L ỜI CẢM ƠN
1.5.1. Lược sử nghiên cứu
Các nghiên cứu tại nhiều nước trong thập kỷ 60 và 70 (thế kỷ XX) cho thấy các phơi bị và cừu được tạo ra trong cơ thể (in vivo), sau đĩ thu lấy và đem nuơi in vitro thì chúng rất khĩ cĩ khả năng phát triển vượt qua giai đoạn 8-16 tế bào. Do vậy, các nhà nghiên cứu đã rất nỗ lực trong việc làm giàu, bổ sung nhiều chất khác nhau vào mơi trường nuơi phơi cổ điển để cải thiện tình hình trên. Tuy nhiên kết quả đạt được là khơng khả quan.
Sang đến thập niên 80 (thế kỷ XX), với sự phát hiện vai trị của tế bào biểu mơ ống dẫn trứng trong nuơi phơi in vitro, tình hình trên đã được cải
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 28 thiện một cách cơ bản.
Nhiều báo cáo của các nhà khoa học cho thấy việc nuơi chung (co- culture) tế bào biểu mơ ống dẫn trứng và hợp tử cũng như phơi giai đoạn sớm (2-4 tế bào) cho phép thu được các phơi ở giai đoạn phơi dâu-phơi nang khơng chỉ đối với bị mà cịn trên nhiều đối tượng động vật khác (Bị: Eyestone và First, 1986 [21], 1989 [22]; Lu và Gordon, 1987 [40]; Cừu: Gandolfi và cs, 1986 [25]; Ngựa: Battut và cs, 1991 [10]; Thỏ: Carney và cs, 1990 [12]; Chuột: Sakkas và Trounson, 1990 [59]; Người: Bongso và cs, 1994 [11]).
Tại Bỉ, Mermillod và cs (1991) đã làm thí nghiệm và chứng minh tế bào ống dẫn trứng của thỏ cĩ thể giúp phơi bị phát triển. Tuy nhiên, hiệu quả của việc thay thế tế bào biểu mơ ống dẫn trứng khác lồi này (thỏ) khơng bằng sử dụng chính tế bào biểu mơ ống dẫn trứng của lồi đĩ (bị) (Mermillod và cs, 1991) [45].
Trong giai đoạn này, cũng cĩ một nghiên cứu đáng chú ý, đĩ là sử dụng tế bào biểu mơ ống dẫn trứng bị bổ sung vào mơi trường nuơi, cĩ thể giúp phơi người phát triển tốt hơn trước giai đoạn cấy phơi hoặc đơng lạnh (Wiemer và cs, 1993) [72].
Gadolfi và cs (1986) [25]; Gadolfi và Moor (1987) [27] là một trong những nhĩm nghiên cứu đầu tiên chứng minh rằng hiện tượng “Block” ở giai đoạn 08 tế bào khơng xảy ra đối với phơi tạo ra in vivo, lấy ra ở giai đoạn trước 08 tế bào và sau đĩ đem nuơi in vitro trong sự cĩ mặt của lớp tế bào biểu mơ ống dẫn trứng. Các tác giả này đã làm việc rất nhiều và hiệu quả nhằm thiết lập một hệ thống nuơi cấy chung tế bào biểu mơ ống dẫn trứng và phơi ở vào thời điểm đĩ.
1.5.2. Phương pháp phân lập, nuơi cấy tế bào biểu mơ ống dẫn trứng
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 29 thay đổi, khác nhau giữa các phịng thí nghiệm cũng như nhĩm nghiên cứu. ðầu tiên, cĩ thể kể đến là phương pháp sử dụng enzym (Eyestone và First, 1986 [21]; Lu và Gordon, 1987 [40]), kế đến cĩ thể đề cập phương pháp thụt rửa đơn giản ống dẫn trứng của động vật sống (McCaffrey và cs, 1990 [43]) hoặc hiện nay là sử dụng các động vật ở lị mổ để thu ống dẫn trứng và tách lớp tế bào biểu mơ ống dẫn trứng tại phịng thí nghiệm (Vergos, 1990 [69]).
Phương pháp sử dụng Trypsin để phân tách và nhân nuơi tế bào biểu mơ ống dẫn trứng của nhiều lồi khác nhau được mơ tả bởi Ouhibi và cs (1988) [51].
Trong các nghiên cứu ban đầu về việc thu nhận tế bào biểu mơ ống dẫn trứng ở bị, các nhà nghiên cứu đặt ra câu hỏi là: việc thu nhận tế bào nên được tiến hành vào giai đoạn nào của chu kỳ động dục. Nghĩa là, liệu cĩ sự khác nhau hay khơng về hiệu quả tạo phơi dâu-phơi nang khi thu nhận tế bào biểu mơ ống dẫn trứng ở pha thể vàng hoặc pha trứng rụng…Một nghiên cứu của Vergos (1990) [69] đã chứng minh được rằng trạng thái sinh lý của chu kỳ động dục là khơng cĩ giá trị quan trọng cho việc thu nhận tế bào biểu mơ ống dẫn trứng.
Kết quả nghiên cứu của Thibodeaux và cs (1991) [66] tại Mỹ cũng chỉ ra rằng tế bào biểu mơ ống dẫn trứng thu nhận ở giai đoạn sớm hoặc muộn của thể vàng của chu kỳ động dục là hồn tồn tương đương nhau về mặt hiệu quả khi nuơi cấy chung với phơi bị giai đoạn sớm.
Tuy nhiên, một vấn đề mà các nhà khoa học phải quan tâm, đĩ là tính ổn định ở trạng thái bình thường của tế bào ống dẫn trứng khi được nuơi in vitro trong một khoảng thời gian dài (Gandolfi và cs, 1989) [26].
1.5.3. Các loại mơi trường nuơi được sử dụng với lớp đơn tế bào biểu mơ ống dẫn trứng
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 30 mơi trường Ham’F-10 khi nuơi phơi trong sự cĩ mặt của tế bào biểu mơ ống dẫn trứng (Lu và Gordon, 1987) [40].
Tại Pháp, Marquant-Le Guienne và cs (1989) [41] đã tiến hành nuơi phơi bị trong mơi trường B2 cĩ bổ sung OCS trên lớp tế bào biểu mơ ống dẫn trứng.
Ngồi ra, cĩ thể sử dụng một số loại mơi trường khác để nuơi phơi như mơt trường CR1aa, KSOM, SOF (Synthetic Oviductal Fluid) (Dhali và cs, 2009 [15]; Neira và cs, 2010 [49]; Leivas và cs, 2011 [37]; Varga và cs, 2011 [68]).
Mơi trường Eagle Minimal Essential Media (E’MEM) hoặc Dulbecco’s Modified Eagle’s media (D’MEM) là mơi trường thơng thường dùng để nuơi cấy tế bào biểu mơ ống dẫn trứng.
Mơi trường D’MEM do Dulbecco cải tiến từ mơi trường E’MEM cĩ nồng độ amino acid cao gấp đơi, nồng dộ vitamin cao gấp bốn mơi trường E’MEM, tối ưu cho nuơi cấy tế bào cĩ mật độ cao.
Chính vì vậy mà D’MEM là mơi trường thương phẩm thích hợp cho nuơi cấy nhiều loại tế bào động vật (Amy, 2006 [6]; Jang và cs, 2008 [31]).
1.5.4. Bảo quản lạnh tế bào biểu mơ ống dẫn trứng
Các kỹ thuật đơng lạnh-giải đơng tế bào ống dẫn trứng bị tương tự các kỹ thuật đơng lạnh-giải đơng tế bào động vật.
1.6. Ảnh hưởng của việc bổ sung tế bào biểu mơ ống dẫn trứng vào mơi trường nuơi phơi bị trường nuơi phơi bị
1.6.1. Vi mơi trường trong ống dẫn trứng
Ống dẫn trứng bị kiểm sốt bởi chất nội tiết vịng, cĩ khả năng cĩ mối quan hệ động học với phơi phát triển sớm; sự thiếu của phụ chất trong ống dẫn trứng cĩ thể cĩ thể gây nguy hại cho khả năng phát triển của phơi bị trong điều kiện nuơi cấy trong ống nghiệm.
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 31 Ở Thụy Sỹ, Rosselli và cs (1994) [57] cung cấp bằng chứng đầu tiên rằng nội mạc (endothelin) được tạo bởi mơi trường BOECs; các tác giả gợi ý rằng peptide này cĩ thể hoạt động như nhân tố ngoại tiết tác động đến lớp tế bào dưới cơ trơn, liên quan đến sự co thắt đường ống dẫn trứng. Các tác giả suy đốn rằng endothelin (nội mạc) cĩ thể đĩng vai trị quan trọng trong sự vận chuyển giao tử và phơi bị. Tổng quan của Hunter (1994) [29] đối với glycoprotein trong ống dẫn trứng và đánh giá một số mối quan hệ hoạt động nhỏ cĩ thể tồn tại, và cĩ thể định hướng thuận lợi cho giao tử và phơi, giữa các thành phần dịch ống dẫn trứng ở tại thời điểm rụng trứng và thời gian ngắn sau đĩ.
Ở New York (Mỹ), Cox và Leese (1994) [13] báo cáo các bằng chứng gợi ý sự cĩ mặt của thụ thể chức năng tinh khiết trong thượng bì của ống dẫn trứng bị, đĩng vai trị trong sự di chuyển trao đổi thượng bì và do đĩ tác động đến sự hình thành dịch ống dẫn trứng.
Trên cừu, bằng chứng cung cấp bởi Steveson và Wathes (1994) [63] gợi ý hệ thống nội tiết/ ngoại tiết liên quan đến họ các nhân tố sinh trưởng giống insulin hoạt động trong ống dẫn trứng; nĩ là một nhân tố cung cấp mơi trường thích hợp cho sự phát triển phơi sớm.
Ở Mỹ, Martus và cs (1997) [42] chú ý rằng glycoproteins đặc hiệu trong ống dẫn trứng được tiết bởi thượng bì ống dẫn trứng và được xác nhận trong một số lồi động vật cĩ vú; họ nghiên cứu ảnh hưởng của các protein trong ống dẫn trứng được tinh sạch từng phần trong sự phát triển và hình thành phơi, mà nĩ làm tăng lượng phát triển phơi đến giai đoạn phơi dâu-phơi nang trong 7 ngày. Nhĩm nghiên cứu cũng kết luận rằng các glycoproteins cĩ vai trị quan trọng trong sự điều hịa phát triển phơi.
Ở Anh, Pushpakumara và cs (2002) [54] đưa ra các dữ liệu về hệ thống IGF trong các vùng khác nhau của ống dẫn trứng bị và chứng tỏ sự thích hợp
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 32
của các dữ liệu với sự thụ tinh và sự phát triển phơi sớm ở bị; họ chú ý rằng
phơi bị sớm biểu hiện sự phiên mã các gen mã hĩa cho một loại thụ thể sau
tuần đầu tiên của sự phát triển và IGF-I tiết bởi dịch ống dẫn trứng cĩ thể hoạt
động như chất điều hịa ngoại tiết (paracrine) trong sự phát triển phơi sớm.
1.6.2. ðồng nuơi cấy phơi với tế bào biểu mơ ống dẫn trứng bị
Sự ra đời của việc đồng nuơi cấy phơi bị và cừu với các tế bào soma thực hiện từ cuối thế kỷ XX, vào thời điểm đĩ được coi là một mốc quan trọng trong việc khắc phục việc phát triển của phơi ở giai đoạn 8 đến 16 tế bào. Các kỹ thuật viên tại Cambridge đã thiết lập hệ thống đồng nuơi cấy ống dẫn trứng động vật nhai lại sử dụng như hệ thống nuơi cấy thường, thay thế thích hợp tại thời điểm đĩ (Gandolfi và Moor, 1987) [27]. Thực tế là giai đoạn phơi diễn ra trong ống dẫn trứng là một hệ thống nuơi cấy thích hợp hơn, được mơ hình hĩa trên sự hiểu biết về mơi trường ống dẫn trứng, cĩ thể cĩ giá trị trong việc cải thiện hệ thống sản xuất phơi bị.
Tại ðức, Rief và cs (2002) [55] mơ tả hệ thống nuơi cấy của BOECs trong SOF cùng với 5% huyết thanh bị động dục (OCS), họ đề nghị thiết lập mơ hình in vitro để nghiên cứu sự phát triển phơi sớm, hệ thống này nhạy cảm với các chỉ số sinh học của sự phát triển phơi thai bình thường, chẳng hạn như quá trình chuyển hĩa năng lượng và biểu hiện của các gen phát triển phơi.
Ống dẫn trứng bị cung cấp vi mơi trường cho việc cấy chuyển và giao tử cuối thành thục, thụ tinh và phát triển sớm của phơi. Việc thiết lập các lớp đơn BOECs bổ sung trong các thí nghiệm để cung cấp vi mơi trường tương tự trong cơ thể. Rất nhiều bài báo đã được cơng bố về các đơn lớp BOECs. Cĩ một số lưu ý rằng các tế bào ống dẫn trứng phát triển trong một lớp đơn nhanh chĩng trải qua sự tiền biệt hĩa, chúng bám dính vào bề mặt nuơi cấy, trở nên bằng phẳng, mất đi hình dạng cột và lơng mao đặc trưng. Trong nuơi cấy, các tế bào biểu mơ ống dẫn trứng bắt đầu phân chia thường xuyên, trái ngược với
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 33 hoạt động của chúng trong in vivo, ở đĩ sự phân bào là rất hiếm, thay đổi như vậy cĩ thể dẫn đến sự mất hoạt động của các gen steroid, cĩ thể thơng qua bất hoạt hoặc mất mát của các thụ thể. Rõ ràng, những thay đổi như vậy sẽ tạo mơi trường khác nhau ở nhiều khía cạnh từ trong ống dẫn trứng.
Tại Bắc Mỹ, Xia và cs (1995) [73] lưu ý rằng nuơi cấy lớp đơn biểu mơ ống dẫn trứng cĩ thể hỗ trợ sự phát triển sớm của phơi bị, nhưng, nếu tỉ lệ phát triển đến giai đoạn phơi nang cao được duy trì, phơi phải được cấy chuyển 2-3 ngày một lần để cấy lớp đơn mới trong 48 giờ. Mặt khác, các tế bào biểu mơ bị khơng dính cĩ khả năng hỗ trợ sự phát triển giai đoạn phơi nang mà khơng cần cấy chuyển như vậy. Các kỹ thuật viên kiểm tra hai hệ thống nuơi cấy với sự cĩ mặt của glycoproteins liên quan động dục, kết quả của những nghiên cứu này tích cực hơn cho các tế bào biểu mơ khơng dính.
Khơng những thế, đã cĩ báo cáo cho thấy rằng hệ thống nuơi cấy lớp đơn BOECs cĩ hiệu quả cao trong việc thúc đẩy sự phát triển của phơi gia súc. Tại Ireland, Sreenan và cs, 2001 [62] đã kiểm tra sự phát triển của phơi gia súc từ giai đoạn 1 tế bào đến giai đoạn phơi nang dù cĩ nguồn gốc in vitro
hay in vivo (thu hồi từ các ống dẫn trứng). ðồng nuơi cấy thành cơng với phơi
in vivo nhưng lại ít so với IVM/ IVF. Lonergan và cs (2001) [39] cũng khẳng định rằng, bất kể nguồn gốc của hợp tử (in vivo hoặc thụ tinh trong ống nghiệm), hệ thống nuơi cấy sử dụng trong việc đưa hợp tử đến giai đoạn phơi nang (in vitro hoặc in vivo) là yếu tố quyết định chủ yếu của chất lượng phơi (Lonergan và cs, 2001) [39].
Trong số các báo cáo xuất hiện trong thập kỷ gần đây, việc sử dụng các tế bào biểu mơ ống dẫn trứng lợn trong phát triển phơi gia súc (Pavasuthipaisit và cs, 1994) [53]; tế bào biểu mơ ống dẫn trứng dường như tạo ra một thành phần hịa tan giúp tăng cường sự phát triển của phơi nhưng khơng phải là đặc hiệu lồi. Kết quả trình bày bởi Satoh và cs (1994) [60] cho
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 34 rằng chất ức chế mơ của Metallo proteinase-1 được sản xuất bởi các tế bào biểu mơ ống dẫn trứng bị giúp kích thích phát triển phơi. Tại Beltsville – Mỹ, Hawk và Wall (1994) [28] báo cáo chỉ ra rằng cách kết hợp tốt nhất giúp hỗ trợ phơi gia súc trong in vitro là mơi trường B2 và BOECs cho đồng nuơi cấy. Báo cáo từ Trung Quốc, Feng và cs (1994) [24] ghi lại việc thành lập một hệ thống nuơi cấy hiệu quả và đáng tin cậy, bằng cách sử dụng BOECs.
Ở Texas – Mỹ, Applewhite và Westhusin (1995) [7] cho thấy nhiều phơi phát triển đến giai đoạn phơi dâu/ giai đoạn túi phơi khi bổ sung các tế bào biểu mơ ống dẫn trứng vào mơi trường nuơi cấy. Ở Utah, Wang và cs (1995) [71] đã kết luận rằng các tế bào biểu mơ ống dẫn trứng đã được kết hợp với FCS để phát huy đầy đủ các hệ thống đồng nuơi cấy. Ở Ba Lan, Katska và cs (1995) [35] cho thấy rằng nguồn gốc của các tế bào biểu mơ ống dẫn trứng và những tế bào đã được bảo quản lạnh cĩ ảnh hưởng về hiệu quả tới sự phát triển của phơi bị. Báo cáo của Edwards và cs (1997) [18] sử dụng một số thay đổi trong mơi trường nuơi cấy phơi sản xuất bởi các tế bào biểu mơ ống dẫn trứng bị. Tại Tây Ban Nha, Diez và cs (1999) [16] cho thấy các lơ BOECs khác nhau biểu hiện mức độ hoạt động nuơi phơi (embryotrophic) khác nhau, được phản ánh trong các mơ hình tương tự của sự phát triển của phơi, một số lơ được cho là yếu tố thiếu cần thiết để đạt đến giai đoạn phơi dâu-phơi nang muộn.
Tại Nhật Bản, Kamishita và cs (1999) [33] đã nghiên cứu ảnh hưởng của BOECs thu thập từ các ống dẫn trứng cùng bên nang đến sự phát triển của phơi gia súc IVP, họ đã cho thấy rằng sản lượng phơi từ các tế bào ống dẫn trứng bị chi phối bởi động dục là cao hơn đáng kể hơn so với từ các tế bào chứa nhiều progesterone (61,6% so với 39.5%). Tại Mỹ, Mishra và cs (1999) [46] lưu ý rằng BOECs chứa Luteinizing Hormone (LH) và các thụ thể cĩ chức năng trong việc tăng sự tổng hợp của glycoprotein ống dẫn trứng, được
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nơng nghiệp ……… 35 biết đến để tăng cường sự phát triển của phơi sớm thành phơi nang, họ theo dõi sự tiến bộ của phơi gia súc sau khi điều trị bằng lớp đơn tế bào biểu mơ bị với yếu tố tiền hormon Luteinizing Hormone. Họ ghi nhận một sự gia tăng đáng kể trong sản lượng phơi nang sau khi điều trị như vậy.
Một nghiên cứu do Tavares và cs (2000) [65] tại Brazil thực hiện, đồng nuơi cấy hợp tử trong TCM-199 với ống dẫn trứng bị hoặc các tế bào granulosa, các tế bào BRL hoặc Vero, họ khơng tìm thấy sự khác biệt đáng kể trong lượng phơi nang giữa những hệ thống nuơi cấy nhưng cần thiết phải nỗ lực để cải thiện những kết quả trên.
Khác với phơi người và phơi thỏ, ở một số lồi động vật khác, người ta quan sát thấy cĩ hiện tượng “Block (ngưng trệ)” ở phơi nuơi in vitro. Cụ thể, hiện tượng này thường gặp ở giai đoạn phơi bị đạt 8-16 tế bào, nĩ làm phơi thụ tinh trong ống nghiệm khơng tiếp tục phát triển thành phơi dâu hoặc phơi nang, khiến tỉ lệ phơi dâu-phơi nang thu được khơng cao. Hiện tượng “Block”
