Phân lập, nhân nuôi in vitro và bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò

i B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I - ð - TRUNG KIÊN PHÂN L P, NHÂN NUÔI IN VITRO VÀ B O QU N L NH T BÀO BI U MƠ NG D N TR NG BỊ LU N VĂN TH C SĨ NÔNG NGHI P Hà N i, năm 2013 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… i ii B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TRƯ NG ð I H C NÔNG NGHI P HÀ N I - ð - TRUNG KIÊN PHÂN L P, NHÂN NUÔI IN VITRO VÀ B O QU N L NH T BÀO BI U MÔ NG D N TR NG BÒ LU N VĂN TH C SĨ NƠNG NGHI P Chun ngành: Cơng ngh Sinh h c Mã s : 60420201 NGƯ I HƯ NG D N KHOA H C: TS NGUY N H U ð C B mơn Cơng ngh sinh h c đ ng v t Khoa Công ngh sinh h c Hà N i, năm 2013 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ii i L I CAM ðOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên c u c a tơi Các s li u k t qu nêu lu n văn trung th c chưa t ng đư c cơng b b t kì cơng trình nghiên c u khác Tơi xin cam đoan r ng thơng tin trích d n lu n văn ñ u ñã ñư c ch rõ ngu n g c Tác gi lu n văn ð Trung Kiên Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… i ii L I C M ƠN Trong su t trình th c hi n lu n văn, xin trân tr ng bày t lịng bi t ơn sâu s c đ n TS Nguy n H u ð c – Phó Trư ng Khoa Công ngh sinh h c, Trư ng B mơn Cơng ngh sinh h c đ ng v t – ð i h c Nông nghi p Hà N i ln t n tình giúp đ , hư ng d n, ñ ng th i b i dư ng cho nh ng ki n th c chuyên môn kinh nghi m quý báu ð th c hi n đư c nghiên c u này, tơi xin chân thành c m ơn s tài tr t ñ tài c p B Giáo d c ðào t o: “Nâng cao hi u qu t o phôi bò th tinh ng nghi m b ng k thu t nuôi c y chung v i t bào ng d n tr ng” (mã s B2011-11-01) ñ tài c p Nhà nư c “ ng d ng công ngh c y chuy n phơi bị s a cao s n t i Tây Nguyên” (mã s TN3/CO2) ð th c hi n ñư c nghiên c u này, tơi xin c m ơn s giúp đ c a nghiên c u viên, k thu t viên phịng Cơng ngh phơi thu c Vi n Cơng ngh sinh h c – Vi n Hàn lâm Khoa h c Công ngh Vi t Nam cán b Vi n Nghiên c u khoa h c Tây Nguyên – Vi n Hàn lâm Khoa h c Cơng ngh Vi t Nam V i tình c m sâu s c, xin c m ơn s ng h giúp đ c a Th y, Cơ giáo thu c B môn Công ngh sinh h c ñ ng v t – Khoa Công ngh sinh h c – ð i h c Nông nghi p Hà N i trình th c hi n nghiên c u t i ñơn v ð vi c thu m u ph c v cho nghiên c u thu n l i, tơi xin c m ơn tồn th anh, ch em cơng nhân lị m gia súc quanh ngo i thành Hà N i khu v c lân c n, ñ c bi t anh Nguy n Xn Chi u – cơng nhân lị m thôn C ði n – xã H i B i – huy n ðơng Anh t n tình giúp đ ð hồn thành lu n văn này, tơi xin bày t lòng bi t ơn t i Ban lãnh đ o; Th y, Cơ giáo trư ng Cao ñ ng Th y s n – T Sơn – B c Ninh, Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… ii iii nơi công tác Cu i cùng, xin c m ơn Th y, Cô giáo; chuyên viên Ban qu n lý ñào t o – ð i h c Nông nghi p Hà N i ñã ng h , t o ñi u ki n giúp đ tơi hồn thành th t c c n thi t đ b o v thành cơng lu n văn Hà N i, tháng năm 2013 Tác gi lu n văn ð Trung Kiên Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iii iv M CL C Trang ph bìa L I CAM ðOAN i L I C M ƠN ii DANH M C CÁC KÝ HI U, CÁC CH VI T T T .vii DANH M C CÁC B NG viii DANH M C CÁC HÌNH ix M ð U Chương - T NG QUAN TÀI LI U .4 1.1 T ng quan quan sinh s n bò cái, ng d n tr ng l p bi u mô t bào ng d n tr ng 1.1.1 Cơ quan sinh s n bò 1.1.2 ng d n tr ng bò 1.1.3 L p bi u mô t bào ng d n tr ng 1.2 K thu t ni c y in vitro t bào đ ng v t có vú 10 1.2.1 ð c ñi m c a t bào ñ ng v t 10 1.2.2 Ni c y t bào đ ng v t 11 1.2.3 Mơi trư ng ni c y t bào đ ng v t 14 1.2.4 Ki m sốt nhi m ni c y t bào 16 1.3 K thu t đơng l nh t bào đ ng v t 19 1.3.1 Khái ni m 19 1.3.2 M c đích c a k thu t đơng l nh 19 1.3.3 Các bi n ñ i c a t bào b o qu n b ng phương pháp đơng l nh 20 1.3.4 Ch t b o qu n đơng l nh 22 1.3.5 Quy trình thu nh n t bào đ ñông l nh 24 1.3.6 Các phương pháp đơng l nh 25 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… iv v 1.4 K thu t gi i đơng t bào ñ ng v t 27 1.5 Phân l p, nhân nuôi in vitro b o qu n l nh t bào bi u mô ng d n tr ng 27 1.5.1 Lư c s nghiên c u 27 1.5.2 Phương pháp phân l p, nuôi c y t bào bi u mô ng d n tr ng 28 1.5.3 Các lo i mơi trư ng ni đư c s d ng v i l p ñơn t bào bi u mô ng d n tr ng 29 1.5.4 B o qu n l nh t bào bi u mô ng d n tr ng 30 1.6 nh hư ng c a vi c b sung t bào bi u mô ng d n tr ng vào mơi trư ng ni phơi bị 30 1.6.1 Vi môi trư ng ng d n tr ng 30 1.6.2 ð ng nuôi c y phôi v i t bào bi u mô ng d n tr ng bị 32 1.7 Tình hình nghiên c u nư c 36 1.7.1 Tình hình nghiên c u ngồi nư c 36 1.7.2 Tình hình nghiên c u nư c 38 Chương - ð I TƯ NG, N I DUNG, ð A ðI M VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 40 2.1 ð i tư ng nghiên c u 40 2.2 N i dung nghiên c u 40 2.3 ð a ñi m nghiên c u 40 2.4 Phương pháp nghiên c u 41 2.4.1 Tiêu chí l a ch n phương pháp, trang thi t b hóa ch t 41 2.4.2 Thu b o qu n ng d n tr ng bò 42 2.4.3 X lý ng d n tr ng bị t i phịng thí nghi m 42 2.4.4 Phân l p t bào bi u mô ng d n tr ng 42 2.4.5 Nuôi c y ng nghi m t bào bi u mô ng d n tr ng 43 2.4.6 Phương pháp ñ m t bào 44 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… v vi 2.4.7 T o l p ñơn t bào bi u mô ng d n tr ng 45 2.4.8 ðông l nh t bào bi u mô ng d n tr ng 45 2.4.9 Gi i đơng ki m tra kh phát tri n in vitro c a t bào bi u mô ng d n tr ng 46 2.4.10 Ch n dòng t bào 47 2.4.11 X lý s li u 47 Chương - K T QU VÀ TH O LU N 48 3.1 Phân l p t bào bi u mô ng d n tr ng 48 3.2 Kh phát tri n in vitro c a t bào bi u mô ng d n tr ng 60 3.3 Kh b o qu n l nh t bào bi u mô ng d n tr ng 70 3.4 nh hư ng c a t bào bi u mô ng d n tr ng ñ n s phát tri n in vitro c a phơi bị 76 K T LU N VÀ KI N NGH 83 TÀI LI U THAM KH O 84 PH L C: Bài báo ñang in 2013 (T p chí Cơng ngh Sinh h c) 95 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vi vii DANH M C CÁC KÝ HI U, CÁC CH BME VI T T T Bassal Medium Eagle BO Bracket and Oliphant’s medium BOECs Bovine Oviduct Epithelial Cells BSA cs Bovine Serum Albumin c ng s D’MEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl Sulfoxide E’MEM Eagle Medium Essential Medium FCS Fetal Calf Serum IVF In Vitro Fertilization IVM In Vitro Maturation OCS Oestrus Cow Serum LH Luteinizing Hormone PBS Phosphate Buffered Saline SOF Synthetic Oviductal Fluid TCM 199 Tissue Culture Medium 199 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… vii viii DANH M C CÁC B NG B ng 1.1 M t s lo i môi trư ng ph bi n nuôi c y t bào ñ ng v t 15 B ng 3.1 Thành ph n môi trư ng PBS 50 B ng 3.2 Thành ph n môi trư ng D’MEM 63 B ng 3.3 Thành ph n môi trư ng BO 77 B ng 3.4 Thành ph n môi trư ng TCM 199 79 B ng 3.5 Kh phát tri n c a phôi bị th tinh ng nghi m mơi trư ng TCM 199 có khơng b sung t bào bi u mô ng d n tr ng 81 Trư ng ð i h c Nông nghi p Hà N i – Lu n văn th c s khoa h c Nông nghi p ……………………… viii 81 Sau th tinh phơi gi đ nh đư c chuy n vào đĩa ni có mơi trư ng TCM 199, b sung 10% huy t bào thai bê, có ho c khơng có l p đơn t bào bi u mô ng d n tr ng K t qu s phơi giai đo n 2-4 t bào, 4-8 t bào phơi dâu-phơi nang đư c trình bày b ng 3.5 Hình 3.39 Mơi trư ng TCM 199 B ng 3.5 Kh phát tri n c a phơi bị th tinh ng nghi m mơi trư ng TCM 199 có khơng b sung t bào bi u mô ng d n tr ng Môi trư ng nuôi phôi Phôi dâu- t bào t bào Phôi nang (%) (%) (%) 245 69,39 54,71 17,20 a (170/245) mô ng d n tr ng Phôi 4-8 th c (n) TCM 199+t bào bi u Phôi 2-4 thành TCM 199 Tr ng (93/170) (16/93) 70,34 53,61 30,34 b (166/236) (89/166) (27/89) 236 Ghi chú: Các ký hi u a, b ñư c dùng ñ bi u di n s sai khác có ý nghĩa th ng kê gi a nhóm thí nghi m (so sánh c t) (P0,05); t l phôi giai đo n 4-8 t bào hai mơi trư ng nói l n lư t 54,71% 53,61% (P>0,05); mơi trư ng có b sung t bào bi u mơ ng d n tr ng t l phơi phát tri n đ n giai đo n phơi dâu-phơi nang cao có ý nghĩa th ng kê (P