L ỜI CẢM ƠN
3.4. Ảnh hưởng của tếbào biểu mô ống dẫn trứng ñế n sự phát triển in
vitro của phôi bò
Thắ nghiệm này ựược tiến hành nhằm ựánh giá ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào ống dẫn trứng trong môi trường nuôi ựến sự phát triển in vitro của phôi bò thụ tinh trong ống nghiệm.
Trứng ựược nuôi thành thục theo phương pháp của Nguyễn Hữu đức và cs (2003b) [17]. Chọn lọc tinh trùng khỏe, có chất lượng tốt trong môi trường Brackett-Oliphant (BO) bằng phương pháp bơi ngược (Swim-up) theo phương pháp của Parrish và cs (1989) [52].
Thụ tinh trong ống nghiệm giữa trứng bò ựã thành thục và tinh trùng chọn lọc diễn ra trong tủ nuôi Sanyo ở ựiều kiện 5% CO2, 39ỨC, ựộ ẩm bão hòa theo phương pháp của Nguyễn Hữu đức và cs (2003b) [17]. Môi trường thụ tinh là môi trường BO có bổ sung 1,0 ộM Epinepherine, 10 ộM Hypotaurine, 20 ộM Penicillamine, 10 ộg/ml Heparine.
Tế bào biểu mô ống dẫn trứng sau ựông lạnh 01 tháng ựược giải ựông và nuôi cấy tiếp tục. Sau thời gian nuôi cấy ựã trình bày ở phần phương pháp
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 77 nghiên cứu, chọn cụm tế bào phát triển tốt. Theo dõi sự phát triển tiếp theo của cụm tế bào nhân nuôi ựể tạo dòng tế bào, sau ựó ựông lạnh dòng tế bào này trước khi dùng chúng ựể bổ sung vào môi trường nuôi phôi bò thụ tinh trong ống nghiệm.
Toàn bộ quá trình trên có khống chế nhiệt ựộ 37ỨC bằng ựĩa nhiệt Tokai-Hit (Nhật Bản), ựĩa này ựặt ngay trên kắnh hiển vi.
Phôi ựược nuôi trong môi trường TCM 199 bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FCS), có và không có bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng. Quan sát và ghi nhận số phôi ở giai ựoạn 2-4 tế bào, 4-8 tế bào, phôi dâu-phôi nang trên kắnh hiển vi soi nổi Nikon SMZ1000 có bàn ấm Tokai-Hit (37ỨC).
Bảng 3.3. Thành phần môi trường BO (dùng pha 01 lắt) ỘNguồn: http://www.invitrogen.com [78]Ợ Hóa chất Lượng NaCl 6,55 g KCL 0,3 g CaCl2.2H2O 0,33 g NaH2PO4.H2O 0,113 g MgCl2.6H2O 0,106 g NaHCO3 3,104 g Glucose 3,5 g Natri pyruvate 0,137 g
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 78 Hình 3.37. đĩa nhiệt Tokai-Hit ựược khống chế nhiệt ựộ 37ỨC
Hình 3.38. Chọn dòng tế bào trên kắnh hiển vi phản pha Nikon Ti-U có gắn bộ vi thao tác Narishige
Môi trường TCM 199 (Tissue Culture Medium 199) gồm tập hợp của nhiều chất gồm các vitamin, amino acid và các chất có tác dụng kắch thắch sinh trưởng có khả năng nuôi ựược tế bào ngoài cơ thể. Ngày nay, môi trường TCM 199 ựã ựược phát triển ra nhiều môi trường khác nhau (10 môi trường) ựể phù hợp với từng mục ựắch nghiên cứu như nuôi tế bào, nuôi phôi, chế vắc xinẦMôi trường ựể nuôi thành thục trứng bò in vitro và nuôi phôi thụ tinh trong ống nghiệm có tên là Medium 4530 (M4530 dạng dung dịch) bao gồm 8 loại muối khác nhau chiếm ựa số khối lượng, 21 loại amino acid và 17 loại
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 79 vitamin khác nhau với một lượng rất nhỏ. đây cũng là môi trường phổ biến dùng trong ựược áp dụng tại các phòng thắ nghiệm phôi và tế bào ựộng vật trên thế giới.
Bảng 3.4. Thành phần môi trường TCM 199 (M4530) (dùng pha 01 lắt) ỘNguồn: http://www.sigmaaldrich.com [82]Ợ
Thành phần Lượng (gram)
Thành phần Lượng (gram)
Muối vô cơ Amino acid
CaCl2.2H2O 0,22 L-Histidine+HCl+H2O 0,02188 Fe(NO3)3+9H2O 0,00072 Hydroxy-L-Proline 0,01
MgSO4 (anhydrous) 0,09767 L-Isoleucine 0,02
KCl 0,4 L-Leucine 0,06
Na acetate (anhydrous) 0,05 L-Lysine+HCl 0,07
NaHCO3 2,2 L-Methionine 0,015
NaCl 6,8 L-Phenylalanine 0,025
NaH2PO4 (anhydrous) 0,122 L-Proline 0,04
Amino acid L-Serine 0,025
L-Alanine 0,025 L-Threonine 0,03
L-Arginine+HCl 0,07 L-Tryptophan 0,01
L-Aspartic acid 0,03 L-Tyrosine+2Na+2H2O 0,05766
L-Cystine+HCl+H2O 0,00011 L-Valine 0,025
L-Cysteine+2HCl 0,026
L-Glutamic acid 0,0668
L-Glutamine 0,1
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 80 Thành phần Lượng (gram) Thành phần Lượng (gram) Vitamin Các thành phần khác
Ascorbic acid+Na 0,0000566 Adenine sulphate 0,01
D-Biotin 0,00001 Adenosine triphosphate+2Na 0,001 Calciteron 0,0001 Adenosine monophosphate+Na 0,0002385
Choline Chloride 0,0005 Cholesteron 0,0002
Folic acid 0,00001 Deoxyribose 0,0005
Menadione (sodium blsulfide)
0,000016 Glucose 1
myo-Inositol 0,00005 Glutathionine (reduced) 0,00005
Niacinamide 0,000025 Guanine+HCl 0,0003
Nicotinic acid 0,000025 Phenol red+Na 0,0213
p-Amino Benzoic acid 0,00005 TWEEN 80 0,02
D-Pantothenic acid+1/2 Na
0,00001 Ribose 0,0005
Pyridoxal+HCl 0,000025 Thymine 0,0003
Pyridoxine+HCl 0,000025 Uracil 0,0003
Retinol acetate 0,000014 Xanthine+Na 0,000344
Riboflavin 0,00001
DL-α-Tocopherol phosphate+Na
0,00001
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 81 Sau khi thụ tinh các phôi giả ựịnh ựược chuyển vào các ựĩa nuôi có môi trường TCM 199, bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê, có hoặc không có lớp ựơn tế bào biểu mô ống dẫn trứng. Kết quả số phôi ở giai ựoạn 2-4 tế bào, 4-8 tế bào và phôi dâu-phôi nang ựược trình bày trong bảng 3.5.
Hình 3.39. Môi trường TCM 199
Bảng 3.5. Khả năng phát triển của phôi bò thụ tinh ống nghiệm trong môi trường TCM 199 có và không bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng Môi trường nuôi phôi Trứng
thành thục (n) Phôi 2-4 tế bào (%) Phôi 4-8 tế bào (%) Phôi dâu- Phôi nang (%) TCM 199 245 69,39 (170/245) 54,71 (93/170) 17,20 a (16/93) TCM 199+tế bào biểu mô ống dẫn trứng 236 70,34 (166/236) 53,61 (89/166) 30,34 b (27/89)
Ghi chú: Các ký hiệu a, b ựược dùng ựể biểu diễn sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm thắ nghiệm (so sánh cột) (P<0,01).
Kết quả ở bảng 3.5 cho thấy phôi thụ tinh trong ống nghiệm phát triển tốt hơn trong môi trường có bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng: tỉ lệ phôi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 82 ở giai ựoạn 2-4 tế bào ở môi trường TCM 199 không và có bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng lần lượt là 69,39% và 70,34% (P>0,05); tỉ lệ phôi ở giai ựoạn 4-8 tế bào ở hai môi trường nói trên lần lượt là 54,71% và 53,61% (P>0,05); nhưng trong môi trường có bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng thì tỉ lệ phôi phát triển ựến giai ựoạn phôi dâu-phôi nang là cao hơn có ý nghĩa thống kê (P<0,01), cụ thể trong môi trường TCM 199 có bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng thì tỉ lệ phôi dâu-phôi nang thu ựược là 30,34%, trong khi ựó tỉ lệ này ở môi trường TCM 199 không bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng chỉ ựạt 17,20%.
Kết quả này phù hợp với kết quả của một số tác giả trên thế giới khi nghiên cứu vấn ựề này. Cụ thể, tỉ lệ phôi dâu-phôi nang trong môi trường có bổ sung tế bào ống dẫn trứng cao hơn có ý nghĩa thống kê (dao ựộng 22,55%- 34,62%) (P<0,01) so với kết quả thu nhận trong môi trường không bổ sung ống dẫn trứng (15,70%-19,32%) (Eyestone và First, 1986 [21]; Lu và Gordon, 1987 [40]).
Như vậy tế bào biểu mô ống dẫn trứng có ảnh hưởng dương tắnh ựến sự phát triển của phôi bò thụ tinh trong ống nghiệm.
Ống dẫn trứng bò chắnh là một vi môi trường thắch hợp cho quá trình thành thục cuối cùng của trứng, thắch hợp cho sự thụ tinh, ựồng thời ựó cũng chắnh là vi môi trường thuận lợi cho sự phát triển của phôi giai ựoạn sớm. Việc tạo lớp ựơn tế bào biểu mô ống dẫn trứng tiến hành cũng nhằm mục ựắch trên, ựó là tạo một vi môi trường thuận lợi như ựã nói, chỉ khác là ở ựiều kiện
in vitro mà thôi. Tế bào biểu mô ống dẫn trứng chắnh là tác nhân bổ trợ quan trọng vào môi trường nuôi phôi, giúp phôi thụ tinh trong ống nghiệm vượt qua ựược giai ựoạn ỘBlockỢ (ỘNgưng trệỢ) ựể phát triển tới giai ựoạn phôi dâu-phôi nang.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 83
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. đã xây dựng thành công các phương pháp phân lập, nuôi cấy trong ống nghiệm và bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò. Sau 48 giờ nuôi cấy trong môi trường DỖMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê ở ựiều kiện 5% CO2, 37ỨC và ựộ ẩm bão hòa, tỉ lệ mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng phát triển tốt/ tổng số mảng tế bào biểu mô quan sát ựạt khoảng 71- 88%.
2. đã bảo quản lạnh ựược hai mươi tám dòng tế bào biểu mô ống dẫn trứng trong nitơ lỏng (-196ỨC). Sau khi giải ựông ở 37ỨC, tỉ lệ tế bào sống thu ựược là 30%, các tế bào này có thể tiếp tục phát triển trong môi trường DỖMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê ở ựiều kiện 5% CO2, 37ỨC và ựộ ẩm bão hòa.
3. Tế bào biểu mô ống dẫn trứng có tác ựộng dương tắnh ựến sự phát triển của phôi bò thụ tinh trong ống nghiệm: tỉ lệ phôi dâu-phôi nang thu ựược trong môi trường TCM 199 có bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng (30,34%) cao hơn so với nuôi trong môi trường TCM 199 không bổ sung tế bào biểu mô ống dẫn trứng (17,20%) (P<0,01).
Kiến nghị
1.Tiếp tục nghiên cứu thiết lập các dòng tế bào biểu mô ống dẫn trứng có chất lượng tốt, bảo quản trong nitơ lỏng (-196ỨC) ựể xây dựng ngân hàng lạnh (Cryobank) tế bào biểu mô ống dẫn trứng tại Việt Nam nhằm chủ ựộng trong các thắ nghiệm cũng như phục vụ mục ựắch thương mại.
2.đánh giá một số yếu tố tác ựộng ựến quy trình nhân nuôi in vitro tế bào biểu mô ống dẫn trứng như môi trường nuôi khác nhau, trạng thái buồng trứng ban ựầu (có/ không có thể vàng).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 84
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Nguyễn Hữu đức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quản Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thùy Anh, Nguyễn Việt Linh, Bùi Xuân Nguyên (2003a), ỘKết quả thụ tinh trong ống nghiệm và cấy phôi ở bò lai SindỢ, Tài liệu Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr. 699-702.
2. đỗ Hoàng Khiêm (2006), Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế
bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó, Luận văn kỹ sư, Trường đại học Nông lâm Tp. Hồ Chắ Minh, Tp. Hồ Chắ Minh.
3. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ sinh học trên người và ựộng vật, Nxb Giáo dục.
4. Nguyễn Thị Ước, Nguyễn Hữu đức, Lê Văn Ty, Bùi Linh Chi, Hoàng Nghĩa Sơn, Bùi Xuân Nguyên (1999). Sản xuất phôi bò bằng thụ tinh trong ống nghiệm. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, tr 934- 936.
Tiếng Anh
5. Alberts B. (2008), Molecular biology of the cell, Garland Science, New York.
6. Amy L. W. (2006), Isolation and culture of bovine oviductal epithelial cells for use in the anatomy and physiology laboratory and undergraduate research. Advances in Physiology Education 30, pp. 237-41.
7. Applewhite A., Westhusin M. (1995), In vitro culture of bovine embryos in MBMOC and CR2, Theriogenology 43, pp. 160.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 85 8. Avilés M., Gutiérrez-Adán A. and Coy P. (2010), Oviductal secretions:
will they be key factors for the future ARTs?, Mol Hum Reprod, 16(12), pp. 896-906.
9. Bai G. T. (2011), Establishment and Characterization of Bovine Oviductal Epithelial Cells in Culture and Study of Sperm Binding Capacity, MasterỖs degree in Applied Biotechnology, Hedmark university college.
10.Battut I., Bezard J. and Palmer E. (1991), Establishment of equine oviduct cell monolayer for co-culture of early equine embryos. Proc. 5th Int. Symp. Equine Reprod, pp. 128-29 abstr.
11.Bongso A., Fong C. Y., Nq S. C. and Ratnam S. (1994), Human embryonic behavior in a sequential human oviduct-endometrial coculture system, Fertil Steril, 61(5), pp. 976-78.
12.Carney E. W., Tobback C., Ellington J. E. and Foote R. H. (1990), Co- culture of rabbit 2-Cell embryos with rabbit oviduct epithelial cells and other somatic cells, Molecular Reproduction and Development, 27, pp. 209-15.
13.Cox C. I., Leese H. J. (1994), Characterization of a functional purinergic receptor in primary cultures of bovine oviduct epithelia, Journal of Reproduction and Fertility, Abstract Series, 13, pp. 5.
14.Cox C. I., Leese H. J. (1997), Retention of functional characteristics by bovine oviduct and uterine epithelial in vitro, Anim Reprod Sci, 46, pp. 169-78.
15.Dhali A., Anchamparuthy V. M., Butler S. P., Pearson R. E. and Gwazdauskas F. C. (2009), In vitro development of bovine embryos cultured with stem cell factor or insulin-like growth factor-I following
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 86 IVF with semen of two bulls having different field fertility, Anim Reprod Sci, 116(3-4), pp. 188-95.
16.Diez C., Fernadez I. and Gomez E. (1999), Different patterns of in vitro
development in bovine embryos cultured in serum-free bovine oviductal epithelial cell conditioned medium, Procceding 14th Meeting European Embryo Transfer Association, Venice, pp. 146.
17.Duc N.H., Uoc N.T., Ty L.V., Hanh N.V., Thanh N.T., Bui L.C., Anh N.T., Huu Q.X., Nguyen B.X. (2003b), Potential for in vitro
production of embryo from follicular oocyte of Yellow and Yellow- RedSindhi crossbred cattle, Theriogenology, 59 (1), pp. 442.
18.Edwards J. L., Ealy A. D, Monterroso V. H. and Hansen P. J (1997), Ontogeny of temperature-related heat shock protein 70 synthesis in preimplantation bovine embryos, Molecular Reproduction and Development, 48, pp. 23-33.
19.Ellington J. E. (1991), The bovine oviduct and its role in reproduction: a review of the literature, Cornell Vet., 81(3), pp. 313-28.
20.Ellington J. E., Farrell P. B. and Foote R. H (1990), Comparison of six- day embryo development in uterine tube (oviduct) epithelial cell co- culture versus in vivo development in the cow. Theriogenology, 34, pp. 837-44.
21.Eyestone W. H., First N. L. (1986), A study of the 8-16 cells developmental block in bovine embryos cultured in vitro. Theriogenology, 25, pp. 152.
22.Eyestone W. H., First N. L. (1989), Co-culture of early cattle embryos to the blastocyst stage with oviductal tissue or in conditioned medium.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 87 23.Fazekasova J., Makarevich A. V., Sirotkin A. V. and Bulla J. (2010),
Ghrelin regulates secretion and proliferation of the bovine oviduct epithelial cells in vitro, Slovak J. Anim. Sci., 43, pp. 1-5.
24.Feng H. L., Yang Q. Z., Sun Q. Y., Qin P. C. and Liu J. M. (1994), Development of early embryos in different culture systems,
Veterinary Record, 135, pp. 304-6.
25.Gandolfi F., Brevini T. A. L and Moor R. M. (1986), Role of somatic cells in the long term culture of ovine embryos, In: Programme and Abstracts of Papers for the Annu. Conf. of the Soc. of Fertil, pp. 70. 26.Gandolfi F., Brevini T. A., Richardson L., Brown C. R. and Moor R. M.
(1989), Characterization of proteins secreted by sheep oviduct epithelial cells and their function in embryonic development,
Development,106, pp. 303-12.
27.Gandolfi F., Moor R. M. (1987), Stimulation of early embryonic development in the sheep by co-culture with oviduct epithelial cells,
J. Reprod. Fertil, 81, pp. 23.
28.Hawk H. W., Wall R. J. (1994), Improved yields of bovine blastocysts from in vitro-produced oocytes, Theriogenology, 41, pp. 1571-94. 29.Hunter R. H. F (1994), Modulation of gamete and embryonic micro-
environments by oviduct glycoproteins, Molecular Reproduction and Development, 39, pp. 176-81.
30.Hunter R. H. F. (2003), Advances in deep uterine insemination: a fruitful way forward to exploit new sperm technologies in cattle, Animal Reproduction Science, 79, pp. 157-70.
31.Jang H. Y, Jung Y. S, Cheong H. T, Kim J. T, Park C. K, Kong H. S, Lee H. K and Yang B. K. (2008), Effects of cell status of bovine oviduct epithelial cell on the development of bovine IVM/IVF embryos and
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 88 gene expression in the BOEC used or not used for the embryo culture,
Asian - Australasian Journal of Animal Sciences, 21(7), pp. 980-87. 32.Jenkins N. (1999), Animal cell Biotechnology methods and protocols,
Humana Press, Inc. Totowa, New Jersey.
33.Kamishita H., Takagi M., Choi Y. H., Wijayaguma-wardane M. P. B., Miyazawa K. and Sato K. (1999), Development of in vitro matured and fertilized bovine embryos co-cultured with bovine oviductal epithelial cells obtained from oviducts ipsilateral to cystic follicles,
Animal Reproduction Science, 56, pp. 201-09.
34.Kashino G., Liu Y., Suzuki M., Masunaga S., Kinashi Y., Ono K., Tano