20.43 19.65 IL-2 0 h 14.91 16.51 24 h 18.79 18.91 48 h 19.26 20.09
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần với mẫu RNA đƣợc tách chiết từ các lần lên men khác nhau. Kết quả cho thấy rằng sự biểu hiện của gene nội chuẩn trên thực tế không đƣợc nhƣ mong muốn (Bảng 3.2). Cụ thể là, so với thời điểm 0 giờ, ở chủng control và chủng Amy, sự biểu hiện gene IPP1 giảm khoảng 5 lần tại thời điểm 24 giờ và khoảng 10 lần tại thời điểm 48 giờ. Bên cạnh đó, ở chủng IL-2 biểu hiện phiên mã của gene IPP1 cũng giảm hơn 10 lần ở thời điểm 24 giờ và 48 giờ khi so sánh với thời điểm 0 giờ. Do sự biểu hiện của gene IPP1 có thay đổi theo thời gian, thực chất gene này không phù hợp với tiêu chuẩn của gene nội chuẩn.
Khi không tìm đƣợc gene nội chuẩn thích hợp, một số nhà nghiên cứu cũng đã tiến hành Real-time PCR mà không dùng gene nội chuẩn [29]. Từ thực tế thí nghiệm, chúng tôi quyết định tiến hành thí nghiệm Real-time PCR định lƣợng tƣơng đối biểu hiện đoạn gene MF(ALPHA)1 không dùng gene nội chuẩn. Thay vào đó, chúng tôi cố gắng chuẩn hóa các điều kiện thí nghiệm để loại bỏ các sai số hệ thống.
3.5. Real-time PCR về biểu hiện của gene MF(ALPHA)1
Do không tìm đƣợc gen nội chuẩn để so sánh sự biểu hiện gen giữa các chủng
47
MF(ALPHA)1 đƣợc chúng tôi tiến hành chạy Real-time PCR 3 lần với các mẫu RNA của các chủng control, amy, Il-2 và đối chứng.
3.5.1. Kết quả Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Giá trị chu kỳ ngƣỡng phụ thuộc rất lớn vào nồng độ DNA đích và đƣờng nên huỳnh quang. Những sự khác biệt đó sẽ ảnh hƣởng tới đƣờng cong khuếch đại và đƣợc ghi lại.
Dựa vào biểu đồ trên ta có thể thấy ở các chủng mang gene ngoại lai interleukin-2 và amylase, có đƣờng cong khuếch đại đi vào pha log rất sớm từ chu kỳ thứ 12 đến chu kỳ thứ 15 với các mẫu A-0h, A-6h, A-12h, A-24h, A-48h, A-72h, A-96h và I-0h, I-6h, I-12h, I-24h, I-48h, I-72h, I-96h, với cƣờng độ huỳnh quanh nhận giá trị khá cao gần 5,6. Riêng với mẫu A3-0h và I3-0h pha log đi chậm hơn ở chu kỳ 18 của phản ứng, điều này đƣợc gải thích là do tại thời điểm 0h các gene ngoại lai mới đƣợc cảm ứng nên số lƣơng phân tử RNA đƣợc tạo ra ít. Ở chủng đối chứng và các chủng control đi vào pha log rất chậm sau chu kỳ thứ 25, cƣờng độ huỳnh quang thu nhận đƣợc chỉ đạt khoảng thấp hơn các chủng khác.
Biểu đồ (Hình 3.11) đã cho chúng ta thấy sự khác biệt rất rõ ràng ở hai nhóm chủng mang gene ngoại lai và chủng không mang gene ngoại lại và cho thấy sự phụ thuộc tuyến tính mức độ biểu hiện của gene MF(ALPHA)1 với mức độ biểu hiện của các gene ngoại lai (il-2 và amy).
Kết quả trên phản ánh đúng với những đánh giá biểu hiện protein ở phần 3.1 của chƣơng này. Kết quả điện di protein đều cho thấy ở thời điểm 0h chƣa có protein ngoại lai đƣợc tạo ra. Nhƣng khi phân tích bằng Real-time PCR chúng ta nhận thấy rất rõ các chủng A-0h và I-0h có đƣờng khuếch đại đi vào pha log sớm hơn hẳn (ở chu kỳ thứ 20,55 và 19,84) so với các chủng đối chứng và control (khoảng chu kỳ 25,85 -26,07). Điều này chứng tỏ ở thời điểm 0h tế bào nấm men đã đáp ứng cảm ứng methanol để tạo ra các phân tử mRNA nhiều hơn ở các chủng không mang gene ngoại lai. Điều này chứng tỏ các gene ngoại lai có ảnh hƣởng mạnh tới sự biểu hiện của các gene trong promoter AOX1, qua đấy cũng chứng tỏ
48 khả năng hoạt động mạnh của promoter AOX1. Tuy nhiên do tại thời điểm này chƣa biểu hiện thành protein nên kỹ thuật phân tích protein không thể phát hiện đƣợc.
Biểu đồ đỉnh nóng chảy (Hình 3.12) cho thấy mẫu đối chứng âm và các mẫu phản ứng của chủng control tại tất cả các thời điểm có chung một điểm nóng chảy ở khoảng trên 74°C, là đỉnh nóng chảy của sản phẩm primer dimers khi không có RNA. Ngƣợc lại, các mẫu của chủng P. Pastoris mang geneAmy và gene IL-2 chỉ cho thấy một đỉnh nóng chảy duy nhất ở khoảng 80°C, là đỉnh nóng chảy của sản phẩm khuếch đại Real-time PCR đoạn gene MF(ALPHA)1.
Hình 3.11: Biểu đồ khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1 của các mẫu nghiên cứu trong real time PCR;1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, 6 - Mẫu phản ứng của
chủng Amylase tại 0, 24 và 48h; 9, 12, 13 - Mẫu phản ứng của chủng Control tại 0, 24 và 48h; 16, 19, 20 - Mẫu phản ứng của chủng IL-2 tại 0, 24 và 48h.
49 Cuối cùng chúng tôi tiến hành kiểm tra sản phẩm của phẩn ứng Real-time PCR bằng cách điện di trên gel agarose 1% (hình 3.13).
Hình 3.12: Biểu đồ đỉnh chảy sản phẩm khuếch đại đoạn gene MF(ALPHA)1
của các mẫu nghiên cứu trong real time PCR; 1 - Đối chứng âm (nƣớc); 2, 5, 6 -
Mẫu phản ứng của chủng Amylase tại 0, 24 và 48h; 9, 12, 13 - Mẫu phản ứng của chủng Control tại 0, 24 và 48h; 16, 19, 20 - Mẫu phản ứng của chủng IL-2 tại 0, 24 và 48h.
Hình 3.13: Kết quả điện di sản phẩm phản ứng Real-time PCR với đoạn geneMF(ALPHA)1 ở các mẫu phản ứng
50 Kết quả ảnh điện di sản phẩm Real-time PCR trên gel agarose 1% cho thấy các geneMF(ALPHA)1 đƣợc nhân lên ở các chủng P. Pastoris mang gene Amy và Il-2 và. Kết quả này phù hợp với kết quả phân tích đỉnh nóng chảy bên trên. Điều này một lần nữa khẳng định tính chính xác của kỹ thuật Real-time PCR.
3.5.2. Phân tích so sánh mức độ biểu hiện geneMF(ALPHA)1
Giái trị Ct phản ánh số lƣợng DNA đích ban đầu của mẫu do đó chúng ta có thể so sánh đƣợc số lƣợng DNA đích của các mẫu với nhau. Để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm chúng tôi tiến hành phản ứng Real-time PCR ba lần và lấy giá trị trung bình (bảng 3.3).
Bảng 3.3: Giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình trong Real-time PCR của geneMF(ALPHA)1 ở các chủng P. pastoris ở các thời điểm lên men Thời điểm thu mẫu Giá trị Ct trung bình
Control Amy IL-2
0h 25,60 ± 1,41 20,70 ± 0,26 20,02 ± 0,23 6h 26,77 ± 0,90 14,75 ± 0,48 16,26 ± 1,19 12h 26,56 ± 0,98 15,22 ± 0,47 15,61 ± 0,77 24h 26,40 ± 0,59 15,96 ± 0,78 16,84 ± 0,83 48h 26,52 ± 0,89 16,45 ± 0,31 17,01 ± 0,72 72h 26,51 ± 0,90 16,65 ± 0,35 17,19 ± 0,53 96h 26,72 ± 1,00 17,16 ± 0,35 17,64 ± 0,65
3.5.2.1. So sánh mức độ biểu hiện của gene theo thời gian lên men trong từng chủng
Phản ứng khuếch đại bằng Real-time PCR diễn ra theo cấp số nhân, do đó các mẫu có chu kỳ ngƣỡng chênh nhau 1 đơn vị tƣơng đƣơng với sự khác biệt khoảng 2 lần về hàm lƣợng RNA của gene đích. Trong thí nghiệm của chúng tôi, việc so sánh lƣợng RNA trong các mẫu thí nghiệm đƣợc tiến hành phƣơng pháp định lƣợng tƣơng đối dựa trên đơn vị khối lƣợng. Tỷ lệ lƣợng RNA giữa mẫu thử và mẫu đối chứng đƣợc tính theo công thức: Tỷ lệ mẫu thử/đối chứng = 2Ct(C)-Ct(T) . Trong đó,
51 Ct(C) là chu kỳ ngƣỡng của mẫu đối chứng, và Ct(T) là chu kỳ ngƣỡng của mẫu thí nghiệm.
Đoạn geneMF(ALPHA)1 và gene tái tổ hợp (Amy/IL-2) đều chịu sự điều hòa bởi AOX1 promoter. Do mRNA của tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 gắn liền với mRNA của gene ngoại lai, sự khác biệt về tín hiệu tiết có thể coi nhƣ là sự phản ánh khác biệt về mức độ biểu hiện protein ngoại lai ở các chủng khác nhau.
Qua bảng 3.5trên ta thấy chủng nấm men P. pastoris biểu hiện amylase, tín hiệu tiết α đã đƣợc biểu hiện tại thời điểm 0 giờ, sau đó tăng lên rất cao ở 6 giờ (tới 61,8 lần) rồi giảm dần theo thời gian. Tƣơng tự, ở bảng 3.3 ta thấy ở chủng nấm men P. pastoris biểu hiện Interleukin-2, geneMF(ALPHA)1 đã đƣợc biểu hiện tại thời điểm 0 giờ.So với chủng Amy, lƣợng mRNA của đoạn geneMF(ALPHA)1 ở chủng IL-2 cao khoảng 13,55 lần ở 6 giờ; và tiếp tục tăng mạnh tới 21,36 ở thời điểm 24 giờ. Đồng thời, phân tích Real-time PCR cũng cho thấy rằng lƣợng mRNA tín hiệu tiết MF(ALPHA)1 ở các IL-2 và Amy là khác nhau.
Những sự khác nhau kể trên là bằng chứng cho thấy có sự khác nhau đáng kể về thời gian và mức độ biểu hiện của hai geneAmy và geneIL-2 khi đƣợc biểu hiện trên P. pastoris. Sự khác nhau này có thể có nhiều nguyên nhân: do sự tƣơng tác giữa gene biểu hiện và MF(ALPHA)1, do sự khác nhau về hiệu quả biểu hiện của mỗi gene khi chịu sự điều hòa của promoter AOX1, do kích thƣớc khác nhau của hai gene, do vai trò khác nhau của hai gene đối với bản thân tế bào P. pastoris khi biểu hiện…
52
Bảng 3.4: Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P. pastoris control theo giá trị chu kỳ ngƣỡng trung bình
So sánh Control 0h 6h 12h 24h 48h 72h 6h 0,30 - - - - - 12h 0,34 1,16 - - - - 24h 0,38 1,29 1,11 - - - 48h 0,35 1,19 1,03 0,92 - - 72h 0,36 1,20 1,04 0,93 1,01 - 96h 0,31 1,04 0,90 0,80 0,87 0,86
Bảng 3.5: Tỷ lệ khác biệt của gene MF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P. pastoris mang gene mã hóa cho amylase theo giá trị chu kỳ
ngƣỡng trung bình Thời gian thu mẫu Amy 0h 6h 12h 24h 48h 72h 6h 61,82 - - - - - 12h 44,74 0,72 - - - - 24h 26,78 0,43 0,60 - - - 48h 19,03 0,31 0,43 0,71 - - 72h 16,60 0,27 0,37 0,62 0,87 - 96h 11,67 0,19 0,26 0,44 0,61 1,42 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.6: Tỷ lệ khác biệt của geneMF(ALPHA)1 theo thời gian của cùng một chủng P. pastoris mang gene mã hóa cho interleukin-2 theo giá trị chu kỳ
ngƣỡng trung bình Thời gian thu mẫu IL-2 0h 6h 12h 24h 48h 72h 6h 13,55 - - - - - 12h 21,26 1,57 - - - - 24h 9,04 0,67 0,43 - - - 48h 8,07 0,60 0,38 0,89 - - 72h 7,11 0,52 0,33 0,79 0,88 - 96h 5,21 0,38 0,24 0,58 0,64 0,73
53
3.5.2.2. So sánh mức độ biểu hiện của geneMF(ALPHA)1 theo thông số về chủng.
Tƣơng tự nhƣcách so sánh ở trong từng chủng, chúng tôi so sánh mức độ biểu hiện của geneMF(ALPHA)1 giữa các chủng với nhau. Kết qủa đƣợc thể hiện trên (Hình 3.14).Ở thời điểm 0 giờ, lƣợng mRNA của geneMF(ALPHA)1 trong chủng P. Pastoris mang gen ngoại lai Amy và IL-2 có tỷ lệ khác biệt là 1 và 1,6 tƣơng ứng, tiếp đến thời điểm 6 giờ giá trị này ở chủng Amy tăng cao 61,8 đạt giá trị cao nhất và sau đó giảm dần ở các thời điểm lấy mẫu tiếp theo, trong khi đó, ở chủng sinh IL-2 ở thời điểm 6 giờ đạt 21,7 và cao nhất ở thời điểm 12 giờ nhƣng chỉ đạt 34,1 rồi giảm dần ở các thời điểm sau đó.
3.6. So sánh kết quả Real-time PCR và Microarray
Khi phân tích biểu hiện của tất cả các gene có thể đƣợc tạm đánh giá bằng các kỹ thuật microarray, để phát hiện ra những thay đổi trong mẫu và lựa chọn các gene thay đổi đó. Nhƣng sự biểu hiện của gene đƣợc lựa chọn có thể đƣợc đo với độ chính xác rất cao bởi Real-time PCR.
Phân tích Real-time PCR đều cho ra các kết quả khá tƣơng đồng nhau về xu hƣớng biểu hiện của đoạn geneMF(ALPHA)1 ở các chủng nghiên cứu. Cụ thể là biểu hiện của chủng control tại các thời điểm rất thấp so với chủng Amy và IL-2.
Hình 3.14: Biểu đồ so sánh mức độ biểu hiện của đoạn geneMF(ALPHA)1giữa các
chủng P. Pastoris tái tổ hợp; A- Chủng P. Pastoris mang gene mã hóa amylase; C-