MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ pot

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐỖ HOÀNG KHIÊM MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN ĐỖ HOÀNG KHIÊM BSTY QUÁCH TUYẾT ANH KS NGUYỄN VĂN ÚT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 Khóa: 2002-2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** FACTORS EFFECT ON THE RESULT OF CULTURE OF OVIDUCTAL EPITHELIAL CELLS AND DOG SPERM CAPACITATION Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: A.Professor Dr TRAN THI DAN DO HOANG KHIEM Veterinarian QUACH TUYET ANH Term: 2002 - 2006 Engineer NGUYEN VAN UT Ho Chi Minh City 09/2006 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến: Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, tất quý thầy cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học trƣờng Cơ Trần Thị Dân hết lịng hƣớng dẫn tơi suốt trình thực tập tốt nghiệp, gƣơng lao động, phong cách làm việc cần đƣợc noi theo Thầy Đinh Xuân Phát, cô Quách Tuyết Anh thầy Nguyễn Văn Út truyền đạt cho kinh nghiệm sống làm việc, tận tình giúp đỡ dẫn cho tơi suốt q trình thực tập Thầy Trần Ngọc Hùng truyền đạt cho kinh nghiệm trình thực tập tốt nghiệp Thầy Nguyễn Văn Thuận thầy Nguyễn Thanh Bình truyền đạt kinh nghiệm nghiên cứu thực tế cho tơi Gia đình Bác Sáu, gia đình chị Hạnh gia đình anh Phƣớc tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đề tài Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 ngƣời bạn thân chia vui buồn nhƣ hỗ trợ tơi q trình thực tập tốt nghiệp Thủ Đức, ngày 15-08-06 Đỗ Hồng Khiêm iv TĨM TẮT KHĨA LUẬN Đỗ Hồng Khiêm, Đại học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh, tháng 8/2006 “MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ” Hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS TRẦN THỊ DÂN BSTY QUÁCH TUYẾT ANH KSCNSH NGUYỄN VĂN ÚT Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 06/02/2006 đến 06/07/06 trƣờng Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh Ngày nay, kỹ thuật thụ tinh in vitro ngày đƣợc hoàn thiện có tiềm lớn việc ứng dụng nhân giống nhanh thú cao sản thú quý Để tiếp cận kỹ thuật tiến hành nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng xác định ảnh hƣởng thời gian bảo quản đến phản ứng hoạt hóa tinh trùng nhằm hồn thiện dần công đoạn việc nâng cao tỉ lệ chó quý đƣợc tạo từ kỹ thuật thụ tinh in vitro Kết đạt đƣợc nhƣ sau: Thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng nhanh với phƣơng pháp vuốt ni cấy bị nhiễm phƣơng pháp cạo Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng phƣơng pháp sử dụng kính (lamelle) cho tỉ lệ thành cơng 28,6% (tỉ lệ đĩa xuất cấu trúc “bóng nƣớc”) phƣơng pháp khơng sử dụng kính cho kết thất bại Thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng Chất lƣợng tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa mốc thời gian bảo quản tốt nhất, với hoạt lực trung bình cao (0,78 ± 0,08) cƣờng độ hoạt động trung bình cao (6,33 ± 1,03) v MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Bìa i Bìa ii Lời cảm tạ iii Tóm tắt khóa luận iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách bảng viii Danh sách hình ix PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cấu tạo chức ống dẫn trứng .3 2.1.1 Cấu tạo 2.1.2 Chức .4 2.1.2.1 Chức vận chuyển noãn tinh trùng .4 2.1.2.2 Vai trò sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng .4 2.2 Một số đặc điểm sinh học ni cấy tế bào ngồi thể 2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào 2.3.1 Bề mặt chai cấy .6 2.3.2 Các đặt tính vật lý 2.3.2.1 pH 2.3.2.2 Dung dịch đệm 2.3.2.3 Áp suất thẩm thấu 2.3.2.4 Nhiệt độ 2.3.2.5 Áp lực bề mặt bọt khí 2.3.2.6 Độ nhớt 2.3.3 Tủ cấy 2.3.4 Kháng sinh 2.4 Vấn đề nhiễm nuôi cấy tế bào 2.4.1 Nguồn nhiễm 2.4.2 Hình ảnh đặc trƣng nhiễm vi sinh vật 2.4.3 Yêu cầu ngƣời thao tác .9 2.5 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào 2.6 Các quy trình ni cấy tế bào thông dụng .10 2.6.1 Nuôi cấy sơ cấp .10 2.6.2 Nuôi cấy thứ cấp 11 2.7 Xác định tế bào sống chết phƣơng pháp nhuộm trypan blue 11 2.8 Một số cơng trình ứng dụng ni cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng 11 2.8.1 Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bị đồng ni cấy với phơi 11 2.8.2 Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó 12 2.9 Tinh trùng 13 2.9.1 Sơ lƣợc trình sản sinh tinh trùng 13 vi 2.9.2 Cấu tạo tinh trùng 14 2.9.3 Đặc tính tinh trùng 15 2.9.4 Sự vận chuyển tinh trùng dƣờng sinh dục .16 2.10 Mơi trƣờng pha lỗng – bảo quản tinh trùng chó 17 2.10.1 Các yếu tố ảnh hƣởng tồn tinh trùng 17 2.10.2 Một số mơi trƣờng bảo quản tinh trùng chó .19 2.11 Hoạt hóa tinh trùng 20 PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3.1 Nội dung 23 3.2 Thời gian địa điểm thực 23 3.3 Vật liệu 23 3.3.1 Nguồn mẫu 23 3.3.2 Dụng cụ thiết bị 23 3.3.3 Hoá chất 24 3.4 Phƣơng pháp 25 3.4.1 Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng 25 3.4.1.1 Thu thập ống dẫn trứng lò mổ 25 3.4.1.2 Xử lí ống dẫn trứng phịng thí nghiệm 25 3.4.1.3 Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng 26 3.4.1.4 Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng .28 3.4.1.5 Nhuộm tế bào biểu mô ống dẫn trứng trypan blue 29 3.4.2 Chuẩn bị tinh trùng cho trình thụ tinh in vitro 30 3.4.2.1 Thu nhận vận chuyển mẫu tinh trùng phịng thí nghiệm 30 3.4.2.2 Hoạt hóa tinh trùng .30 3.5 Xử lí số liệu 34 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1 Thí nghiệm 1: thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng 35 4.2 Thí nghiệm 2: so sánh phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng 35 4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa .37 4.3.1 Hoạt lực tinh trùng 37 4.3.2 Nồng độ tinh trùng 38 4.3.3 Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình 39 4.3.4 Tỉ lệ tinh trùng sống, nguyên vẹn acrosome 40 4.3.5 Cƣờng độ hoạt động tinh trùng 41 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 5.1 Kết luận 44 5.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC .47 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT AR: acrosome reaction BOEC: bovine oviductal epithelial cells BSA: bovine serum albumin DNA: deoxyribonucleic acid DNP: deoxyribonucleoprotein ECS: estrous cow serum EGF: epidermal growth factor ELISA: enzyme linked immunosorbent assay ET: embryo stransfer FBS: phosphate buffered saline FCS: fetal calf serum FGF: fibroblast growth factor HSA: human serum albumin IGF: insulin – like growth factor IVC: in vitro culture IVF: in vitro fertilization IVM: in vitro maturation M II: metaphase II PCR: polymerase chain reaction PDGF: platelet – derived growth factor RNA: ribonucleic acid viii DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Giá trị pH .7 Bảng 2.2 Mối quan hệ HCO3-, CO2 HEPES Bảng 2.3 Công thức mơi trƣờng bảo quản tinh chó Iguer Verstegen .19 Bảng 2.4 Công thức pha chế môi trƣờng 20 Bảng 4.1 Sự xuất cấu trúc “bóng nƣớc” phƣơng pháp nuôi cấy .35 Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực tinh trùng 37 Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng 38 Bảng 4.4 Sự biến thiên tỉ lệ tinh trùng kỳ hình 39 Bảng 4.5 Sự biến thiên tỉ lệ tinh trùng sống, nguyên vẹn acrosome .40 Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động tinh trùng 42 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau ngày ni cấy 36 Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) tế bào chết (trong vòng tròn) 36 Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm trƣớc phản ứng hoạt hóa 41 Hình 4.4 Tinh trùng đƣợc nhuộm sau phản ứng hoạt hóa 41 Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng 43 BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực tinh trùng 37 Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ tinh trùng 38 Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình 39 Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống nguyên acrosome 40 Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động tinh trùng 42 x 34 48 hay trƣớc sau phản ứng hoạt hóa, cƣờng độ hoạt động tinh trùng đƣợc tính cơng thức: CD = số lần tăng giảm cƣờng độ hoạt động so với cƣờng độ gốc 3.5 Xử lí số liệu Số liệu đƣợc xử lý trắc nghiệm F chi – square phần mềm Statgraphics 7.0 35 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: so sánh hai phƣơng pháp thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng Tế bào biểu mô ống dẫn trứng chó đƣợc thu thập lần với tổng số 14 đĩa (2 – ống dẫn trứng/đĩa): đĩa đƣợc thu thập phƣơng pháp vuốt đĩa đƣợc thu thập phƣơng pháp cạo Cả hai phƣơng pháp thu thập đƣợc tế bào biểu mô ống dẫn trứng dƣới dạng mảnh mô nhƣ Xu ctv (1992) mô tả Số đĩa bị nhiễm vi sinh vật đƣợc thu nhận từ phƣơng pháp vuốt phƣơng pháp cạo, tƣơng ứng 0% 14,3% (một đĩa có mơi trƣờng chuyển sang màu vàng) Do kích thƣớc ống dẫn trứng chó nhỏ (đƣờng kính 0,5 – 0,8 mm), gây trở ngại thao tác phƣơng pháp cạo nhƣ dễ cạo phạm vào lớp đệm tầng niêm mạc lớp trơn tầng nên thao tác cạo đòi hỏi phải đặt mẫu lên đầu ngón tay để làm điểm tựa phải đặt cận mắt (sát cửa tủ cấy) làm tăng khả nhiễm vi sinh vật Ngoài ra, phƣơng pháp vuốt, tiến hành vuốt theo chiều dọc ống dẫn trứng, phƣơng pháp cạo cạo cục phần ống dẫn trứng nên thời gian thực thao tác vuốt nhanh thao tác cạo, tƣơng ứng 30 giây 60 giây Tế bào biểu mô ống dẫn trứng ngồi mơi trƣờng dinh dƣỡng lâu bất lợi cho khả tồn tế bào Vì phƣơng pháp vuốt cho khả thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng tốt phƣơng pháp cạo 4.2 Thí nghiệm 2: so sánh phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng Sau thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng, nuôi cấy theo phƣơng pháp: sử dụng kính (lamelle) khơng sử dụng kính Kết xuất cấu trúc “bóng nƣớc” (vesicle - like) đƣợc trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Sự xuất cấu trúc “bóng nƣớc” phƣơng pháp ni cấy Số đĩa có Sử dụng kính Tỉ lệ % đĩa xuất có xuất có xuất “bóng nƣớc” Phƣơng pháp Số đĩa khơng “bóng nƣớc” “bóng nƣớc” 28,6 p 0,0021 Khơng sử dụng kính 36 Bảng 4.1 cho thấy phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mơ ống dẫn trứng sử dụng kính phƣơng pháp khơng sử dụng kính có khác biệt ý nghĩa (p < 0,01) xét tiêu có hay khơng có xuất cấu trúc “bóng nƣớc” mà Xu ctv (1992) mơ tả Cấu trúc “bóng nƣớc” bắt đầu xuất vào ngày thứ ni cấy (hình 4.1) giống nhƣ kết mà Xu ctv (1992) ghi nhận Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau ngày nuôi cấy (x 400) Nhƣ vậy, tỉ lệ đĩa nuôi cấy đạt tiêu đánh giá phƣơng pháp có sử dụng kính (28,6%) cao phƣơng pháp khơng sử dụng kính (0%) Những mảnh tế bào biểu mơ đƣợc kính cố định giảm dao động trình di chuyển quan sát đĩa dƣới kính hiển vi, kính đóng vai trị nhƣ giá đỡ tế bào Hơn nữa, trọng lực kính tạo áp lực bề mặt giúp số tế bào tiếp xúc với đĩa có khả bám tốt Để chứng minh cho tồn tế bào ống dẫn trứng chó gắn liền với xuất cấu trúc “bóng nƣớc”, đĩa có xuất cấu trúc “bóng nƣớc” đƣợc nhuộm trypan blue vào ngày thứ 14 nuôi cấy Kết nhuộm cho thấy: bên cạnh tế bào chết đĩa cịn tế bào có khả tồn (hình 4.2) tỉ lệ tế bào sống trung bình 44% Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) tế bào chết (trong vòng tròn) (x 200) 37 4.3 Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa lên chất lƣợng tinh trùng 4.3.1 Hoạt lực tinh trùng Hoạt lực tinh trùng dƣới tác động yếu tố: thời gian bảo quản phản ứng hoạt hố đƣợc trình bày bảng 4.2 Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực tinh trùng Thời gian bảo quản Phản ứng Trƣớc hoạt Sau hoạt hoạt hóa hóa hóa 0,72 ± 0,08 0,78 ± 0,08 Hoạt lực n PTG PPƢ PTG - PƢ Ghi chú: 24 48 Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa 0,65 ± 0,06 0,75 ± 0,06 0,53 ± 0,05 0,77 ± 0,05 0,0017 0,0000 0,0057 n: số lần lập lại PTG: xác suất sai lầm yếu tố thời gian bảo quản PPƢ: xác suất sai lầm yếu tố phản ứng hoạt hóa PTG – PƢ: xác suất sai lầm tƣơng tác yếu tố thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa tinh trùng 0,9 0,8 Hoạt Lực 0,7 0,6 0,5 Trước hoạt hoá 0,4 Sau hoạt hoá 0,3 0,2 0,1 0 24 48 Thời gian bảo quản Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực tinh trùng Kết bảng 4.2 cho thấy hoạt lực tinh trùng mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 48 giờ) có khác biệt ý nghĩa (PTG < 0,01) Hoạt lực tinh trùng 38 giảm dần theo thời gian bảo quản, kết phù hợp với ghi nhận Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) Hoạt lực tinh trùng trƣớc sau phản ứng hoạt hóa có khác biệt cao (PPƢ < 0,001) Hoạt lực tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa cao trƣớc hoạt hóa, kết phù hợp với báo cáo Younglai ctv (2001) Tinh trùng thu đƣợc sau trình hoạt hóa tinh trùng có khả bơi lội tốt (Phan Trƣờng Duyệt Phan Khanh Vy, 2001) Sự tƣơng tác yếu tố thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa có ý nghĩa (PTG – PƢ < 0,01) Nhƣ vậy, yếu tố thời gian bảo quản có ảnh hƣởng đến hoạt lực tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa 4.3.2 Nồng độ tinh trùng Nồng độ tinh trùng đƣợc khảo sát trƣớc tác động thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa Kết đƣợc trình bày bảng 4.3 Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng Thời gian 24 48 bảo quản Phản ứng Trƣớc hoạt Sau hoạt Trƣớc Sau hoạt Trƣớc Sau hoạt hoạt hóa hóa hóa hoạt hóa hóa hoạt hóa hóa Nồng độ 130 ± 36,68 9,83 ± 2,91 130 ± 36,68 2,77 ± 1,30 130 ± 36,88 1,58 ± 0,87 (x 106/ml) n PTG 0,2323 PPƢ 0,0000 PTG – PƢ 0,2323 Nồng độ (x 1000000/ml) 140 120 100 Trước hoạt hóa 80 Sau hoạt hóa 60 40 20 0 24 48 Thời gian bảo quản Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ tinh trùng 39 Kết bảng 4.3 cho thấy nồng độ tinh trùng thay đổi khơng có ý nghĩa (PTG > 0,05) mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 48 giờ) Ngƣợc lại, nồng độ tinh trùng trƣớc sau phản ứng hoạt hóa có khác biệt cao (PPƢ < 0,001) Nồng độ tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa thấp trƣớc phản ứng, kết phù hợp với kết Younglai ctv (2001) Sự tƣơng tác yếu tố thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa khơng có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05) Nhƣ vậy, bảo quản 48 không ảnh hƣởng đến nồng độ tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa 4.3.3 Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình đƣợc khảo sát trƣớc tác động thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa, kết đƣợc trình bày bảng 4.4 Bảng 4.4 Sự biến thiên tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Thời gian 24 48 bảo quản Phản ứng Trƣớc hoạt Sau hoạt Trƣớc Sau hoạt Trƣớc Sau hoạt hoạt hóa hóa hóa hoạt hóa hóa hoạt hóa hóa Kỳ hình 16,08 ± 3,11 6,18 ± 0,78 16,08 ± 3,11 6,93 ± 2,07 16,08 ± 3,11 6,18 ± 1,63 (%) n PTG 0,9118 PPƢ 0,0000 PTG – PƢ 0,9118 18 16 Kỳ hình (%) 14 12 Trước hoạt hóa 10 Sau hoạt hóa 0 24 48 Thời gian bảo quản Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Bảng 4.4 cho thấy tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thay đổi không ý nghĩa (PTG > 0,05) mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 48 giờ) Ngƣợc lại, tỉ lệ tinh trùng 40 kỳ hình sau phản ứng hoạt hóa giảm ý nghĩa (PPƢ < 0,001) so với trƣớc phản ứng, kết phù hợp với báo cáo Younglai ctv (2001) Tinh trùng kỳ hình thƣờng có khả bơi lội khơng có khả bơi lội nên phần tinh trùng thu đƣợc sau q trình hoạt hóa có tinh trùng kỳ hình Tƣơng tự trƣờng hợp thụ tinh in vivo, tử cung dịch ống dẫn trứng tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thấp so với tinh dịch nguyên (Nguyễn Tấn Anh Nguyễn Quốc Đạt, 1997) Sự tƣơng tác yếu tố thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa khơng có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05) Nhƣ vậy, thời gian bảo quản không ảnh hƣởng đến tỉ lệ kỳ hình tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa 4.3.4 Tỉ lệ tinh trùng sống, cịn nguyên vẹn acrosome Tỉ lệ tinh trùng sống nguyên acrosome đƣợc khảo sát trƣớc tác động thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa, đƣợc trình bày bảng 4.5 Bảng 4.5 Sự biến thiên tỉ lệ tinh trùng sống, nguyên vẹn acrosome Thời gian 24 48 bảo quản Phản ứng Trƣớc hoạt Sau hoạt Trƣớc Sau hoạt Trƣớc Sau hoạt hoạt hóa hóa hóa hoạt hóa hóa hoạt hóa hóa Sống cịn acrosome 80,75 ± 3,82 36,38 ± 8,48 74,33 ± 4,89 26,38 ± 3,80 67,42 ± 5,02 27,8 ± 5,28 (%) n PTG 0,0001 PPƢ 0,0000 PTG - PƢ 0,1879 Sống acrosome (%) 90 80 70 60 Trước hoạt hóa 50 Sau hoạt hóa 40 30 20 10 0 24 48 Thời gian bảo quản Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống nguyên acrosome 41 Bảng 4.5 cho thấy tỉ lệ tinh trùng sống nguyên vẹn acrosome giảm dần theo thời gian bảo quản (PTG < 0,001) Kết phù hợp với kết luận Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) Ngoài ra, tỉ lệ tinh trùng sống nguyên vẹn acrosome sau phản ứng hoạt hóa thấp trƣớc phản ứng (PPƢ < 0,001)(hình 4.3 hình 4.4) Nồng độ Ca2+ cao môi trƣờng Sperm – TALP – làm tăng phản ứng acrosome tinh trùng (Sirivaidyapong ctv, 1999) Thêm vào đó, diện thụ quan cholesterol (BSA) làm ổn định màng tinh trùng (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003) Hai nguyên nhân có lẽ liên quan đến dẫn liệu Nguyễn Tấn Anh Nguyễn Quốc Đạt (1997); theo tác giả phân bố lại protein màng sinh chất quanh acrosome thay đổi thành phần lipid màng sinh chất màng ngồi acrosome có khả làm rách màng acrosome Do sau hoạt hóa, tinh trùng bị rách màng acrosome (hình 4.4) Điều có lẽ trở thành cở sở cho việc phóng thích enzyme hyaluronidase để phân hủy liên kết tế bào hạt (cumulus cell) bao quanh tế bào trứng trình thụ tinh Sự tƣơng tác yếu tố thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa khơng có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05) Nhƣ vậy, bảo quản 48 khơng ảnh hƣởng đến tỉ lệ sống cịn nguyên vẹn acrosome tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm trƣớc phản ứng hoạt hóa (x 1000) Hình 4.4 Tinh trùng nhuộm (x 1000) sau phản ứng hoạt hóa có màng acrosome khơng đồng (mũi tên) 4.3.5 Cƣờng độ hoạt động tinh trùng Cƣờng độ hoạt động tinh trùng đƣợc khảo sát trƣớc tác động thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa Kết đƣợc trình bày bảng 4.6 42 Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động tinh trùng Thời gian bảo quản Phản ứng hoạt hóa Cƣờng độ hoạt động n PTG PPƢ PTG - PƢ 24 48 Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa Trƣớc hoạt hóa Sau hoạt hóa ± 0,00 6,33 ± 1,03 0,94 ± 0,02 4,4 ± 0,81 0,88 ± 0,03 2,95 ± 0,51 0,0000 0,0000 0,0000 Cường độ Trước hoạt hóa Sau hoạt hóa 0 24 48 Thời gian bảo quản Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động tinh trùng Kết bảng 4.6 cho thấy cƣờng độ hoạt động tinh trùng thay đổi ý nghĩa (PTG < 0,001)giữa mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 48 giờ) Cƣờng độ hoạt động tinh trùng cao mốc thời gian giảm dần theo thời gian bảo quản Có lẽ tinh trùng tiêu tốn lƣợng nhiều cho việc di chuyển môi trƣờng bảo quản Tinh trùng có đặc tính ln chuyển động phía trƣớc (Trần Tiến Dũng, 2002) Cƣờng độ hoạt động tinh trùng trƣớc sau phản ứng hoạt hóa thay đổi ý nghĩa(PPƢ < 0,001) Sau phản ứng hoạt hóa cƣờng độ hoạt động tinh trùng đƣợc cải thiện Trong môi trƣờng Tris – glucose, diện lòng đỏ trứng citrate natri làm tăng độ nhớt môi trƣờng nên làm hạn chế hoạt động tinh trùng (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) Do cƣờng độ hoạt động tinh trùng môi trƣờng Tris – glucose thấp tinh nguyên môi trƣờng 43 Sperm – TALP – Ngồi pH mơi trƣờng Tris – glucose toan tính (6,82) nên sức hoạt động tinh trùng bị ức chế (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005) Ngƣợc lại pH môi trƣờng Sperm – TALP – kiềm tính (7,21) sức hoạt động tinh trùng đƣợc tăng cƣờng (Nguyễn Tấn Anh Nguyễn Quốc Đạt, 1997) Sự tƣơng tác thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa ý nghĩa (PTG – PƢ < 0,001) Nhƣ vậy, thời gian bảo quản có ảnh hƣởng đến cƣờng độ hoạt động tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa Tóm lại, thí nghiệm cho thấy chất lƣợng tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa mốc thời gian khảo sát tốt Tinh trùng đƣợc hoạt hóa sau pha lỗng có hoạt lực trung bình cao (0,78 ± 0,08) cƣờng độ hoạt động trung bình cao (6,33 ± 1,03) Do đó, thụ tinh in vitro nên chọn tinh trùng đƣợc hoạt hóa sau pha lỗng Tuy nhiên, để kết luận đƣợc xác hơn, cần chọn mẫu tinh trùng đƣợc hoạt hóa mốc thời gian bảo quản giờ, 24 48 tiến hành thụ tinh in vitro Tỉ lệ phôi tế bào đƣợc tạo từ trình thụ tinh tiêu định việc đánh giá chất lƣợng tinh trùng sau hoạt hóa mốc thời gian bảo quản khác (0 giờ, 24 48 giờ) Trong trình khảo sát tiêu nêu trên, đặc điểm khác tinh trùng đƣợc quan sát Tinh trùng có đặc tính tiếp xúc với vật lạ (Trần Tiến Dũng, 2002) Do trƣớc hoạt hóa, tinh trùng tiếp xúc với vật lạ (nếu có) mà không tiếp xúc với Tuy nhiên, sau hoạt hóa tinh trùng thƣờng hay tiếp xúc lẫn (hình 4.5) Các cation hóa trị mơi trƣờng Sperm – TALP – (Ca2+ với nồng độ cao, Mg2+) làm điện tích bề mặt tinh trùng nên tinh trùng tụ dính lại (Nguyễn Tấn Anh Nguyễn Quốc Đạt, 1997) Những tinh trùng trƣớc phản ứng hoạt hóa khơng tụ dính với nhau, có lẽ bề mặt chúng có điện tích Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng (x 400) 44 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng phƣơng pháp vuốt xảy ngắn ni cấy bị nhiễm phƣơng pháp cạo - Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng phƣơng pháp sử dụng kính (lamelle) cho tỉ lệ thành cơng 28,6%, cao so với phƣơng pháp không sử dụng kính (0%) - Thời gian bảo quản phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng Chất lƣợng tinh trùng hoạt hóa sau pha loãng tốt 5.2 Đề nghị - Tiến hành thêm nhiều thí nghiệm để nâng cao tỉ lệ thành công nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng - Thụ tinh in vitro tinh trùng vừa đƣợc bảo quản hoạt hóa - Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với nỗn phơi, nhằm nâng cao tỉ lệ trứng chín làm tăng chất lƣợng phơi đƣợc ni cấy điều kiện in vitro 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Tấn Anh Nguyễn Quốc Đạt, 1997 Thụ tinh nhân tạo gia súc gia cầm Nxb Nơng Nghiệp Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Tƣờng Anh, 2002 Sự đa dạng, sinh sản phát triển động vật Nxb Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Trịnh Bình, Phạm Phan Dịch, Đỗ Kính, 2004 Mơ học Nxb Y Học, Hà Nội Trần Tiến Dũng, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Văn Thanh, 2002 Sinh sản gia súc Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003 Ứng dụng kĩ thuật thụ tinh in vitro PCR xác định giới tính heo Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh Phan Trƣờng Duyệt, Phan Khanh Vy, 2001 Thụ tinh ống nghiệm Nxb Y Học, Hà Nội Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005 Khảo sát khả khai thác tinh chó khả bảo quản số môi trường pha chế tinh Luận văn thạc sĩ, Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh Hồng Kim Giao, 2003 Cơng nghệ cấy truyền phôi gia súc Nxb Khoa Học Kĩ Thuật, Hà Nội Trịnh Hữu Hằng, Đỗ Cơng Huỳnh, 2001 Sinh lí học người động vật Nxb Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội 10 Nhan Ngọc Hiền, 2005 Xây dựng quy trình ni cấy ngun bào sợi phù hợp điều kiện Việt Nam Đề tài nghiên cứu khoa học, trung tâm đào tạo bồi dƣỡng cán y tế Tp Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005 Sinh học phân tử tế bào – sở khoa học công nghệ sinh học Nxb Giáo Dục 12 Hồng Tích Huyền, Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thơng, 2001 Dược lí học Nxb Y Học Hà Nội 13 Phan Kim Ngọc, 2002 Giáo trình thực tập sở công nghệ sinh học động vật Nxb Đại Học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh 14 Nguyễn Văn Thuận, 2005 Tài liệu giảng dạy môn công nghệ sinh học chăn nuôi Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh 46 TIẾNG ANH 15 Bogliolo L., Zedda T M., Ledda S., Leoni G., Naitana S., Pau S., 2002 Influence of co-culture with oviductal epithelial cells on in vitro maturation of canine oocytes Preprod Nutr Dev 42: 265-273 16 Farstad W., 2000 Current state in biotechnology in canine and feline reproduction Animal Reproduction Science 60: 375-387 17 Farstad W., 2000 Assisted reproductive technology in canid species Therigenology 53: 175-186 18 Fartad W., Hyttel P., Grondahl C., Krongenes A., Mondain-Monval M and Hafne A.L., 1993 Fertilization in vitro of oocytes matured in vivo in the blue fox (Alopex lagopus) Journals of Reproductive & Fertility 47: 219-226 19 Freshney I R., 1987 Culture of animal cells – a manual of basic technique Alan R Liss, Inc., New York 20 Iguer-ouada M and Verstegen J.P., 2001 Long-term preservation of chilled canine semen: effect of commercial and laboratory prepared extenders Theriogenology 55: 671-684 21 Jenkins N., 1999 Animal cell Biotechnology methods and protocols Humana Press, Inc Totowa, New Jersey 22 Sirivaidyapong S., Cheng F P., Marks A., Voorhout W F., Bevers M M and Colenbrander B., 2000 Effect of sperm on the acrosome reaction in canine sperm Theriogenology 53: 789-802 23 Xu K P., Yadav B R., Rorie R W., Plante, Betteridge K J King W A., 1992 Development and viability of bovine embryos derived oocytes matured and fertilized in vitro and co-cultured with bovine oviducal epithelial cells J Reprod Fert 94: 33-43 24 Younglai E.V., Holt D., Brown P., Jurisicova A and Casper R.F., 2001 Sperm swim-up techniques and DNA fragmentation Human Reproduction 16 (9): 1950-1953 47 PHỤ LỤC So sánh phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ông dẫn trứng Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1) -Chi-square D.F Significance 11.6667 6.36300E-4 9.45000 2.11149E-3 with Yates correction With rows With columns Statistic Symmetric dependent dependent Lambda 0.22222 0.00000 0.28571 Uncertainty Coeff 0.20119 0.27061 0.16011 Somer's D 0.38356 0.28571 0.58333 Khảo sát hoạt lực tinh trùng Analysis of Variance for XULITK.HL - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 0600000 0300000 7.941 0017 B:XULITK.HOAT_HOA 1600000 1600000 42.353 0000 INTERACTIONS AB 0466667 0233333 6.176 0057 RESIDUAL 1133333 30 0037778 -TOTAL (CORRECTED) 3800000 35 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Khảo sát nồng độ tinh trùng Trắc nghiệm đồng biến lƣợng: Chi-Square Goodness-of-Fit Test -Observed Expected Frequency Frequency Chi-Square -1345 677 660 677 660 1345 677 660 677 674 1360 677 689 677 675 -Chi-square = 4018.62 with d.f Sig level = Chuyển đổi số liệu sang bậc hai số liệu trắc nghiệm đồng biến lƣợng số liệu mới: Chi-Square Goodness-of-Fit Test -Observed Expected Frequency Frequency Chi-Square -7 5.3 501 5.3 501 -Chi-square = 1.00194 with d.f Sig level = 0.316841 48 Kết phân tích biến lƣợng cho số liệu chuyển đổi: Analysis of Variance for XULITK.ND4 - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:XULITK.TG 5.60527 2.80264 1.536 2323 B:XULITK.HH 751.94102 751.94102 412.056 0000 INTERACTIONS AB 5.6052716 2.8026358 1.536 2323 RESIDUAL 52.920717 29 1.8248523 -TOTAL (CORRECTED) 811.66562 34 -1 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Khảo sát tỉ lệ tinh trùng kỳ hình Analysis of Variance for XULITK.KH - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 1.12500 56250 093 9118 B:XULITK.HOAT_HOA 838.10250 838.10250 138.001 0000 INTERACTIONS AB 1.1250000 5625000 093 9118 RESIDUAL 182.19500 30 6.0731667 -TOTAL (CORRECTED) 1022.5475 35 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Khảo sát tỉ lệ tinh trùng sống nguyên acrrosome Analysis of Variance for XULITK.SC - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 780.097 390.049 13.158 0001 B:XULITK.HOAT_HOA 17406.404 17406.404 587.199 0000 INTERACTIONS AB 104.84722 52.423611 1.768 1879 RESIDUAL 889.29333 30 29.643111 -TOTAL (CORRECTED) 19180.642 35 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Khảo sát cƣờng độ hoạt động tinh trùng Analysis of Variance for XULITK.CD - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:XULITK.THOI_GIAN 18.49181 9.24590 27.951 0000 B:XULITK.HOAT_HOA 117.90340 117.90340 356.428 0000 INTERACTIONS AB 16.123472 8.0617361 24.371 0000 RESIDUAL 9.9237500 30 3307917 -TOTAL (CORRECTED) 162.44243 35 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error ... 2.8 Một số cơng trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng 11 2.8.1 Nuôi cấy tế bào biểu mơ ống dẫn trứng bị đồng ni cấy với phôi 11 2.8.2 Đồng nuôi cấy tế bào biểu mơ ống dẫn trứng. .. 3.4.1.4 Nuôi cấy tế bào biểu mơ ống dẫn trứng Thí nghiệm 2: so sánh phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng Tế bào biểu mô ống dẫn trứng đƣợc nuôi cấy dạng mảnh (Xu ctv, 1992) Do tế bào. .. kĩ thuật thụ tinh in vitro đáp ứng nhu cầu xã hội giống chó đƣợc ƣa chuộng, đề tài ? ?Một số yếu tố ảnh hƣởng kết nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó? ?? đƣợc thực