L ỜI CẢM ƠN
2.4.5. Nuôi cấy trong ống nghiệm tếbào biểu mô ống dẫn trứng
2011 [36]; McGowan 2011 [44])
Các mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng sau phân lập ựược nuôi cấy theo phương pháp của Kim và cs (2011) [36] và McGowan (2011) [44], cụ thể như sau:
- Chuẩn bị tủ nuôi Sanyo ở chế ựộ cân bằng: nhiệt ựộ 37ỨC, 5% CO2, ựộ ẩm bão hòa;
- Dùng ựĩa nhựa NUNC (loại 04 giếng), cho 1,5 ml môi trường DỖMEM 10% FCS, bổ sung kháng sinh Penicillin 100.000 UI/lắt và Streptomycin 0,05 g/lắt vào mỗi giếng;
- Phủ lên bề mặt 1,5 ml môi trường nói trên 0,5 ml dầu khoáng (Mineral Oil cung cấp bởi hãng Sigma Aldrich), ựậy nắp, cân bằng khắ và nhiệt ựộ trong tủ nuôi trong ắt nhất 02 giờ;
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 44 hành nuôi cấy trong mỗi giếng nói trên ở ựiều kiện nhiệt ựộ 37ỨC, 5% CO2, ựộ ẩm bão hòa;
- Quan sát sự phát triển in vitro của các tế bào biểu mô ống dẫn trứng sau những khoảng thời gian xác ựịnh (06, 12, 18, 24, 36, 48 giờ) trên kắnh hiển vi phản pha Nikon Ti-U;
- đánh giá tỉ lệ mảng tế bào biểu mô bám dắnh xuống ựáy và có sự nhân lên của tế bào/ tổng số mảng tế bào biểu mô ựưa vào ựĩa nuôi.
2.4.6. Phương pháp ựếm tế bào
- Sau thời gian nuôi cấy xác ựịnh (06, 12, 18, 24, 36, 48 giờ), soi ựĩa tế bào trên kắnh hiển vi phản pha nhằm phát hiện giếng bị nhiễm hoặc ựánh giá tỉ lệ sống cũng như sự phát triển của tế bào và cụm tế bào.
- đĩa tế bào sau thời gian nuôi cấy trên, rửa tế bào với PBS ựể loại bỏ môi trường còn sót lại;
- Thêm một lượng thắch hợp 0,1% Trypsin-EDTA; - để lại vào tủ nuôi trong 10-15 phút;
- Quan sát dưới kắnh hiển vi ựể thấy các tế bào phân tách;
- Thêm 2 ml môi trường DỖMEM 10% FCS ựể trung hòa Trypsin; - Dùng pipet Pasteur phân tách tế bào;
- Lấy 10 ộl tế bào sang ống eppendorf;
- Pha loãng 4 lần bằng cách trộn 10 ộl tế bào với 10 ộl trypan blue; - Cho hỗn hợp trộn vào buồng ựếm.
Tắnh kết quả:
Số tế bào trong 1 ml mẫu ban ựầu ựược tắnh: C = (N*H)/ V Trong ựó: C là số tế bào trong 1 ml mẫu ban ựầu; H là hệ số pha loãng;
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 45
2.4.7. Tạo lớp ựơn tế bào biểu mô ống dẫn trứng (McGowan, 2011 [44]) Lớp ựơn tế bào ống dẫn trứng ựược tạo ra dựa trên phương pháp của McGowan (2011) [44], cụ thể như sau:
- Sau 48 giờ nuôi cấy, dùng 0,1% Trypsin-EDTA tách lớp tế bào biểu mô ống dẫn trứng khỏi bề mặt ựáy của ựĩa nuôi;
- Thu lấy tế bào, cho vào ống ly tâm có chứa môi trường nuôi cấy. Ly tâm tốc ựộ 1200 vòng/phút trong 5 phút;
- Hút bỏ môi trường bên trên, hòa tan nhẹ nhàng lớp tế bào dưới ựáy bằng pipet Pasteur hút lên xuống 10 lần;
- Thêm môi trường nuôi cấy và lặp lại 02 lần ly tâm-thay môi trường như vừa trình bày;
- Gieo tế bào biểu mô ống dẫn trứng vào ựĩa NUNC mới (loại 04 giếng) với nồng ựộ 1x106 tế bào/ml. Trong ựĩa nuôi có chứa sẵn môi trường DỖMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê, bổ sung kháng sinh Penicillin 100.000 UI/lắt và Streptomycin 0,05 g/lắt;
- Quá trình phát triển in vitro của tế bào diễn ra trong tủ nuôi Sanyo ở chế ựộ cân bằng: nhiệt ựộ 37ỨC, 5% CO2, ựộ ẩm bão hòa. Sau 24 giờ nuôi cấy, tế bào biểu mô ống dẫn trứng tạo lớp ựơn bám ựưới ựáy ựĩa nuôi.
2.4.8. đông lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng (Fazekasova và cs, 2010 [23])
Tế bào biểu mô ống dẫn trứng sau nuôi cấy ựược ựông lạnh theo phương pháp của Fazekasova và cs (2010) [23], cụ thể như sau;
- Chuẩn bị 5 ml môi trường ựông lạnh DỖMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê, 10% Dimethyl Sulfoxide (DMSO);
- Dùng 0,1% Trypsin-EDTA tách lớp tế bào biểu mô ống dẫn trứng khỏi bề mặt ựáy của ựĩa nuôi;
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 46 - Ly tâm tốc ựộ 1200 vòng/phút trong 5 phút;
- Hút bỏ môi trường bên trên, hòa tan nhẹ nhàng lớp tế bào dưới ựáy bằng pipet Pasteur hút lên xuống 10 lần;
- Thêm môi trường nuôi cấy và lặp lại 02 lần ly tâm-thay môi trường như vừa trình bày;
- Chuyển phần tế bào dưới ựáy ống ly tâm nhẹ nhàng vào 5 ml môi trường ựông lạnh ựã chuẩn bị sẵn, trộn ựều;
- Tất cả ựược hút vào các cọng rạ nhựa loại 0,25 ml và hàn kắn bằng nhiệt;
- Bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng ở ựiều kiện lạnh sâu trong nitơ lỏng (-196ỨC). Sử dụng nguyên tắc phương pháp ựông lạnh nhanh (3 bước). Tức là ựặt các ống tế bào (trong môi trường bảo quản lạnh) vào trong tủ lạnh 4ỨC, sau ựó ựặt tiếp vào tủ -20ỨC rồi ựặt mẫu vào bình nitơ lỏng (-196ỨC).
2.4.9. Giải ựông và kiểm tra khả năng phát triển in vitro của tế bào biểu mô ống dẫn trứng
- Tế bào biểu mô ống dẫn trứng ựược giải ựông sau những khoảng thời gian bảo quản khác nhau (01, 02, 03, 04, 05, 06 tháng), bằng cách nhúng cọng rạ nhựa nói trên vào nước ấm 37ỨC trong 60 giây;
- Lau khô nhanh cọng rạ và vệ sinh bằng cồn 70Ứ phần ựầu chuẩn bị cắt; - Cắt ựầu cọng rạ, cho dung dịch ựông lạnh cùng tế bào bên trong chảy vào ống ly tâm chứa sẵn 5 ml môi trường DỖMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê, ly tâm tốc ựộ 1200 vòng/phút trong 5 phút;
- Thu hồi tế bào bên dưới bằng cách loại bỏ dịch nổi bên trên; - đếm tế bào trên buồng ựếm Thoma;
- Tiến hành nuôi cấy tế bào trong môi trường DỖMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê với nồng ựộ ban ựầu là 1x106 tế bào/ml, quan sát sự
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 47 phát triển in vitro của tế bào sau 02 ngày nuôi cấy trong ựiều kiện 5% CO2, 37ỨC, ựộ ẩm bão hòa.
2.4.10. Chọn dòng tế bào
Tế bào biểu mô ống dẫn trứng sau ựông lạnh 01 tháng ựược giải ựông và nuôi cấy tiếp tục (phương pháp trình bày trong phần 2.4.9):
-Sau 48 giờ nuôi cấy, vỗ nhẹ tay vào thành ựĩa nuôi nhiều lần ựể tách tế bào chết (nổi lên) và dùng 0,1% Trypsin-EDTA tách lớp tế bào biểu mô ống dẫn trứng khỏi bề mặt ựáy của ựĩa nuôi, tạo huyền phù tế bào;
-Tiếp tục nuôi cấy theo phương pháp ựã trình bày ở trên nhưng lần này số lượng tế bào ựưa vào ựĩa nuôi có nồng ựộ thấp (500 tế bào/ml). Khi gieo tế bào vào ựĩa nuôi, cần chú ý ựể các tế bào cách rời nhau, ựánh dấu 10-12 tế bào hoàn toàn riêng rẽ (dùng bút dạ ựánh dấu dưới ựáy ựĩa nuôi);
-Nuôi tiếp 48-52 giờ, chọn 1-2 cụm tế bào phát triển tốt từ 10-12 tế bào trên, dùng ống mao quản thủy tinh vô trùng, tách cụm tế bào nói trên trên kắnh hiển vi phản pha Nikon Ti-U có gắn bộ vi thao tác Narishige (Nhật Bản), chuyển rất cẩn thận mỗi cụm tế bào thu nhận sang một ựĩa nuôi;
-Toàn bộ quá trình trên có khống chế nhiệt ựộ 37ỨC bằng ựĩa nhiệt Tokai-Hit (Nhật Bản), ựĩa này ựặt ngay trên kắnh hiển vi;
-Theo dõi sự phát triển tiếp theo của cụm tế bào, cụm nào tiếp tục phát triển tốt trong vòng 24-48 giờ sau chuyển thì ựược nhân nuôi ựể tạo dòng tế bào, sau ựó ựông lạnh dòng tế bào này trước khi dùng chúng ựể bổ sung vào môi trường nuôi phôi bò thụ tinh trong ống nghiệm.
2.4.11. Xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học trong chương trình Microsoft Office Excel 2007.
Sử dụng kiểm ựịnh Khi bình phương (χ2) ựể so sánh sự sai khác có ý nghĩa thống kê giữa các nhóm thắ nghiệm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 48
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập tế bào biểu mô ống dẫn trứng
Phức hợp buồng trứng-ống dẫn trứng bò vận chuyển từ lò mổ về phòng thắ nghiệm trong vòng 02, 04, 06, 08, 10 và 12 giờ. Thiết bị giữ và vận chuyển mẫu chuyên dụng do hãng Cryologic (Úc) cung cấp. Thiết bị này có nguồn ựiện ựộc lập (bình ắc qui) và có nút ựiều chỉnh nhiệt ựộ, màn hình hiển thị chắnh xác nhiệt ựộ giữ mẫu. Nhiệt ựộ thân nhiệt bình thường của bò là 37ỨC. Cài ựặt nhiệt ựộ trên thiết bị Cryologic ở mức 37ỨC nhằm bảo quản phức hợp buồng trứng-ống dẫn trứng trong ựiều kiện như trong cơ thể bò trước khi mổ.
Hình 3.1. Thiết bị Cryologic
Thông thường, có thể sử dụng hai loại dung dịch ựể vận chuyển phức hợp buồng trứng-ống dẫn trứng bò. Một là, dùng dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,9%); hai là, dùng dung dịch Phosphate Buffered Saline (PBS). Cả hai dung dịch này ựều cần bổ sung kháng sinh như một yếu tố chống nhiễm khuẩn trong suốt quá trình thu và vận chuyển mẫu buồng trứng.
Tại phòng thắ nghiệm của chúng tôi, việc bảo quản mẫu ựược ưu tiên thực hiện trong môi trường Phosphate Buffered Saline có bổ sung kháng sinh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 49 (Penicillin 100.000 UI/lắt và Streptomycin 0,05 g/lắt) vì ựây là môi trường giàu dinh dưỡng hơn, có ảnh hưởng tốt ựến sức sống của tế bào hơn. đây là loại môi trường bảo quản có chất lượng tốt, có tác dụng là một dung dịch ựệm và ựược các phòng thắ nghiệm trên thế giới sử dụng.
Tắnh chất ựặc biệt của dung dịch ựệm là khi ta cho thêm vào một lượng chất có tắnh base hay acid thì pH của dung dịch mới thay ựổi rất ắt so với dung dịch khi chưa có tác ựộng. Khả năng chống lại sự thay ựổi pH ựột ngột giúp dung dịch ựệm ựược dùng phổ biến trong các quá trình hoá học và cần thiết cho các chu trình hoá sinh. Nhiều enzym chỉ hoạt ựộng trong một ựiều kiện cố ựịnh; nếu ựộ pH vươn ra xa mốc ban ựầu, enzym sẽ bị chậm hoá, ngừng làm việc hoặc tệ hơn là bị biến tắnh, do ựó mãi mãi mất ựi khả năng xúc tác. Vì vậy dung dịch ựệm giúp giữ nguyên ựộ pH cho các enzym trong các cơ thể sống hoạt ựộng.
Phosphate Buffered Saline (PBS) là dung dịch ựệm ựược sử dụng phổ biến trong nghiên cứu sinh học. Phosphate Buffered Saline là một dạng dung dịch lỏng có chứa natri clorua natri phosphat, và trong một số công thức, clorua kali và phốt phát kali. Nhóm phosphate của bộ ựệm giúp duy trì ổn ựịnh ựộ pH.
Phosphate Buffered Saline ựược sử dụng nhiều trong các nghiên cứu vì tắnh chất ựẳng trương (isotonic) và không gây ựộc cho tế bào. Các ứng dụng của PBS bao gồm việc sử dụng làm chất pha loãng và chất rửa, chứa tế bào. Tuy nhiên việc sử dụng Phosphate Buffered Saline như bộ ựệm ựể bảo quản tế bào là tốt nhất.
Trước khi sử dụng, cần hấp khử trùng (121ỨC/ 20 phút) và lọc vô trùng môi trường ngay sau khi pha bằng cách sử dụng màng lọc vô trùng. PBS có thể lưu trữ ở nhiệt ựộ phòng, nhưng ựể ựảm bảo ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn thì nên giữ lạnh (4ỨC), khi dùng phải làm ấm ựến 37ỨC.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 50 Hình 3.2. Môi trường PBS
Bảng 3.1. Thành phần môi trường PBS pH 7,3-7,4 (dùng pha 01 lắt) ỘNguồn: http://www.invitrogen.com [78]Ợ Hóa chất Lượng NaCl 8 g Na2HPO4 1,15 g Na pyruvate (C3H3NaO3) 0,036 g CaCl2.2H2O 0,132 g KCl 0,2 g KH2PO4 0,2 g MgCl2.6H2O 0,121 g Glucose 1 g Penicillin 100.000 UI Streptomycin 0,05 g
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 51 Tế bào biểu mô ống dẫn trứng có thể ựược phân lập bằng phương pháp sử dụng enzym: như dùng enzym Trypsin/ Pancreatin (Cox và Leese, 1997 [14]), chỉ dùng Trypsin (Thibodeaux và cs, 1991 [66]), hoặc dùng Collagenase (Mishra và cs, 2003 [47]).
Tuy nhiên, trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp cơ học Ờ phương pháp cạo (scrape) (Walter, 1995 [70]). Phương pháp này có ưu ựiểm là ựơn giản, ắt tốn kém, và cho kết quả ựáng tin cậy. Phương pháp này ựược ựánh giá là cho khả năng sống của tế bào cao, giảm tỉ lệ tế bào bị tổn thương.
Một trong những phương pháp cơ học khác cũng ựược sử dụng là phương pháp vuốt (squeeze) (Ulbrich và cs, 2010 [67]). Tuy nhiên, dùng phương pháp cạo (scrape) một cách cẩn thận ựể tách tế bào biểu mô ống dẫn trứng từ lớp niêm mạc không tổn hại ựến lớp ựệm của tầng niêm mạc và lớp cơ trơn của tầng cơ. điều ựó giúp giảm sự nhiễm tạp với các tế bào không phải là tế bào biểu mô ống dẫn trứng hơn là dùng panh kẹp ống dẫn trứng rồi vuốt dọc ống dẫn trứng ựể tế bào ở trong lòng ống dẫn trứng ra ngoài. (Walter, 1995 [70]; Mondéjar và cs, 2012 [48]).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 52 Hình 3.4. Bộc lộ lòng ống dẫn trứng
Hình 3.5. Tách những mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng
Hình 3.6. Cho những mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng vào ống ly tâm có chứa 1 ml môi trường DỖMEM có bổ sung 10% FCS
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 53 Hình 3.7. Ly tâm tốc ựộ 1200 vòng/phút trong 5 phút
Hình 3.8. Lớp tế bào lắng ựọng bên dưới sau khi ly tâm
Hình 3.9. Dùng pipet vô trùng loại bỏ dịch nổi bên trên,
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 54 Hình 3.10. Buồng thao tác vô trùng
Hình 3.11. Mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng tách từ ống dẫn trứng ngay sau khi ựưa về phòng thắ nghiệm
Thời gian bảo quản mẫu cũng là một vấn ựề ựáng lưu ý. Tuy nhiên trên thực tế, ựịa ựiểm thu mẫu xa phòng thắ nghiệm (từ vài Km ựến hơn 10 Km), Thời gian mổ bò ở các lò mổ sớm (khoảng 3-5 giờ sáng) làm cho thời gian này không thể nhanh hơn 02 giờ.
Sau khi phức hợp buồng trứng-ống dẫn trứng bò ựược bảo quản trong môi trường Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7,3-7,4 bổ sung kháng sinh Penicillin 100.000 UI/lắt và Streptomycin 0,05 g/lắt; trong thiết bị chuyên
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 55 dụng Cryologic ựặt ở nhiệt ựộ 37ỨC, chuyển về phòng thắ nghiệm; chúng tôi bắt ựầu tiến hành phân lập tế bào biểu mô ống dẫn trứng sau những khoảng thời gian bảo quản khác nhau (02, 04, 06, 08, 10 và 12 giờ) tại phòng thắ nghiệm.
Nhìn chung, việc thu mẫu cũng tương tự giữa phòng thắ nghiệm của chúng tôi và nhiều phòng thắ nghiệm trên thế giới, quá trình thu mẫu là vất vả vì mẫu cần thu ngay khi con vật vừa bị giết ựể ựảm bảo khả năng sống của tế bào ống dẫn trứng bên trong.
Các mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng vừa ựược phân lập ựược tiến hành nuôi cấy trong mỗi giếng nói trên ở ựiều kiện nhiệt ựộ 37ỨC, 5% CO2, ựộ ẩm bão hòa. Môi trường nuôi cấy là môi trường DỖMEM 10% FCS, bổ sung kháng sinh Penicillin 100.000 UI/lắt và Streptomycin 0,05 g/lắt.
Môi trường bảo quản và nuôi cấy tế bào rất dễ bị nhiễm nấm, vi khuẩn; ựặc biệt với môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng. Về mặt kỹ thuật, ựể ngăn cản sự sinh trưởng của vi khuẩn và nấm, có thể bổ sung vào môi trường các chất kháng sinh như: Penicillin, Streptomycin, Tetracyclin, Kanamycin, Gentamycin. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng hai loại kháng sinh bổ sung vào môi trường bảo quản và môi trường nuôi cấy ựó là Penicillin 100.000 UI/lắt và Streptomycin 0,05 g/lắt. Penicillin thuộc nhóm kháng sinh Beta-lactamin, trong tự nhiên Penicillin ựược tổng hợp từ nấm Penicillinum notatum và nấm P. chrysogenum, ựây là kháng sinh có hoạt lực cao với nhóm vi khuẩn Gram dương và không kháng penicillinase. Streptomycin thuộc nhóm kháng sinh Aminosid, chiết xuất từ Streptomyces griceus, ựây là kháng