L ỜI CẢM ƠN
1.2.4. Kiểm soát nhiễm trong nuôi cấy tếbào
Một vấn ñề khi nuôi cấy tế bào ñộng vật in vitro ñều phải ñối mặt là hiện tượng nhiễm (contamination).
1.2.4.1. Phát hiện nhiễm
Các tác nhân nhiễm phổ biến thường ñược nhận biết một cách dễ dàng, chúng có thể có hình sợi, hình cầu...Một số giống như nấm mốc, có thể quan sát chúng ngay khi không dùng kính hiển vi. Vi khuẩn hay nấm men tương ñối nhỏ, quan sát chúng cần dùng kính hiển vi. Khi chúng phát triển nhiều trong môi trường sẽ làm môi trường ñục và có tính acid cao bởi sản phẩm chuyển hóa của chúng. Do ñó bất kì ñĩa nuôi cấy nào có vẻ ñục hay có các quả cầu, các dây…trong môi trường phải nhanh chóng lấy chúng ra khỏi tủ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 17 nuôi và quan sát. Chú ý không mở nắp ñĩa nuôi tránh phát tán trong không khí, nhiễm cho các ñĩa khác.
Nếu sau khi kiểm tra khẳng ñịnh mẫu bị nhiễm, hãy cách ly các ñĩa nuôi ñó và khử trùng. Sát trùng kính hiển vi, vị trí ñặt ñĩa nuôi, tay, các dụng cụ khác bằng cồn 70º.
Một tác nhân nhiễm cần chú ý trong nuôi cấy tế bào ñộng vật in vitro
ñó là Mycoplasma. Chúng phát triển khá chậm so với vi khuẩn và nấm men, nhưng không phá hủy trực tiếp hay tức thời các tế bào. Chúng làm thay ñổi chức năng và làm chuyển hóa tế bào, gây sai hỏng nhiễm sắc thể, ảnh hưởng ñến tính kháng nguyên bề mặt, can thiệp vào trong sự tổng hợp acid nucleic, nhìn chung làm thay ñổi tập tính của tế bào.
Mycoplasma quá nhỏ ñể có thể thấy trực tiếp, trừ khi ñánh dấu huỳnh quang và sử dụng kính hiển vi ñiện tử. ðây là một nhóm vi khuẩn không có thành tế bào mà chỉ có màng nguyên sinh chất. Mycoplasma có cả trong cơ thể vật nuôi, chúng tồn tại song song với tế bào. Mycoplasma có thể sinh trưởng và phát triển trên môi trường nhân tạo không có tế bào. Cùng với khả năng gây bệnh trên người và ñộng thực vật, mycoplasma còn có mặt trong các chế phẩm sinh học như vắc xin, môi trường nuôi cấy tế bào và gây ra những khó khăn rất lớn trong nghiên cứu cũng như trong công nghệ sinh học sử dụng tế bào nuôi cấy.
1.2.4.2. Ngăn ngừa nhiễm
-Phòng thí nghiệm phải ñược lau chùi sạch sẽ, bố trí trang thiết bị hợp lý, ngăn nắp; mặc áo blouse, găng tay, tất chân ñể hạn chế tối ña các bề mặt của cơ thể tiếp xúc với không khí;
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 18 -Các bề mặt nuôi cấy, buồng thao tác, kính hiển vi, tủ nuôi và những bề mặt thao tác khác phải ñược lau chùi ñịnh kì bằng cồn hay các tác nhân diệt khuẩn khác;
-Bên trong tủ lạnh phải luôn sạch sẽ, gọn gàng. Không giữ, chứa các ống nghiệm chai lọ trong một thời gian dài. Mở nắp chai lọ phải ñúng cách ñúng chỗ;
-Các bồn nước là một nguồn chính của nhiễm. Nếu nước ñược sử dụng chứa các tác nhân nhiễm khuẩn nên thay ñổi thường xuyên;
-Tủ ấm vừa là nơi có ñiều kiện tối ưu cho các tác nhân gây nhiễm phát triển. Nước tạo ẩm cho tủ phải ñược vô trùng và nên chứa một số tác nhân khử trùng bền;
-Các mâm hay khay trong tủ ấm ñược mang ra ngoài phải ñược khử trùng và giữ trong không gian sạch sẽ cho ñến khi sử dụng;
-Lau chùi sạch sẽ, hấp khử trùng ngay khi thấy các vật dụng nuôi cấy có chứa các dấu hiệu của nhiễm vi khuẩn hay nấm mốc.
1.2.4.3. Loại bỏ nhiễm trong nuôi cấy
Cách tốt nhất ñể loại bỏ nhiễm trong nuôi cấy là bỏ ñi các ñĩa, vật dụng ñã nhiễm. Thậm chí, khi cần thiết sẵn sàng hủy bỏ cả những mẫu thí nghiệm. Khi ñó các nguồn tế bào ñông lạnh hay các nơi cung cấp hoặc các dòng tế bào phân lập phải ñược xử lý lại bằng các chất kháng khuẩn và nấm trước khi quyết ñịnh tái sử dụng.
Sau khi xử lý, các tế bào nên ñược tái thiết lập dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn. Bằng cách này, ngay khi các tế bào còn nhiễm những tác nhân nhiễm ở nồng ñộ quá thấp thì vẫn có thể tìm thấy những giếng chỉ chứa các tế bào (không có tác nhân nhiễm). Sau ñó chúng ñược nuôi và cấy chuyển trong môi trường không có kháng sinh. Sau 2 ñến 3 thế hệ, các dòng nên ñược
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 19 thu nhận lại và kiễm tra nhiễm một lần nữa. ðiều này rất quan trọng, ñặt biệt với các tác nhân nhiễm khó phát hiện như mycoplasma.