L ỜI CẢM ƠN
3.2.Khả năng phát triển invitro của tếbào biểu mô ống dẫn trứng
Các mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng sau khi ựược phân lập ựược tiến hành nuôi cấy trong mỗi giếng NUNC (loại 4 giếng) chứa 1,5 ml môi trường DỖMEM có bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FCS), bổ sung kháng sinh Penicillin 100.000 UI/lắt và Streptomycin 0,05g/lắt.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 61 Hình 3.18. Tế bào biểu mô ống dẫn trứng ựược nuôi trong ựĩa nhựa NUNC
(loại 04 giếng), ựã chuẩn bị môi trường nuôi cấy
Quan sát sự phát triển in vitro của 192 mảng tế bào biểu mô tế bào ống dẫn trứng thông qua khả năng sống, bám dắnh của lớp biểu mô và nhân lên của tế bào ống dẫn trứng ựược tiến hành sau các khoảng thời gian khác nhau (06, 12, 18, 24, 36, 48 giờ) kể từ khi ựặt lớp tế bào biểu mô vào ựĩa nuôi.
đánh giá tỉ lệ mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng bám dắnh xuống ựáy ựĩa nuôi và có sự nhân lên của tế bào/ tổng số mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng ựưa vào ựĩa nuôi
Kết quả quan sát ựược trình bày ở hình 3.19.
Hình 3.19. đồ thị biểu diễn khả năng bám dắnh và tiếp tục phát triển của các mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 62 đồ thị ở hình 3.19 cho thấy, trong vòng 06 giờ kể từ lúc nuôi, các mảng tế bào biểu mô chưa có hiện tượng bám dắnh cũng như chưa quan sát thấy bất kỳ hiện tượng tế bào phân chia. Sau ựó, các mảng tế bào biểu mô bắt ựầu bám dắnh và tế bào bắt ựầu có hiện tượng phân chia (hình 3.17.), hiện tượng này tăng lên nhanh chóng và sau 48 giờ nuôi cấy, tỉ lệ mảng tế bào biểu mô ống dẫn trứng phát triển tốt/ tổng số mảng tế bào biểu mô quan sát ựạt khoảng 71- 88%. Lúc này ta thu ựược những lớp ựơn tế bào biểu mô ống dẫn trứng ở các ựĩa ựưa vào nuôi cấy (hình 3.23.). đây là một kết quả khá tốt và ựiều này chứng tỏ các khâu xử lý chọn lọc mẫu ống dẫn trứng, phân lập tế bào, chế ựộ tủ nuôi cũng như môi trường nuôi ựã sử dụng là thắch hợp cho việc nhân nuôi
in vitro tế bào biểu mô ống dẫn trứng tại phòng thắ nghiệm của chúng tôi. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào ựược thiết lập gần giống như thành phần dịch lỏng trong cơ thể sống bao gồm muối vô cơ, carbonhydrate, vitamin, amino acid, các tiền chất biến dưỡng, nhân tố tăng trưởng, hormon, các yếu tố vi lượng và ựặc biệt quan trọng là huyết thanh. Các chất dinh dưỡng thiết yếu giúp tế bào phân chia như amino acid, acid béo, ựường, các ion, các vitamin, co-factor và các phân tử cần thiết ựể duy trì môi trường hóa học cho các tế bào.
Môi trường dùng ựể nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng thông thường là Eagle Minimal Essential Media (EỖMEM) hoặc DulbeccoỖs Modified EagleỖs media (DỖMEM) hoặc môi trường tổng hợp TCM-199.
Môi trường Eagle Minimal Essential Media (EỖMEM) còn gọi là môi trường tối thiểu, do Eagle thiết lập. đây là môi trường cơ bản có chứa nồng ựộ các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5-10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào.
Môi trường DỖMEM (DulbeccoỖs Modified Eagle Medium) do Dulbecco cải tiến từ môi trường EỖMEM (EagleỖs Minimal Essential
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 63 Medium) hiện ựang ựược sử dụng chủ yếu trong việc nuôi cấy tế bào, ựặc biệt là tế bào gốc. Nó có nồng ựộ amino acid cao gấp ựôi, nồng dộ vitamin cao gấp bốn môi trường EỖMEM, tối ưu cho nuôi cấy tế bào có mật ựộ cao.
Chắnh vì vậy mà DỖMEM là môi trường thương phẩm thắch hợp cho nuôi cấy nhiều loại tế bào ựộng vật và chúng tôi quyết ựịnh sử dụng môi trường này cho việc nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng.
Môi trường DMEM 10% FCS sử dụng trong nghiên cứu là DỖMEM, low glucose, pyruvate (Gibco); không chứa môi trường ựệm Hepes; số catalog 11885-084.
Bảng 3.2. Thành phần môi trường DỖMEM pH 7,3-7,4 (dùng pha 01 lắt) ỘNguồn: http://www.invitrogen.com [78]Ợ Hóa chất Lượng DMEM bột (Gibco) 15,6 g Na pyruvate (C3H3NaO3) 0,11 g Phenol red 0,015 g Glucose 1 g Penicillin 100.000 UI Streptomycin 0,05 g
Fetal Calf Serum 10%
Trong nuôi cấy in vitro, việc bổ sung pyruvate có tác dụng cung cấp thêm năng lượng cho quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào.
Phenol red ựược dùng như chất chỉ thị pH. pH 7,2 Ờ 7,4 là tốt nhất cho việc nuôi cấy tế bào, trong ựó có tế bào ống dẫn trứng. Có thể bổ sung Phenol red vào môi trường nuôi cấy ựể dễ dàng theo dõi sự thay ựổi pH của mẫu. Phenol red có màu ựỏ ở pH 7,4; cam ở pH 7; vàng ở pH 6,5; vàng chanh ở pH < 6,5; hồng ở pH 7,6 và tắm ở pH 7,8. Nuôi trong 5% CO2 :
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 64 ổn ựịnh pH.
Hình 3.20. Môi trường DỖMEM
Huyết thanh ựược bổ sung vào môi trường ựể tạo ựiều kiện tối ưu cho nuôi cấy tế bào. Thành phần chắnh yếu có trong huyết thanh là protein. Ngoài ra nó còn chứa nhiều polypeptid, các nhân tố tăng trưởng, lipid, hormon, amino acid, glucose, ketoacid và các nguyên tố vi lượng như sắt, ựồng, kẽmẦ.rất cần thiết cho sự phát triển của tế bào.
Vai trò của huyết thanh:
- Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượngẦ
- Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kắch thắch sự tăng trưởng và phân chia.
- Kắch thắch sự phục hồi các tổn thương tế bào khi tách bằng tác dụng lực cơ học hay dùng enzym mạnh như Trypsin.
- Bất hoạt Trypsin.
- Cải thiện tắnh tan của các chất dinh dưỡng.
- Tăng tắnh bám dắnh của tế bào lên bề mặt bình nuôi. - Chống oxy hoá.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 65 Mới ựây, Leivas và cs (2011) [37] ựã nuôi cấy hợp tử in vitro trong môi trường SOF (Synthetic Oviductal Fluid) có bổ sung BSA (Bovine Serum Albumin), hoặc BSA + 2% FCS (Fetal Calf Serum). Kết quả cho thấy có 51% phôi dâu-phôi nang ựược tạo thành. Nhưng trong ựó, phôi dâu-phôi nang ựạt chất lượng tốt ở lô thắ nghiệm bổ sung BSA + 2% FCS cao hơn ở lô chỉ bổ sung BSA tương ứng là 41% so với 30% (P<0,05). Chắnh vì vậy, với cùng mục ựắch ựể nâng cao hiệu quả tạo phôi dâu-phôi nang, chúng tôi cũng quyết ựịnh bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê (FCS) vào môi trường nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng.
Hình 3.21. Huyết thanh bào thai bê (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Các tế bào ựộng vật nằm trong khối mô liên kết chặt chẽ với nhau nhờ các cầu nối protein. để bóc tách lớp tế bào khỏi bề mặt ựáy ựĩa nuôi ựể tiến hành nuôi cấy tiếp theo, trong nuôi cấy tế bào ựộng vật, ngoài trypsin, có thể sử dụng các enzym có cùng bản chất protease khác như: collagenase, chrymotrypsin, papain, elastase. Tuy nhiên các enzym này cắt không hoàn toàn các cầu nối gian bào, tắnh ựặc hiệu kém hơn Trypsin. (Mishra và cs, 2003 [47]; Phan Kim Ngọc và Phạm Văn Phúc, 2006 [3]). Vì vậy, chúng tôi sử dụng Trypsin ựể tách lớp tế bào biểu mô ống dẫn trứng khỏi bề mặt ựáy ựĩa nuôi, sau ựó tiến hành tạo lớp ựơn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 66 Trypsin là enzym kiềm tắnh ựiển hình, có bản chất serin protease ựược tổng hợp ở tụy tạng và tiết ra dưới dạng tiền hoạt ựộng là zymogen là trypsinogen. Trypsin có cấu trúc chuỗi polypeptide gồm 249 acid amin, khối lượng phân tử 22,6 - 23,4 KDa. Trung tâm hoạt ựộng của phân tử gồm gốc serin (vị trắ 18) và hai gốc histidin (vị trắ 29 và 46, nhờ cấu trúc bậc ba nên các gốc này rất gần nhau trong không gian). Trypsin hoạt ựộng trong môi trường pH 6-9, tối ưu ở pH 8-9, rất bền vững trong môi trường acid yếu, chúng rất phổ biến cho việc tách tế bào.
Hình 3.22. Cấu trúc không gian của Trypsin Ộhttp://maptest.rutgers.edu [79]Ợ
Trypsin cắt liên kết giữa nhóm carboxyl (−COOH) của lysin hoặc arginin và gốc amin (−NH2) của acid amin bất kì ựứng liền kề với nó trong polypeptid, ngoại trừ liên kết giữa lysin và arginin. Nói cách khác, cơ chất của Trypsin phải có mạch bên là cation kiểu như arginin hoặc lysin. Xử lý Trypsin dẫn ựến sự cuộn tròn tế bào. Khi tế bào co lại, các liên kết trở nên lỏng lẻo và tế bào dễ dàng ựược tách ra bởi tác ựộng cơ học.
Canxi ựược xem như chất bảo vệ cho Trypsin, hoạt tắnh xúc tác của Trypsin bị giảm 50% khi vắng mặt Ca2+ vì Trypsin trở nên trơ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 67 Trypsin không tác ựộng ựặc hiệu cho loại protein, vì vậy có thể phân cắt các protein ở màng và gây vỡ tế bào khi dùng nồng ựộ cao, hoặc cho tác ựộng trong thời gian dài.
Việc thêm EDTA vào sẽ kìm hãm hoạt tắnh cao của Trypsin (EDTA sẽ liên kết với các cation Mg2+, Ca2+ tạo phức hợp chelator). Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng 0,1% Trypsin-EDTA; nồng ựộ này giúp cho việc tách tế bào khỏi bề mặt ựáy ựĩa nuôi một cách tốt hơn (vỗ nhẹ tay vào thành ựĩa nuôi sau khi cho Trypsin vào, ựồng thời dùng pipetman hút lên xuống).
Trypsin phân cắt các cầu nối gian bào hầu như hoàn toàn, nhưng có thể gây hư hại tế bào. Vì vậy huyết thanh bào thai bê (Fetal Calf Serum) ựược bổ sung ngay sau khi thu ựược tế bào ựơn ựể trung hòa Trypsin.
Về mặt kỹ thuật, chúng tôi lưu ý việc sử dụng dầu khoáng ựể phủ lên bề mặt ựĩa nuôi. đây là một loại dầu ựặc biệt ựược cung cấp bởi hãng Sigma với tiêu chuẩn cao (embryo tested). Chắnh lớp dầu bao phủ bề mặt ựĩa nuôi này giúp ngăn cản sự xâm nhập của các vi khuẩn, bào tử nấmẦ trong không khắ có thể ựi vào môi trường nuôi tế bào vốn rất giàu dinh dưỡng. Mặt khác, lớp dầu này cũng ngăn cản sự bốc hơi, tạo sự ổn ựịnh về áp suất thẩm thấu cũng như pH của môi trường.
Hình 3.23. Tế bào biểu mô ống dẫn trứng phát triển thành lớp ựơn sau 48 giờ nuôi in vitro
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 68 Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng buồng ựếm Thoma. Trên thực tế có hai loại buồng ựếm ựều ựược các phòng thắ nghiệm công nghệ sinh học ựộng vật trên thế giới sử dụng ựó là buồng ựếm Thoma và buồng ựếm Neubauer. Về mặt kỹ thuật, hai buồng ựếm này ựều dùng ựể ựếm tế bào và ựánh giá tỉ lệ sống-chết của tế bào.
Hai buồng ựếm này khác nhau ở chỗ buồng ựếm Neubauer gồm 25 ô vuông lớn còn buồng ựếm Thoma gồm 16 ô vuông lớn. Trong mỗi ô vuông lớn ựều có 16 ô vuông nhỏ, mỗi ô vuông nhỏ ựều có diện tắch 0,0025 mm2, ựộ sâu 0,1 mm. Chắnh vì vậy, kết quả tắnh số tế bào trong 1 ml mẫu ban ựầu sẽ khác nhau do sự khác nhau của thể tắch.
Hình 3.24. Buồng ựếm Neubauer (A) và buồng ựếm Thoma (B)
Hình 3.25. Cấu trúc chung của buồng ựếm
Hình 3.26. Kắch thước mỗi ô ựếm của buồng ựếm
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 69 - Phương pháp ựếm: chọn ngẫu nhiên 5 ô vuông lớn trong vùng ựếm, sau ựó ựếm tế bào trong các ô vuông nhỏ của từng ô vuông lớn.
Với buồng ựếm Naubeur có thể chọn 5 ô vuông lớn như sau:
Hình 3.27. Phương pháp chọn vùng ựếm với buồng ựếm Neubauer Với buồng ựếm Thoma, chọn 5 ô vuông lớn như sau:
Hình 3.28. Phương pháp chọn vùng ựếm với buồng ựếm Thoma - Chỉ ựếm tế bào còn sống. Chỉ ựếm tế bào ở trong ô vuông và phắa trên hoặc bên trái ô vuông (chạm vạch).
- Tế bào sống: màu trắng trong, tròn, không phân rã. Tế bào chết: màu xanh của trypan blue, bị phân rã.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 70 Trypan blue là thuốc nhuộm dùng ựể phân biệt tế bào (hoặc mô) chết và sống thông qua sự bắt màu xanh của tếbào (hoặc mô) chết. đây là một chỉ thị màu thường ựược sử dụng trong các phòng thắ nghiệm tế bào ựộng vật trên thế giới.
Theo Jenkins (1999) [32], trypan blue thường ựược thêm vào huyễn dịch tế bào trước khi ựếm. Chất nhuộm này thâm nhập vào màng của những tế bào không còn khả năng tồn tại hoặc phát triển, những tế bào này bắt màu xanh. Vì vậy có thể phân biệt ựược chúng với những tế bào còn sống (không bắt màu với chất nhuộm này). Dung dịch trypan blue có nồng ựộ 2%, ựược pha trong PBS (Phosphate Buffered Saline). Dung dịch trypan blue thường ựược thêm vào huyễn dịch tế bào với tỉ lệ 1:1, thời gian 2 phút ở nhiệt ựộ phòng.
Hình 3.30. Thao tác nhỏ trypan blue
3.3. Khả năng bảo quản lạnh tế bào biểu mô ống dẫn trứng
Phương pháp ựông lạnh ựược áp dụng theo phương pháp của Fazekasova và cs (2010) [23]. Một lưu ý là chúng tôi sử dụng nguyên tắc phương pháp ựông lạnh nhanh (3 bước). Tức là ựặt các ống tế bào (trong môi trường bảo quản lạnh) vào trong tủ lạnh 4ỨC, sau ựó ựặt tiếp vào tủ -20ỨC rồi ựặt mẫu vào bình nitơ lỏng (-196ỨC).
Ngoài phương pháp ựông lạnh nhanh (3 bước) như trình bày trên, các phòng thắ nghiệm tế bào ựộng vật còn sử dụng các phương pháp ựông lạnh
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 71 như: ựông lạnh chậm theo chương trình và giải ựông nhanh, ựông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa) và ựông lạnh in situ (ựông lạnh trong bình nuôi). Tuy nhiên sử dụng nguyên tắc của phương pháp ựông lạnh nhanh (3 bước) sẽ hạn chế sự hình thành tinh thể nước ựá bên trong tế bào (nguyên nhân chắnh gây vỡ màng trong suốt hoặc vỡ tế bào và dẫn ựến hỏng mẫu) so với phương pháp ựông lạnh chậm theo chương trình. đông lạnh nhanh (3 bước) cũng giảm thiểu rủi ro do sự thay ựổi nhiệt ựộ thường gặp ở phương pháp ựông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa). Do thể tắch môi trường xung quanh tế bào rất nhỏ, chỉ một vài thay ựổi nhiệt ựộ nhỏ cũng làm ảnh hưởng rất lớn ựến chất lượng tế bào sau giải ựông. đông lạnh nhanh (3 bước) chỉ sử dụng nồng ựộ chất bảo bệ sinh học lạnh vừa phải, không ảnh hưởng ựến sức sống tế bào so với phương pháp ựông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa) sử dụng nồng ựộ chất bảo vệ sinh học cao. Chúng tôi cũng không sử dụng phương pháp ựông lạnh in situ vì trong nghiên cứu chúng tôi thiết lập nhiều dòng tế bào (28 dòng tế bào), mỗi dòng lại ựược ựông lạnh trong 20 cọng rạ, chắnh vì vậy ựể tiết kiệm chi phắ, dễ dàng bảo quản, chúng tôi sử dụng phương pháp ựông lạnh nhanh (3 bước).
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.31. Hai mức nhiệt ựộ ựược áp dụng ựể hạ dần nhiệt ựộ của tế bào bảo quản lạnh trước khi ựưa vào nitơ lỏng (-196ỨC)
A. 4ỨC; B. -20ỨC
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦ 72 Hình 3.32. Thiết bị trữ lạnh dùng nitơ lỏng sử dụng trong nghiên cứu
Sự sống sót của tế bào chỉ có thể xảy ra khi người ta bổ sung một dung môi hữu cơ hay còn gọi là chất bảo vệ sinh học lạnh vào môi trường huyền phù ựể ựông lạnh tế bào. đây là những chất tan hữu cơ giúp bảo vệ các cơ quan tế bào, ựảm bảo khả năng sống sót của tế bào trong lúc bảo quản lạnh.
Tác dụng của các chất bảo vệ sinh học lạnh:
- Làm giảm giá trị của tốc ựộ ựông lạnh giới hạn nên không có tinh thể nước ựá hình thành.
- Làm giảm giá trị của tốc ựộ nâng nhiệt (quá trình giải ựông) nên giai ựoạn thủy tinh của nước không kịp tái tạo tinh thể.
- Thành phần và nồng ựộ của dung dịch, thành phần và nồng ựộ của chất bảo vệ sinh học lạnh giúp duy trì trạng thái ổn ựịnh không hình thành tinh thể của dung dịch ở nhiệt ựộ thấp.
Các chất ựược ựề cập ựến là: Glycerol, Dimethyl Sulfoxide và một số glycol (Ethylen Glycol, Propylen Glycol,Ầ) ựược sử dụng làm chất bảo vệ sinh học trong quá trình ựông lạnh phôi, tế bào. Trong ựó, Dimethyl sulfoxide