ĐỒ ÁN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ BACTERIOCIN VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Trong khi chất kháng sinh được định nghĩa là những chất do vi khuẩn prokariotes hay eukaryotes sản sinh, ở nồng độ thấp có khảnăng ức chế những sinh vật khác; thì bacteriocin được miêu t

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED.

PHẦN I: TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 3

1.1.LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN 3

1.2 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ BACTERIOCIN 4

1.2.1 Khái niệm 4

1.2.2 Bản chất hóa học 5

1.2.3 Đặc điểm 6

1.2.4 Phổ tác dụng 9

1.3 DI TRUYỀN HỌC VÀ SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN 11

1.3.1 Tổ chức của tổ hợp gen 11

1.3.2 Con đường sinh tổng hợp 12

1.4 CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA BACTERIOCIN 15

1.5 THU NHẬN BACTERIOCIN 17

1.5.1 Môi trường nuôi cấy 18

1.5.2 Điều kiện nuôi cấy 19

1.5.3 Định vị và tinh sạch bacteriocin 19

1.5.4 Thu nhận một số bacteriocin 20

1.6 PHÂN LOẠI BACTERIOCIN 22

1.7 MỘT SỐ LOẠI BACTERIOCIN 26

PHẦN II: ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 35

2.1 BẢO QUẢN SẢN PHẨM THỊT 35

2.1.1 Nisin 35

2.1.2 Bacteriocin AS–48 (Enterocin AS–48) 39

2.1.3 Pediocin 43

2.2.BẢO QUẢN SẢN PHẨM SỮA 47

2.2.1 Nisin 47

2.2.2 Pediocin PA – 1 51

2.2.3 Lacticin 3147 54

2.2.4 Pediocin AcH 60

2.3 BẢO QUẢN SẢN PHẨM RAU QUẢ 61

2.3.1 Nisin 61

2.3.2 Enterocin AS - 48 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

LỜI NÓI ĐẦU

Bacteriocin là một chất có hoạt tính kháng khuẩn đã và đang được nhiều nhàkhoa học nghiên cứu Tuy đã được ứng dụng trong y học và thực phẩm nhưng vớinhững tính năng đặc biệt tiềm năng ứng dụng của bacteriocin là rất lớn

Được sự hướng dẫn nhiệt tình của cô Vũ Thị Kim Hạnh, em đã nghiên cứu đề tài

Đồ án môn học “Tổng quan về Bacteriocin và ứng dụng trong công nghệ thực phẩm”.Với những cố gắng của bản thân và sự chỉ dẫn ân cần của cô, em đã hoàn thành nhiệm

vụ được giao Tuy nhiên, đây là một đề tài còn mới mẻ, tài liệu tham khảo chưa nhiềunên còn nhiều thiếu sót Rất mong được sự đóng góp của thầy cô và các bạn để đề tàinày thêm phần hoàn thiện

Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn cô Vũ Thị Kim Hạnh, quý thầy cô trong Bộmôn và các bạn rất nhiều

PHẦN I: TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN

Bacteriocin được khám phá năm1925, khi Gratia quan sát khả năng ức chế của

E.Coli V lên E.Coli Φ E.Coli V sinh ra một loại chất bền với nhiệt, với nồng độ rất

nhỏ vẫn có thể ức chế sự phát triển của E.Coli Φ trong môi trường lỏng.

Năm 1948, loại chất này được đặt tên là Colicin và nó được chia thành 17 loạidựa trên sự hấp phụ đặc hiệu của nó (Fredericq, 1948)

Năm 1953, Jacob và các đồng sự phát hiện ra rằng các chất kháng khuẩn thuộctuýp Colicin cũng có thể được sản sinh bởi các vi khuẩn không thuộc dạng trực khuẩnđường ruột, thuật ngữ “bacteriocin” ra đời Trong khi chất kháng sinh được định nghĩa

là những chất do vi khuẩn (prokariotes hay eukaryotes) sản sinh, ở nồng độ thấp có khảnăng ức chế những sinh vật khác; thì bacteriocin được miêu tả là các phân tử có chứaprotein trong cấu trúc có hoạt tính kháng khuẩn đối với các loài vi khuẩn khác, nhất làcác chủng trong cùng một loài

Nhiều nghiên cứu cho thấy, bacteriocin có thể được sinh ra bởi cả hai loại vikhuẩn gram dương và gram âm Các nghiên cứu về bacteriocin do vi khuẩn gramdương ngày càng nhiều nhờ tiềm năng rất lớn ứng dụng vào bảo quản thực phẩm hoặcứng dụng để ngăn ngừa và giải quyết vấn đề nhiễm khuẩn trong y học Từ thời Pasteur

và Robert Koch có nhiều ghi nhận về sự cần thiết của việc ức chế, tiêu diệt các vi sinhvật gây bệnh Sự khám phá thuốc kháng sinh của A.Fleming 1929 đã mở đường choviệc sử dụng kháng sinh điều trị và tiêm chủng chống lại những bệnh do vi sinh vật.Mặc dù biện pháp kháng sinh cấm sử dụng trong thực phẩm, việc lợi dụng dùng chấtphụ gia kháng khuẩn với đặc tính bảo quản và chống vi sinh vật đã trở thành phongcách riêng trong việc an toàn và bảo quản thực phẩm Trong ngành thực phẩm và nướcuống việc bổ sung phụ gia bảo quản đã trở thành cách thức truyền thống để bảo quảnthực phẩm

Trong bảo quản thực phẩm, đã có một số loại bacteriocin (Nisin, Natamysin)được chấp nhận như chất bảo quản ở Hoa Kì và hơn 20 quốc gia trên thế giới Như đãbiết vi khuẩn lactic đóng vai trò rất quan trọng trong các loại thực phẩm lên men Mộtvài loại vi khuẩn lactic có khả năng ức chế rộng rãi sự phát triển của nhiều loại vi sinh

vật gây hư hỏng thực phẩm Ví dụ Lactococcus lactis sinh nisin – một tác nhân ức chế

đã được phát hiện năm 1928, hiện nay được sử dụng với quy mô lớn và ứng dụng trongcông nghệ bảo quản thực phẩm, nhất là các sản phẩm từ sữa

Trong y dược, người ta phát hiện chủng Staphylococcus aureus 502A hầu như không chứa độc tố, có thể ngăn ngừa các căn bệnh nghiêm trọng do Staphylococcus gây ra đối với trẻ em mới sinh và giúp điều trị u nhọt gây ra bởi Staphylococcus Vì

vậy trong tình hình vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh ngày càng nghiêm trọng và ngànhcông nghiệp dược phẩm gặp nhiều khó khăn trong việc phát triển các loại thuốc khángsinh mới, người ta nghĩ đến việc sử dụng các chủng vi khuẩn có khả năng sinhbacteriocin, không gây độc đối với cơ thể để đẩy lùi sự xâm nhiễm và phát triển củacác loài vi sinh vật gây bệnh khác.[4,5]

1.2 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ BACTERIOCIN

1.2.1 Khái niệm

Trong một quần thể, mỗi tế bào vi sinh vật đều có những cơ chế tự bảo vệ vàcạnh tranh Hầu như tất cả các loại vi khuẩn trong quá trình sinh trưởng, phát triển,chúng đều có thể tổng hợp các hợp chất có khả năng ức chế các vi khuẩn khác nhau vàđôi khi ngay cả bản thân cũng bị ức chế Các loại phân tử này bao gồm:

o Độc tố vi khuẩn (Ví dụ: diptheria, tetanus, cholera…)

o Các enzyme làm tan tế bào vi khuẩn như: lysostaphin, phospholipase A,hemolysins

o Các sản phẩm của quá trình trao đổi chất như acid hữu cơ, amonia,hydrogen peroxide, diacetyl…

o Chất kháng sinh phổ rộng cổ điển như: glamicidin, valinomycin,bactracin…

o Bacteriocin và các hợp chất giống bacteriocin

Bacteriocin là những chất có bản chất protein có hoạt tính kháng khuẩn đượcsinh tổng hợp từ nhiều loại vi khuẩn Tuy nhiên trong công nghiệp bacteriocin chủ yếuđược sản xuất từ vi khuẩn lactic nhờ tiềm năng sử dụng trong bảo quản thực phẩm như

là chất bảo quản tự nhiên

So với chất kháng sinh thì bacteriocin cũng có hoạt tính kháng khuẩn, nhưngkhác với kháng sinh ở chỗ bacteriocin có tính đặc hiệu như enzyme, chỉ tác động lênmột số vi sinh vật, do đó, khả năng kháng lại bacteriocin là rất cao

 Protein :

Tất cả các bacteriocin đều có chứa protein hoặc các peptid trong phân tử.Protein hoặc peptid đóng vai trò quan trọng trong chức năng diệt khuẩn củabacteriocin Một số loại bacteriocin chứa tổ hợp nhiều phân tử protein liên kết lại vớinhau

Các amino acid bất thường (unusual amino acid) trong phân tử một số loạibacteriocin giúp tạo nên một cấu trúc phân tử bền vững hơn (lanthionine hay ß –methyllanthionine), hoặc làm tăng hoạt tính sinh học của phân tử (didehydroalanine,didehydrobutyrine, cysteine)

Một số loại bacteriocin còn có chứa các amino acid chưa bão hoà trong phân tửnhư: didehydroalanine, didehydrobutyrine Các amino acid này là sản phẩm của phảnứng dehydrate hoá các hydroxyl amino acid serine và threonine

Khác với bacteriocin của vi khuẩn gram âm, bacteriocin của vi khuẩn gramdương được tổng hợp ban đầu dưới dạng các prepeptid sau đó được hoạt hoá bằng cáchtách bỏ một đoạn peptid trong cấu trúc

Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng tới tính chất bacteriocin về nhiều mặt Ở

pH 7, nhiều loại bacteriocin có khối lượng phân tử nhỏ như các lantibiotic hoặc cácpeptid không chứa lantibiotic thường mang điện dương Các bacteriocin có hoạt tínhkháng khuẩn cao hơn ở pH thấp (pH 5 hoặc nhỏ hơn) Khả năng hấp thụ củabacteriocin lên màng tế bào phụ thuộc pH, bacteriocin hấp thụ nhiều nhất lên màng tếbào ở pH 6 và ít nhất ở pH 2 Thông thường bacteriocin tích điện dương nhiều ở pH 5

và điện tích dương giảm đi khi pH tăng lên 6 hoặc cao hơn

Thành phần, trình tự, số lượng các amino acid trong phân tử peptid tạo ra nhữngđặc điểm khác nhau giữa các loại bacteriocin bao gồm: khối lượng phân tử, điểm đẳngđiện PI, tính kỵ nước, điện tích của phân tử ở pH xác định…

Một số bacteriocin không chỉ nhạy cảm với protease mà còn lipase,phospholipase, amylase Điều này chứng tỏ bacteriocin còn chứa nhiều thành phầnkhác như: lipid, glucid, phospholipid Ví dụ: Lactocin 27 được cấu tạo từ phức hợplipocarbohydrate protein Caseicin LSH và Leuconocin 3 là các glycoprotein

Sự hiện diện của cầu nối – S – S – hoặc thioether trong cấu trúc cũng ảnh hưởngđến độ bền và hoạt tính của bacteriocin

1.2.3 Đặc điểm

 Bacteriocin thuộc nhóm các sản phẩm trao đổi chất bậc hai, do bacteriocin khisinh ra không tham gia vào quá trình trao đổi chất của chính tế bào sinh tổnghợp ra nó.

 Bacteriocin có khả năng chống lại một số vi khuẩn gram dương, là những tế bào

có mối quan hệ gần gũi hoặc cùng họ với loại tế bào đã sinh tổng hợp rabacteriocin Ngoài ra còn có một số loại bacteriocin có khả năng chống lại các vi

khuẩn gram âm như: Listeria, E.Coli hay Samonella…

 Bacteriocin là những cấu trúc chịu nhiệt tốt có chứa protein và hoạt tính hoạtđộng tốt ở pH acid hoặc trung tính, mất hoạt tính ở pH >8 Hầu hết bacteriocinmang điện dương, kỵ nước mạnh mẽ và điểm đẳng điện lớn

 Bacteriocin có khả năng gắn đặc hiệu với cơ quan thụ cảm (receptor) trên bềmặt tế bào

 Khả năng tổng hợp bacteriocin hay khả năng miễn dịch của tế bào đối vớibacteriocin của chính nó được quyết định bởi các gen nằm trên plasmid, nhiễmsắc thể hoặc transposons

 Nồng độ bacteriocin cao có thể giết chết chính tế bào vi khuẩn sản sinh ra nó

 Bacteriocin bị mất hoạt tính bởi các enzym như: trypsin, pepsin, chymotrypsin

α-Bảng 1.1 Tính nhạy cảm của Bacteriocin với enzyme protease sử dụng L.

Bảng 1.2 Đặc điểm của bacteriocin thuộc nhóm I& IIA [7]

C

Lactobacillus plantarum

4000

3500-Ổn định ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp, bền nhiệt ở 1000C trong 60 phút hay

1210C trong 10 phút Hầu hết ổn định ở

pH acid hay trung tính Nhạy cảm với pronase, trypsin, và α–chymotrypsin, kháng lại pepsin, proteinase K, α–

amylase, và lipase

Bavaricin A Lactobacilus

bavaricus

4000

3500-Bền nhiệt ở 1000C trong 60 phút Ổn định

ở pH bằng 2.0 đến 9.7, nhạy cảm với

pepsin, trypsin, pronase E, proteinase K

và chymotrypsin A, kháng lại với catalase

Piscicolin

126

Carnobacteriu

m piscicola JG126

4416 Ổn định ở pH bằng 2 sau khi lưu trữ 2

tháng tại 40C Bền nhiệt tại 1000C trong

120 phút tại pH 2–3, trở nên ít ổn định hơn khi pH tăng Nhạy cảm với –chymotrypsin, protease type I, XIV, XXIII, và trypsin, kháng catalase, lipase

và lyzozyme Variacin Micrpcoccus

varians

2658 Ổn định ở pH từ 2 đến 10, bền nhiệt

1150C trong 20 phút, nhạy cảm với pronase E, proteinase K, ficin, khng catalase

Nisin Lc lactis 3488 Bền nhiệt ở 121oC trong thời gian dài, pH

= 2Pediocin PA

– 1

Pediococcus acidilactici

4624 Bền nhiệt ở 80oC trong 60 phút, pH4 –

pH 6Lactococcin

MMFII

Lactococcus lactis

4143 Bền nhiệt ở 70oC trong 30 phút, pH5 –

pH 8

1.2.4 Phổ tác dụng

Bề rộng phổ tác dụng có thể rất khác nhau đối với từng loại bacteriocin

Lactococcin A, B và M có phổ tác dụng hẹp, chỉ tiêu diệt các loài Lactococcus Trong

khi đó một số loài lantibiotic như Nisin và mutacin B có khả năng tiêu diệt rất nhiều

loại vi sinh vật bao gồm: Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium,

Enterococcus, Gaderella, Lactococcus, Listeria, Micrococcus, Mycobacterium, Probioni bacterium, Streptococcus và Staphylococcus Ngoài ra, các loại bacteriocin

này còn có khả năng ức chế các loài gram âm như: Campylobacter, Haemophilus,

Helicobacter và Neisseria.

Các loài bacteriocin từ vi khuẩn gam dương có phổ tác dụng hẹp nhưng vẫnrộng hơn nhiều so với phổ tác dụng của Colicin Chúng thường tác dụng lên các vikhuẩn gram dương Hoạt tính ức chế có thể tăng lên trong điều kiện pH thích hợp hoặctrong sự có mặt của một số tác nhân hoá học làm yếu các liên kết trên vách tế bào

Bảng 1.3 Hoạt tính của vi khuẩn gây bệnh đối với chủng sinh bacteriocin [6]

Bảng 1.4 Phổ tác dụng của một vài bacteriocin từ vi khuẩn Gram dương [7]

Nghiên cứu tổng quát về hoạt tính kháng khuẩn của các bacteriocin trọng lượngphân tử nhỏ cho thấy:

o Trong một loài, có những chủng nhạy cảm và những chủng kháng lạibacteriocin.

o Khi một chủng nhạy cảm với một loại bacteriocin, trong khuẩn lạc của nóvẫn có những tế bào có khả năng kháng lại bacteriocin đó

o Một chủng nhạy cảm với loại bacteriocin này nhưng lại kháng loạibacteriocin tương tự

o Tế bào có khả năng sinh bacteriocin này nhưng nhạy cảm với loạibacteriocin khác

o Bacteriocin có khả năng ức chế sự nảy mầm bào tử của một chủng nhạyvới loại bacteriocin đó

o Trong điều kiện bình thường, vi khuẩn gram âm không bị tác động bởibacteriocin của vi khuẩn gram dương

1.3 DI TRUYỀN HỌC VÀ SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN

1.3.1 Tổ chức của tổ hợp gen [4]

Những phát hiện về di truyền học của bacteriocin nhóm I và nhóm II đã gópphần cho thành công của việc nghiên cứu tiềm năng ứng dụng trong công nghệ thựcphẩm, đặc biệt là nisin Sự sản xuất gen mã hóa bacteriocin được thực hiện trong tổhợp gen operon (một nhóm gen liên hệ chặt chẽ với nhau điều hòa sự sản sinh enzyme)(Nes, 1996; Sahl và Bierbaum, 1998; Mc Auliffe, 2001) Đối với những bacteriocinmạch thẳng, bao gồm plantaricin, carnobacteriocin và sakacin, chúng có những peptidecảm ứng đặc biệt hay những peptide kích thích sự tổng hợp bacteriocin (Quadri,1997;Brurberg, 1997; Anderssen, 1998) Tổ hợp gen bacteriocin có thể nằm ở nhiễm sắc thểnhư trong trường hợp của subtilin (banerjee và Hansen, 1988) và mersacidin (Altena,2000); hoặc có thể nằm ở plasmid như trong trường hợp của divergicin A (Worobo,1995) và sakacin A (Axelsson và Holck, 1995); hoặc cũng có thể trong transposonsnhư trong trường hợp của nisin (Rauch và deVos, 1992) và lacticin 481 (Dufour,2000)

Sự phân tích di truyền học sinh tổng hợp một vài loại lantibiotic như epidermin(Schnell, 1992; Bierbaum, 1996; Geissler, 1996), nisin (Buchmann, 1988; Mulders,1991; de Vos, 1995), subtilin (Banerjee và Hansen, 1988; Klein, 1992; Klein và Entain,1994), lacticin 481 (Piard, 1993; Rince, 1997; Uguen, 2000) và mersacidin (Bierbaum,1995; Altena, 2000) đã khám phá ra những gen có liên quan đến sinh tổng hợplantibiotic gồm có: gen mã hóa cho prepeptide (LanA), những enzyme chịu trách

nhiệm điều chỉnh các phản ứng (LanB, C/LanM), protease quá trình (processingprotease) chịu trách nhiệm việc tách peptide dẫn (leader peptide) (LanP), ABC (ATP-binding cassette), protein vận chuyển có vai trò chuyển vị peptide (LanT), protein điềutiết (LanR, K) và những protein sản sinh chất tự bảo vệ hay protein miễn dịch (LanI, F,

E, G)

Di truyền học của nhiều bacteriocin nhóm II như là lactococcin A, B, M (Holo,1991; van Belkum, 1991,1992; Stoddard, 1992; Venema, 1995), pediocin PA1/AcH(Marugg, 1992; Motlagh, 1992a,b; Bukhtiyarova, 1994;Venema, 1995), và plantaricin

A (Diep, 1994, 1995, 1996) đã được nghiên cứu Gen mã hóa sinh tổng hợp bacteriocinnhóm II có nhiều điểm chung với nhóm I, bao gồm: gen cấu trúc mã hóa tiền chất củapeptide, gen miễn dịch, gen vận chuyển ABC, protein điều tiết và cuối cùng là proteinphụ (accessory protein – AP) Những accessory protein này cần thiết cho việc vậnchuyển ra khỏi tế bào của các bacteriocin nhóm II, chúng không được tìm thấy trongcác lantibiotic (Nes, 1996; Sablon, 2000)

1.3.2 Con đường sinh tổng hợp [4]

Tất cả các bacteriocin được tổng hợp như một prepeptide không hoạt động sinhhọc mang một peptide dẫn có đầu N Con đường sinh tổng hợp lantibiotic đi theo mộtquy trình chung (hình 1.1): sự hình thành prepeptide, điều tiết các phản ứng, sự phâncắt peptide dẫn bởi enzyme thủy phân protein và sự thay đổi vị trí của prepeptide hiệuchỉnh (modified prepeptide) xuyên qua màng tế bào chất Sự phân cắt của peptide dẫn

có thể xảy ra trước, trong hay sau khi ra khỏi tế bào Căn cứ theo con đường sinh tổnghợp, có hai nhóm tổ chức gen của lantibiotic có thể được nhận dạng (Sahl vàBierbaum, 1998; Guder, 2000; McAuliffe, 2001) Đối với những lantibiotic nhóm Inhư là nisin, epidermin, subtilin và Pep 5, phản ứng đề hydrate được cho là do enzymeLanB xúc tác, trong khi LanC được xác định có vai trò trong việc hình thành thioether.Các prepeptide hiệu chỉnh được thay đổi vị trí thông qua tác nhân vận chuyển ABCLanT Ngược lại, lantibiotic nhóm II như cytolysin, lacticin 481 và mersacidin dườngnhư chỉ được hiệu chỉnh bởi enzyme LanM (van Kraaij, 1999; McAuliffe, 2001) và quátrình này xảy ra đồng thời với sự vận chuyển bởi LanT (P)

Hình 1.1 Biểu đồ trình tự sinh tổng hợp lantibiotic 1: Sự hình thành

prebacteriocin 2: prebacteriocin được hiệu chỉnh bởi LanB và LanC, vận chuyển nhờ tác nhân vận chuyển đặc hiệu ABC LanT và giải phóng bacteriocin hoàn chỉnh (mature bacteriocin) nhờ LanP 3: Histidine protein kinase (HPK) cảm nhận sự có mặt của bacteriocin, phosphoryl hóa nó 4: nhóm phosphoryl (P) sau đó được nhường cho chất điều chỉnh đáp ứng (response regulator-RR) 5: RR hoạt hóa sự sao chép của gen điều tiết 6: sinh chất miễn dịch.[4]

Các bacteriocin nhóm II được tổng hợp nhờ một prepeptide chứa một conservedN-terminal leader và đó là nơi diễn ra quá trình phân hủy cặp glycin Không giống nhưlantibiotic, chúng không chịu sự tác động hiệu chỉnh lớn từ Lan/MeLan Sau khi hìnhthành prepeptide, prepeptide được chuyển ra khỏi tế bào nhờ tác nhân vận chuyển ABC

và protein đi kèm (accessory protein) của nó (Nes, 1996; Ennahar, 2000) Con đườngsinh tổng hợp bacteriocin nhóm II được trình bày ở hình 1.2

Hình 1.2 Biểu đồ trình tự sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II 1: sự hình thành

prebacteriocin và prepeptide của nhân tố cảm ứng (induction factor - IF) 2: prebacteriocin và pre-IF được vận chuyển nhờ tác nhân vận chuyển đặc hiệu ABC, giải phóng bacteriocin và IF hoàn chỉnh (mature bacteriocin, IF) 3: Histidine protein kinase (HPK) cảm nhận sự hiện diện của IF và phosphoryl hóa nó 4: nhóm phosphoryl (P) sau đó được nhường cho chất điều chỉnh đáp ứng (response regulator- RR) 5: RR hoạt hóa sự sao chép của gen điều tiết 6: sinh chất miễn dịch.[4]

1.4 CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA BACTERIOCIN

Sự hoạt động của bacteriocin xảy ra trên màng tế bào chất của tế bào mục tiêu.Nói chung, tuỳ thuộc vào từng loại cấu trúc phân tử khác nhau của các nhómbacteriocin mà nó có cơ chế kháng khuẩn khác nhau

Các bacteriocin nhóm I thì chêm hay chèn vào các lỗ, còn các bacteriocin nhóm

II tạo thành các cơ chất phủ lên các lỗ nhằm ngăn cản sự chuyển đổi các proton quamàng tế bào Như vậy, cơ chế hoạt động của bacteriocin gồm hai bước:

- Bước 1: các protein sẽ bám lên các đầu phospholipid hay protein thụ thể trênmàng tế bào theo cơ chế đặc hiệu Chính vì lý do này nên bacteriocin sẽ chống lại các

tế bào gần gũi với tế bào tổng hợp nên bacteriocin hơn

- Bước 2: tuỳ thuộc vào cấu trúc của từng loại bacteriocin mà nó có thể ngăn cảnquá trình chuyển đổi các proton giữa tế bào đích với môi trường Quá trình này ngăncản sự trao đổi chất của tế bào và gián tiếp ngăn cản sự tổng hợp năng lượng, ATP cho

tế bào, dẫn đến tế bào ngừng hoạt động hay bị chết đi

Ví dụ: Lacticin 3147 là một Lactibiotic được cấu tạo bởi hai thành phần, đó là 2chuỗi peptid: Lac 1 và Lac 2 Hai thành phần này cần cho hoạt tính kháng khuẩn củalacticin Kết quả là nó hình thành những điểm tích điện chuyên biệt trên màng của tếbào Gram dương

Hầu hết các bacteriocin hoạt động bằng cách tạo kênh hay lỗ trên màng làm pháhuỷ năng lượng hữu ích của tế bào sống Các bacteriocin của vi khuẩn G+ thườngkhông có receptor đặc hiệu để hút bám mặc dù vẫn có những ngoại lệ Hoạt động khácvới vi khuẩn G- ở hai điểm chính sau:

- Việc tạo bacteriocin thì không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật sản xuất

Sự khác biệt này là do cơ chế vận chuyển để giải phóng bacteriocin Ở một vài vi sinhvật thì phụ thuộc vào hệ thống tiết Ngoài ra, ở vi khuẩn G+ có sự điều hoà đặc hiệubacteriocin nên các bacteriocin chỉ dựa vào hệ thống điều hòa của tế bào chủ

- Hầu hết các bacteriocin kích thước nhỏ hoạt động trong phạm vi pH rộng từ 3 –

9, thậm chí acidocin B có thể hoạt động ở pH 11, ở điểm đẳng điện cao cho phép chúngtương tác với bề mặt điện tích âm của màng tế bào vi khuẩn Đối với các bacteriocinphổ kháng khuẩn rộng các hợp chất cần thể nhận thì sẽ gắn phần kỵ nước vào màng vikhuẩn Sau đó sự liên kết của các phân tử bacteriocin với nhau sẽ tạo thành những lỗxuyên màng làm mất gradient và gây chết tế bào

Lớp lipid tích điện âm của màng tế bào chất là receptor đầu tiên cho bacteriocintrong việc hình thành lỗ Ví dụ như nisin: xử lí tế bào bằng nisin cho thấy nó tạo ra khe

hở cho tia UV chiếu được vào trong nội bào; nisin là một bacteriocin có các phần tích

điện dương; liên kết với màng lipid tích điện âm, hình thành lỗ, bên cạnh đó làm trunghoà điện tích của màng, làm mất đi lực vận chuyển proton Do có sự hình thành lỗkhông đặc hiệu, các chất nhỏ như ion, ATP thoát ra ngoài, còn các chất lớn như proteinkhông thoát ra tạo nên điện thế màng, làm tế bào chết từ từ Bruno (1992) đã chứng

minh Nisin phá huỷ hoàn toàn cơ chế vận chuyển proton của L.monocytogenes Một số

bacteriocin từ vi khuẩn G+ có thể làm vô hoạt các tác nhân gây bệnh G- khi sử dụng tácnhân có tính kìm kẹp (chelating) như EDTA để phá hủy các đặc tính của lớp rào cảnbên ngoài vi khuẩn G- Ngoài ra, nisin cho thấy là có tác dụng gây ra sự tự phân của tếbào, gia tăng áp suất nội bào làm cản trở chuyển hóa năng lượng, ngăn cản sự phục hồivách tế bào

Hình1.3: Cơ chế tạo lỗ hay kênh ion trên màng tế bào của bacteriocin nhóm II [18]

Người ta cho rằng các bacteriocin nhóm IIa có thể tự tạo lỗ xuyên qua màng tếbào vì chúng là những bacteriocin cực nhỏ và lưỡng cực Các cystibiotic thuộc lớp IIcnhư cerecin 7/8, enterocin B, carnobacteriocin A và devergicin A có đặc điểm là có cấutrúc bậc 2 có sự hiện diện các vùng lớn bao quanh gần như toàn bộ vùng kỵ nước.Trong tất cả các trường hợp phần cystein đầu tiên tìm thấy nằm sau lysin tích điện

cho hoạt tính kháng khuẩn cuộn trong phần C của protein tạo thành cấu trúc kỵ nướcbền vững, ngoài ra trong phân tử có chứa glycerin nên phân tử rất linh động Chính sựlinh động này cho phép chuyển từ cấu trúc β thành α để thích hợp với tính kỵ nước.Chiều dài của vòng kỵ nước đủ dài xuyên qua mang tế bào chất và khi có sự gắn kếtmột số lượng lớn cấu trúc vòng sẽ gây chết [12, 13].

Các hiểu biết thông thường về phổ ức chế của bacteriocin từ vi khuẩn G+ làchúng chỉ giết giới hạn một số vi khuẩn G+ khác Phổ giết chết đóng vai trò quan trọng

từ những trường hợp phổ hẹp như Lactococcin A, B, M chỉ giết được Lactococcus đến

trường hợp phổ rộng như nisin A, mutacin B có thể giết được nhiều vi sinh vật như

Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria, Micrococus, Mycrobacterium, Propiobacterium, Streptococcus

và Staphylococcus Ngược lại với những hiểu biết trên là các bacteriocin cũng có hoạt

tính chống lại các vi khuẩn G- gây bệnh như : Campylobacter, Haemophilus,

Một thành công quan trọng của việc sản xuất bacteriocin là áp dụng những tiến

bộ mới của công nghệ sinh học như cải thiện chủng sản xuất bacteriocin, công nghệ vềprotein cũng như những phương pháp sản xuất tối ưu để giảm giá thành sản xuất Theohướng nghiên cứu này, Guyonnet(2000) đã làm giảm giá thành sản xuất, tăng tốc độ vàhiệu quả của phương pháp làm sạch bacteriocin từ canh trường liên tục

Để tối ưu hóa quá trình sản xuất bacteriocin, những mô hình đã được đặt ra để

dự đoán hiệu quả thương mại của việc sản xuất bacteriocin dựa trên những thông tinthu được từ hệ thống các phép thử Sử dụng những tấm agar truyền thống, Blom(1997)

đã phác họa một phương pháp kiểm tra đồng bộ ảnh hưởng của những nhân tố như pH,nồng độ tế bào chỉ thị, agar, soy và nồng độ natri chloride đến hiệu suất bacteriocin [4]

Có tổng cộng 220 chủng vi khuẫn lactic được phân lập từ 32 mẫu thực phẩm lênmen truyền thống để sản xuất bacteriocin Vi khuẩn lactic là cơ sở sinh học cho sự sảnxuất vô số thực phẩm lên men Sự đóng góp quan trọng nhất của những vi khuẩn nàyđến sản phẩm lên men là đảm bảo giá trị dinh dưỡng của nguyên liệu và ức chế sự pháttriển của vi sinh vật gây bệnh và gây hư hỏng trong thực phẩm Sự ức chế này có thể

do sự sản xuất nhiều sản phẩm trao đổi chất khác nhau như acid hữu cơ (acid lactic,acid acetic…), hydrogen peroxide, diacetyl và bacteriocin Một vài bacteriocin chỉ tiêudiệt vi khuẩn thuộc về những loài tương tự với loài sản xuất bacteriocin nhưng một sốbacteriocin khác tiêu diệt một dãy rộng vi khuẩn gram dương Bacteriocin có được sựquan tâm đáng kể trong những năm gần đây và có nhiều nghiên cứu tập trung vào việcphân lập và phát triển những chủng vi khuẩn mới sản xuất bacteriocin Tỉ lệ phát hiệnbacteriocin từ sự phân lập vi khuẩn lactic chỉ có 0,2% và vì vậy cần rất nhiều nghiêncứu để sản xuất và thu nhận bacteriocin Mục tiêu của những nghiên cứu hiện nay làchọn những vi khuẩn sản xuất bacteriocin từ nhiều sản phẩm để sử dụng những chất ứcchế có bản chất protein này trong bảo quản thực phẩm.[14]

1.5.1 Môi trường nuôi cấy

Kelstrup và Gibbons (2002) đã thấy rằng gia tăng tính nhớt của dịch môi trườngbằng cách thêm agar, dextran, glycerol, hay tinh bột sẽ gia tăng năng suất sản sinh

bacteriocin của vi khuẩn Streptococcus cô lập từ khoang miệng của người và động vật gặm nhấm Một nghiên cứu khác của M.A Riley (2007) về staphylococcin 1580 cho

thấy nuôi trong môi trường bán rắn sẽ cho năng suất lớn hơn 20 lần so với môi trườnglỏng

Các chất riêng biệt hợp thành môi trường có thể quyết định sự sản xuất của

bacteriocin Sự sản xuất bacteriocin bởi các chủng khác nhau của S mutans có thể làm

gia tăng bằng cách thêm cao nấm men 2% vào môi trường cơ bản Trypticase Tương

tự, sự hình thành butyricin 7423 trong môi trường được thấy là phụ thuộc với lượngcasein hydrolysate thêm vào cho đến tối đa 5% Sự hình thành bacteriocin của các

chủng Corynebacteria và bởi Staphylococcus được thấy rằng phụ thuộc hàm lượng

amino acid trong môi trường nuôi cấy Ion Mangan (2004) được thấy là cần thiết chonhiều sản phẩm sản sinh trong môi trường hoá học xác định Thêm 0.5% mannitol vàomôi trường brain heart infusion broth làm gia tăng năng suất của staphylococcin 426nhưng giảm lượng staphylococcin 414 Tương tự, glucose làm gia tăng sự sản xuấtstreptococcin A–FF22 nhưng làm giảm streptococcin B–74628 Những nghiên cứukhác cho thấy thêm vào cả glucose hay manitol sẽ làm gia tăng sự sản xuất chất ức chế

bởi phage type 71 Staphylococcus trong dịch chiết đậu nành [18]

1.5.2 Điều kiện nuôi cấy

Sự khác nhau của điều kiện môi trường như nhiệt độ, thời gian, oxy, pH có ảnhhưởng đến năng suất của bacteriocin có hoạt tính Nhìn chung, sự sản xuất bacteriocintốt hơn ở điều kiện nhiệt độ tối ưu của chủng sản xuất phát triển Nuôi ở nhiệt độ quácao có thể ngăn cản sự sản sinh bacteriocin và đôi khi dẫn đến sự thay đổi các đặc tínhmột cách không thuận nghịch [17]

Việc tạo ra các bacteriocin ở vi khuẩn G+ thường khi chuyển từ pha log đến pha ổnđịnh Sản lượng bacteriocin tối đa trong môi trường có thể thấy ở nhiều pha khác nhautrong chu kỳ tăng trưởng Schlegel và Slade (2002) nhận thấy sự sản xuất streptocinSTH1 nhiều nhất trong suốt pha log và giảm dần mức độ sản sinh bacteriocin trước khibước vào pha ổn định Trái lại, sản xuất streptococcin A – FF22 bắt đầu ở cuối pha log

và hoạt tính giảm dần dần khi nuôi kéo dài Tương tự, sản xuất staphylococcin C55 bắtđầu ở pha log, đạt đến tối đa giữa 24 và 48 giờ phát triển, và sau đó suy tàn dần.Butyricin 7423 thì được tiết ra trong suốt cuối pha log, tuy nhiên, perfringocin 11105chỉ xuất hiện nhiều vào pha ổn định và sản phẩm của nó dường như lại tiêu hủy mộtphần tế bào sản xuất

Meitert (2005) đã báo cáo một vài chủng C diphtheriae giải phóng bacteriocin liên

tục nhưng một vài chủng khác lại sản xuất gián đoạn Lachowicz (2002) nghiên cứukhả năng sản xuất staphylococcin A–1262a trên môi trường rắn Hoạt tính được nhậnthấy đầu tiên sau 8 giờ, đạt đến tối đa khi từ 18 đến 24 giờ, và sau đó giảm dần về 0.Những nghiên cứu khác cũng nhận thấy hoạt tính bacteriocin bị mất khi nuôi kéo dài

Sự ảnh hưởng này có thể liên quan đến sự xuất hiện của chất bất hoạt bacteriocin hayenzyme tiêu hủy hoặc thay đổi chúng [16, 17]

Một ảnh hưởng thú vị lên sự phục hồi một số bacteriocin là pH Một nghiên cứu vềđiều kiện để tối ưu sản xuất colicin K cho thấy rằng điều chỉnh pH môi trường là mộtyếu tố then chốt Một số nghiên cứu tìm thấy rằng sản xuất streptococcin A–FF22 trênagar Todd–Hewitt sẽ gia tăng khi điều chỉnh pH ban đầu của môi trường đến 6,5 [18]

1.5.3 Định vị và tinh sạch bacteriocin

Nhiều bacteriocin của vi khuẩn G+ dường như tồn tại ở hai dạng là liên kết với tếbào và ở ngoài tế bào Tỷ lệ của mỗi dạng phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của môitrường Bacteriocin trong phân loại này bao gồm megecin C–216, lactocin LP27,staphylococcin 1580, butyricin 7423, staphylococcin C55 và streptococin A–FF22.Những nhận xét tương tự cũng được báo cáo nhiều với colicin [20]

Trong trường hợp bacteriocin có nhiều ở xung quanh tế bào, các tính chất hoá học,

cơ học, enzyme có thể ảnh hưởng đến việc giải phóng chúng khỏi tế bào Viridin A, B,

và C (bacteriocin của Streptococcus viridans) có thể thu được ở trạng thái tế bào tự do

(cell-free) sau khi đồng nhất dịch tế bào sản xuất bacteriocin Staphylococcin 414 cũngđược tìm thấy ở bề mặt tế bào của chủng sản xuất nhưng có thể tách ra bằng cách phá

vỡ cơ học tế bào Trái lại, staphylococcin 462 không thể bị hoà tan bằng cách phá vỡ tếbào sản xuất Các nghiên cứu khác cũng chứng tỏ rằng staphylococcin 1580 có thểđược trích từ vi khuẩn với 5% NaCl Tương tự tinh chế colicin E2–W3110 và E3–

W3110 và bacteriocin JF246 của S marcescens được hỗ trợ bằng cách trích bacteriocin

quanh tế bào với 1M sodium chloride Streptococcin A–FF22 ở dạng liên kết với tếbào có thể được trích bằng cách đun trong axit loãng Streptococcin, nisin vàdiplococcin cũng có thể được thu bằng cách trích với axit từ tế bào sản xuất Trong một

số nghiên cứu khác phương pháp xử lý nhiệt dịch nuôi cấy của Lactobacillus đã gia

tăng khả năng giải phóng lactocin LP27 từ tế bào Phương pháp trích với axit dườngnhư có hiệu quả trong ví dụ này Donoghue khi sử dụng một phương pháp khác đãnhận thấy rằng megacin C–216 và Cx–337 được giải phóng từ tế bào sinhmegacinogenic bằng cách xử lý với lysozyme, kết hợp tiền xử lý với trypsin Tác giảkết luận rằng megacin được định vị trên bề mặt ngoài tế bào [19]

Thường dịch thô đầu tiên được cô đặc bằng cách lắng tủa phân đoạn với acid, muối,ethanol, hoặc các hỗn hợp khác nhau Sau đó việc tinh chế có thể dựa vào kích cỡ khácnhau (sắc ký lọc gel, lọc qua máy siêu lọc, ly tâm) hay thay đổi điện tích (sắc ký traođổi ion, điện chuyển) [21]

Một vấn đề chung là sự mất hoạt tính trong quá trình tinh chế Do đó việc giám sáthoạt tính bacteriocin (đơn vị bacteriocin/miligram protein) tại mỗi bước tinh chế vàđiều chỉnh khi có thể để tránh việc mất nhiều hoạt tính là rất quan trọng [15]

1.5.4 Thu nhận một số bacteriocin

o Thu nhận nisin từ Lactococcus lactis

Môi trường: sử dụng môi trường whey ứng với 2,3% whey, 1,75%pepton, 2,0%

saccharose là tối ưu cho sự tổng hợp bacteriocin của Lc.lactis 1

Điều kiện nuôi cấy: thời gian 30h, pH môi trường ban đầu 5 – 6, nhiệt độ thíchhợp 30oC, chế độ lắc đảo 100 vòng/phút Có thể cố định tế bào Lc.lactis 1 lên chất

mang truyền thống alginate và chất mang mới BC

Môi trường whey sau khi được tối ưu thành phần dinh dưỡng cũng như điềukiện nuôi cấy cho kết quả tốt có ý nghĩa thực tiễn.[2]

o Thu nhận plataricin từ Lactobacillus plantarum L24

Chủng vi sinh vật được phân lập từ nước dưa Môi trường MRS dùng trongnghiên cứu có thành phần sau (g/l): Casein peptone, tryptic digest 10, cao thịt - 10, caonấm men - 5, glucose – 20, Tween -80, K2HPO4 - 2, Natri acetate - 5, (NH4)2 citrate -2.00, MgSO4 7 H2O - 0.20, MnSO4 H2O - 0.05, nước 1000 ml, pH từ 6,2 – 6,8 Khửtrùng 121oC trong 15 phút.

Xác định hàm lượng bacteriocin theo phương pháp Brarford.Xác địnhbacterioxin trên gel polyacrylamit (SDS-PAGE) theo phương pháp của Laemmli

Bacterioxin có mặt trong tất cả các nhóm của vi khuẩn lactic như:

Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus.

Trong đó, hai nhóm chính là: Lactobacillus, Lactococcus đóng vai trò quan trọng Theo

hệ thống phân loại do Kleen - Hammer, các bacteriocin được chia thành 4 nhóm, dựatrên trọng lượng phân tử, độ bền nhiệt, sự có mặt của các axit amino Do đó, để xác

định rõ Lactobacillus plantarum L24 chúng tôi nghiên cứu thuộc nhóm sinh

bacteriocin nào, chủng L24 được nuôi cấy tĩnh sau 24 giờ tiến hành phá vỡ tế bào và hạ

pH xuống 2,5, để qua đêm ở 4oC Sau đó chỉnh pH về 7,0 và đem tủa với aceton 100%,lạnh (giữ ở -22oC) với thể tích bằng thể tích mẫu Ly tâm 10000 vòng trong 15 phút.Làm khô mẫu và hòa tan trở lại bằng dung dịch đệm l mẫu bacteriocin thô được travào mỗi giếng trên gel pH=7,0 Lấy 10 polyacrymit 15% Chạy với I = 1,5A/giếng

Kết quả cho thấy trọng lượng phân tử của bacterioxin của Lactobacillus plantanrum

L24 thuộc nhóm lớn, nhóm bacterioxin II, protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tửnhỏ từ 10 – 30kDa.[1]

o Thu nhận acidocin B từ Lactobacillus acidophilus

Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus sản xuất bacteriocin có khả năng kháng một

số vi khuẩn gây bệnh trong thực phẩm như Escherichia coli, Salmonella và một số vi

khuẩn lactic khác

Sự sản xuất bacteriocin bắt đầu từ 12 giờ Nhiệt độ tối ưu cho sự tạo bacteriocin

là 30 - 370C với pH 5 - 7 Chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng tốt các loại đường nhưmanitol, maltose, lactose và glucose để sản xuất bacteriocin Hoạt tính bacteriocin tăngkhi bổ sung 1% yeast extract, còn các thành phần khác như glucose, meat extract,casein pepton, NaCl không ảnh hưởng hoạt tính bacteriocin

Bacteriocin sản xuất bởi vi khuẩn L acidophilus nhạy cảm với protease nhưng

lại ổn định với các dung môi hữu cơ, sự thay đổi pH và xử lí nhiệt

Bacteriocin được tinh sạch bằng sắc kí lọc gel và điện di trên gel SDS - PAGE

để xác định độ tinh sạch và trọng lượng phân tử.[3]

o Thu nhận từ Salmonella

Có nhiều nghiên cứu đã được thực hiện đối với các bacteriocin của nhiều loại vi

khuẩn Gram dương và Gram âm, bao gồm cả bacteriocin của Salmonella Trong

nghiên cứu của Patankar, Joshi đã nghiên cứu sản xuất và nhận dạng bacteriocin sinh

tổng hợp bởi Salmonella.

Trong nghiên cứu này, E.Coli R12 Row được sử dụng làm chủng chỉ thị Môitrường sử dụng là tryptic soy agar và tryptic soy broth Agar mềm dinh dưỡng chứapeptone 10g, dịch trích thịt 3g, NaCl 5g và agar-agar 10g trên một lít nước tiệt trùng.[8]

1.6 PHÂN LOẠI BACTERIOCIN

Theo Gordon và Obrien (2006), bacteriocin của vi khuẩn Gram âm được chialàm hai nhóm là colicin và microcin Colicin được xem là đại diện tiêu biểu chobacteriocin từ vi khuẩn Gram âm Tính chất của colicin đặc trưng cho tính chất củabacteriocin:

o Phổ tác dụng hẹp, chỉ ức chế những loài tương đồng

o Có chứa protein trong phân tử

o Có tác dụng diệt vi khuẩn

o Gắn đặc hiệu với cơ quan thụ cảm (receptor) trên bề mặt tế bào

o Khả năng tổng hợp bacteriocin hay khả năng miễn dịch của tế bào đối vớibacteriocin của chính nó được quyết định bởi các gen nằm trên plasmid

o Nồng độ bacteriocin cao có thể giết chết chính tế bào vi khuẩn sản sinh ranó

Bacteriocin từ vi khuẩn gram dương dồi dào hơn vi khuẩn gram âm vìbacteriocin từ vi khuẩn gram dương có nhiều điểm khác biệt so với colicin Một vài tácgiả sử dụng thuật ngử hợp chất giống bacteriocin ( bacteriocin – like – substance ) hayhợp chất có khả năng ức chế giống bacteriocin ( bacteriocin – like – inhibitory –substance, BLIS) để gọi các chất kháng khuẩn này Các BLIS giống colicin vì chúngchứa thành phần protein trong phân tử và là các chất kháng sinh có nguồn gốc vi

khuẩn Nhưng chúng khác colicin ở khả năng gắn vào các cơ quan thụ cảm, ở cấu trúc,

và ở cơ chế cảm ứng.[7]

Rất nhiều sản phẩm trao đổi chất từ vi khuẩn gram dương được xem làbacteriocin Mỗi nghiên cứu đưa ra một cách phân loại khác nhau Trong một số trườnghợp các loại enzym hemolysin, phospholipase hay các enzym có hoạt tính phân giải tếbào vi khuẩn đều được xem là bacteriocin Theo Klaenhammer (1999) thì cácbacteriocin thì các bacteriocin được chia làm 4 nhóm:

Hình 1.3 Sơ đồ phân loại bacteriocin của vi khuẩn gram dương[7]

Hình 1.4 Cấu tạo một số bacteriocin loại I.[9]

Chú thích: Hình thức viết tắt của các acid amin hiệu chỉnh: a: D-alanine; B: 2,3-dihydrobutyrine; O: 2,3-dihydroalanine; u:D-α-aminobutyric acid; a-S-A: lanthionine (Lan); u-S-A và A-S-u: methyllanthionine (MeLan); A-NH-K:

lysinoalanine; D-OH: erythro-3-hydroxyaspartic.

Bảng 1.6: Bảng phân loại bacteriocin

NhómIA(lantibiotics) Vi sinh vật tổng hợp Tham khảo

L lactis

Hurst, 1981Mortvedt, 1991Allgaier, 1986Kellner, 1988Piard, 1992NhómIB(lantibiotics)

Streptomyces cinnamoneus Actinoplanes ssp

Altena, 2000Bierbaum, 1998Saht & bierbaum, 1998Saht & bierbaum, 1998Saht & bierbaum, 1998Nhóm II A

L lactis

Henderson, 1992Holck &Tichazek, 1992Hastings, 1991

Hechard, 1992Aymerich, 1996Metivier, 1998Ferchichi, 2001

Nissen-Meyer, 1992Van Benkum, 1991Allison, 1994Nissen-Meyer, 1993Timenez-Diaz, 1995Anderssen, 1998Anderssen, 1998Nhóm II C

C divergens

E faecium

E faecium

Leer, 1995Worobo, 1994Worobo, 1995Cintas, 1997Nes & Holo, 2000Nhóm III

Helveticin J

Helveticin V-1829

Lactobacillus helveticus Lactobacillus helveticus

Joerger&KlaenhammerVaughan, 1992

Nhóm I: được biết như các lantibiotic, chúng là những peptide nhỏ (<5kDa )mang các amino acid như: lanthionine (Lan), methyllanthionine (Melan),dehydrobutyryl, dehydroalanine Nhóm I chia làm 2 loại tuỳ theo cấu trúc hoá học vàkháng khuẩn

o Loại A: là những peptid kéo dài với mạng cực dương, nó sẽ cố gắng sửdụng hoạt tính của chúng để xuyên qua hệ thống các lổ trên màng tế bào

o Loại B: là những peptid hình cầu nhỏ hơn và có điện tích âm hoặc khôngmang điện tích

Nhóm II: Là những peptid có phân tử lượng < 10kDa, bền nhiệt và không mangLanthionine, đây là nhóm có số lượng bacteriocin lớn nhất trong hệ thống phân loại.Nhóm II được chia làm 3 nhóm nhỏ.

o IIA: Gồm những peptid giống như Pediocin, có 1 chuỗi Tyr – Gly – Asn– Gly – Val – Xaa – Cys và kết thúc chuỗi là nitơ Nhóm này thu hútnhiều sự quan tâm bởi hoạt tính kháng khuẩn Listeria

o IIB: Gồm những bacteriocin đòi hỏi 2 chuỗi peptid khác nhau cho hoạttính của nó

o IIC: Gồm những chuỗi peptid còn lại của nhóm Peptide có nhóm thiol cóhoạt tính, đòi hỏi phải cắt giảm nhóm cysteine để có hoạt tính.

Nhóm III: Là những bacteriocin không có những đặc tính tốt, có phân tử lượng

> 30KDa, kém bền nhiệt và ít được quan tâm hơn trong ngành thực phẩm

Nhóm IV: Bao gồm các Bacteriocin, là những protein phức tạp với một nửa làlipid hay cacbohydrate.[4]

1.7 MỘT SỐ LOẠI BACTERIOCIN

1.7.1 Nisin:

Nisin là bacteriocin có chứa lanthionine được sản xuất bởi các chủng

Lactococcus lactis Subsp Lactis.

Chủng sản xuất Nisin đầu tiên được tìm thấy trong sữa bởi Rogers (1928),Whitehead (1933), Meanwell (1943) và Hirsh (1944) Từ đó người ta ước lượng được

rằng khoảng 1/3 các chủng Lactococcus lactis subsp lactis phân lập từ sữa có khả năng

sản xuất Nisin

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của Nisin A

Nisin là bacteriocin rất được quan tâm hiện nay do nó là hợp chất kháng sinhđầu tiên trong công nghệ thực phẩm ở quy mô thương mại Nisin thương mại đầu tiênđược sử dụng ở Anh năm 1953 Vào năm 1968, uỷ ban của FAO/WHO về phụ gia thựcphẩm chấp nhận nisin là chất bảo quản sinh học an toàn

Nisin ức có khả năng chế hoạt động của vi khuẩn gram dương và cả bào tửkhuẩn hình que và vi khuẩn gây thối Các vi khuẩn này tham gia vào quá trình gây thốicủa thực phẩm và tạo các độc tố.[10]

Ngày nay, việc sử dụng Nisin vào thực phẩm đã được cho phép trên 50 quốcgia, kể cả ở châu Âu Nisin được ứng dụng trong công nghệ sản xuất phô mai (ngăn

cản sự phát triển của bào tử và sự sản sinh độc tố bởi Clostridium botulinum), công

nghệ sữa, đồ uống, bảo quản thịt cá, sản phẩm đóng hộp

 Tính chất vật lý và hoá học của Nisin:

o Phân tử lượng của Nisin là 3,4 kDa Phân tử Nisin có tính phân cực, vớiđầu NH2 kỵ nước, đầu COOH ưa nước

o Tính tan của Nisin phụ thuộc nhiều vào môi trường Khi pH môi trườngtăng tính tan của Nisin giảm mạnh Ở điều kiện trung tính và kiềm, Nisinhầu như không tan

o Độ bền của Nisin quan hệ chặt chẽ với tính tan Độ bền không chỉ phụthuộc pH mà còn một số yếu tố khác: thành phần, môi trường, nhiệt độ…

o Nisin mất hoạt tính bởi α–chymotrypsin, panovatin và subtilopeptidase,nhưng lại không bị ảnh hưởng bởi carboxypeptidase A, elastase, erepsin,pepsin, trypsin.

Tính chất sinh học:

o Khác với các bacteriocin sản xuất từ LAB hay từ các vi khuẩn sản xuấtbacteriocin khác, Nisin có phổ ức chế tương đối rộng Nisin ức chế chủyếu các vi khuẩn gram dương Nisin ức chế tế bào sinh dưỡng và bào tử

Do hoạt tính kháng khuẩn mà Nisin được ứng dụng rộng rãi trong thực phẩmnhư một chất bảo quản sinh học thay cho các phụ gia hoá học khác như SO2, acidbenzoic, acid sorbic, nitrate, nitrite…

Ngành công nghệ thực phẩm có thể ứng dụng các tính chất bảo quản sản phẩmcủa Nisin bằng việc sử dụng các giống sinh Nisin trong quá trình sản xuất hoặc bổ sungcác chế phẩm có chứa Nisin trực tiếp vào trong sản phẩm.[11]

1.7.2 Colicin [5]

Theo Fredericq, Colicin được sinh bởi E.Coli (20 – 25% số chủng), E.freundii,

Paracolobactrum, Shighella, đôi khi là Salmonella, Aerobacter và ngay cả Serratia.

Colicin được chia làm 17 loại dựa vào phổ hoạt động và đặc trưng kháng khuẩn củachúng

Fredericq còn nghiên cứu một cách hệ thống những đặc tính khác của 17 loạiColicin và đã tìm ra sự liên quan giữa cách phân loại dựa trên đặc trưng kháng khuẩnvới những đặc tính nhạy cảm với nhiệt độ, enzyme và khả năng thẩm tách colicin

Theo tổng hợp của Fredericq (1948), mỗi loài vi khuẩn có xu hướng chỉ sản sinh

ra những loại Colicin nào đó Theo đó, E freundii chỉ sinh loại A; E.Coli sinh loại B,

C, D, E, F, G, H, I hay V; Paracolobactrum sinh Colicin J hay K; Shigella sinh S1, S2, S3, S4 và S5; Samonella sinh Colicin I, K hay B Đôi khi có sự liên quan giữa đặc tính

hóa sinh và những đặc tính khác của vi sinh vật với loại colicin được sinh ra, mặc dùtrong hầu hết các trường hợp sự tương quan này là không lớn

Tính nhạy cảm của các vi khuẩn còn nhiều điều chưa thống nhất Escherichia và

Shigella thường nhạy cảm hơn với các colicin Tất cả 17 loại colicin có hoạt tính với ít

nhất một chủng Escherichia hay Shigella nhưng chỉ có hoạt tính hạn chế với các loài khác Năm colicin B, C, D, H và V thì có hoạt tính với Samonella; bốn loại colicin A,

B, C, D có hoạt tính với Aerobacter và chỉ có colicin H có hoạt tính với vi khuẩn

proteus Trong một nghiên cứu sau đó, tính nhạy cảm của các chủng được tìm thấy như

sau: Paracolobactrum arizonae (colicin loại E); Erwinia (colicin E, I, S4, S5) và

Pasterella (colicin G) Colicin sinh bởi Shigella và Escherichia có khả năng tiêu diệt

mạnh hơn các chủng trong cùng giống Theo đó, ta có thể thấy khuynh hướng tác độngđến những chủng có quan hệ gần gũi

1.7.3 Alveicins [5]

Loại bacteriocin này giống với colicin hơn hầu hết các loại bacteriocin khác, nóđược tìm thấy gần đây bởi Hamon và Peron (1963) Sự giống nhau của chúng dùng đểlập một dãy các chủng trong một giống và kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của cácbacteriocin Tia cực tím còn được sử dụng để kích thích sản sinh bacteriocin và tăng sốloại bacteriocin được tạo ra như một tác nhân kích thích Một hay vài chủng vi khuẩnnhạy cảm với hầu hết bacteriocin trong nhóm thì sau đó được sử dụng như chủng chỉthị để kiểm tra hoạt tính của bacteriocin được sản xuất bởi những nhóm khác

Hamon và Peron tìm ra 30 trên 98 (30%) chủng Hafnia spp sinh bacteriocin nhưng chỉ có hai chủng Hafnia được sử dụng như chủng chỉ thị và vì thế không thể nói

có thể tiếp tục chia Alveicin ra giống như colicin được hay không Các Alveicin thì có

hoạt tính với E coli 36 và một vài loại có hoạt tính kháng Shigella paradysenteriae Y6R, E Coli K-12, E Coli B Một vài loại chỉ có tác dụng với E Coli K-12 hay

Shigella paradysenteriae Y6R Người ta thấy rằng phần lớn Alveicin giống với Colicin

E

1.7.4 Caratororicin [5]

Hamon và Peron đã tìm ra rằng 7 trên 9 chủng trong 6 loài Erwinia sản sinh

bacteriocin khi kiểm tra tính kháng khuẩn của 9 chủng này với chủng chỉ thị của giốngkhác Hai loại Catatovoricin có hoạt tính kháng khuẩn với cùng chủng và có thể xem làcùng loại, còn những Caratororicin khác có phổ kháng khuẩn khác nhau Trong số 6

Caratovoricin thì có 3 loại không tiêu diệt bất cứ chủng nào trong 9 chủng Erwinia mà

có hoạt tính với các giống vi khuẩn khác E.coli K-12S nhạy cảm với 2 loại Caratovoricin; E Coli B nhạy cảm với 1 loại và S paradysenteriae Y6R thì không bị

tiêu diệt bởi các Caratovoricin Một số chủng khác nhạy cảm với một vài caratovoricin

là những chủng Pseudomonas fluorescens, 2 chủng Serritia sp., một chủng

Xanthomonas.

1.7.5 Arizonacin [5]

Hamon và Peron đã tìm ra 33 trong số 220 (15%) chủng Paracolobactrum

arizonae sinh bacteriocin khi kiểm tra tính kháng khuẩn của 25 chủng P arizonae Một

vài arizonacin chỉ có hoạt tính với một chủng P arizonae, còn lại phần lớn có hoạt tính với vài chủng P arizonae Trong số các chủng P arizinae nhạy cảm với arizonacin thì

có một số chủng nhạy cảm với cả colicin E, nhưng không nhạy cảm với bất kì colicinnào khác

1.7.6 Cloacin [5]

Hamon và Peron tìm ra 8/29 (27%) chủng Enterobacter cloacae sản sinh

bacteriocin Anh hưởng của tia cực tím làm mở rộng phổ hoạt động và kích thích sinhcác bacteriocin khác Đề cập về điều này trong bản báo cáo, Hamon và Peron đã tìm ra

ít nhất 6 cloacin khác nhau Một vài trong số này tác động tới cả E coli B hay K–12S

và một số cloacin có hoạt tính kháng lại các chủng Xanthomonas và Erwinia Không có cloacin nào có hoạt tính kháng lại Pseudomonas pyocyanae hay Serratia.

1.7.8 Pneumocin [5]

Hamon và Peron đã tìm ra 38/112 (34%) loài Klebsiella (96 K pneumoniae) có

khả năng sinh bacteriocin Hoạt tính của chúng nhìn chung có giới hạn với nhiều chủng

Klebsiella khác nhau, thường thì có một số lượng rất nhỏ trong số 62 chủng được kiểm

tra nhạy cảm với Klebsiella Điều khác biệt rất lớn về phổ hoạt động của các

pneumocin là chúng không hoạt động với bất kì chủng chỉ thị colicin nào nhưng lại

hoạt động với chủng chỉ thị aerocin của Arobacter aerogenes.

1.7.9 Aerocin [5]

Trong số 28 chủng A aerogenes, có 21 chủng (75%) có thể sinh bacteriocin Aerocin thường hoạt động với rất nhiều trong số 28 chủng A aerogenes và phổ hoạt

động cũng có vài điểm khác nhau Chúng không hoạt động với chủng chỉ thị colicin

nào nhưng chúng hoạt động với cả hai chủng Enterobacter cloacae và Klebsiella.

1.7.10 Pyocin [5]

Jacob nghiên cứu bacteriocin sản sinh từ Pseudomonas pyocyanea và giải thích

một vài đặc tính của chúng Hamon, Veron vàPeron chỉ ra rằng có một tỉ lệ lớn (18/19)

chủng P pyocyanea sinh bacteriocin có hoạt tính với các chủng P pyocyanea khác, nhưng vài bacteriocin lại có hoạt tính với các chủng P fluorescens Có 17 pyocin được nghiên cứu ức chế từ 1 đến 7 (trung bình là 4) chủng trong số 15 chủng P pyocyanea kiểm tra, nhưng chỉ có 8 pyocin ức chế từ 1 đến 2 chủng trong số 18 chủng P.

fluorescens Các chủng Samonella, Shigella, E coli nhìn chung chống lại pyocin, có

một số chủng khác lại rất nhạy cảm

1.7.11 Fluocin [5]

Hamon, Veron và Peron tìm ra 12/28 chủng P fluorescens (19 chủng)và

Pseudomonas spp (9 chủng) sinh bacteriocin Tất cả 12 bacteriocin này đều có phổ

hoạt động khác nhau với P fluorescens nghiên cứu Chỉ có 1 fluocin có hoạt tính với

cả 19 chủng P pyocyanea và một fluocin có hoạt tính với các chủng Erwinia.

1.7.12 Pesticin [5]

Ben-Gurion và Hertman tìm ra trong 23 chủng Pasteurella có 22 chủng sinh chất kháng sinh có hoạt tính kháng loài P pseudotuberculosis Brubaker vàSurgalla

tìm ra 77/80 chủng sinh ra chất kháng sinh này, chất mà được đặt tên là pesticin I

Brubaker vàSurgalla còn tìm ra pesticin II được sinh ra bởi tất cả các chủng P.

pseudotuberculosis và P pestis Pesticin II có hoạt tính với P pestis A12 và Java; cả

hai chủng này đều không có khả năng sinh pesticin I

1.7.13 Megacin [5]

Ivanovics và Nagy đã khảo sát 200 chủng Bacillus megaterium về ảnh hưởng

đối kháng chống lại một chủng của loài tương tự Có 92 loài được tìm thấy có tác dụng

và một số chủng khác có hoạt tính sau khi được kích thích bởi tia cực tím Trong sốnhững chủng có hoạt tính với megacin thì có cả những chủng có khả năng sản xuấtmegacin

Trong nhiều chủng của các loài khác được kiểm tra, kể cả gram dương và gram

âm, chỉ có vài chủng thuộc họ aerococci, 8/43 chủng B.anthracis và 2/13 chủng

B.subtillis là nhạy cảm với megacin.

1.7.14 Monocin [5]

Có 25/51 chủng Listeria monocytogenes có hoạt tính chống lại các loài tương

tự Trong 51 chủng có 9 chủng nhạy cảm với một vài hay tất cả 25 monocin Có thểphân monocin thành 2 loại A và B dựa vào đặc tính kháng khuẩn của chúng

1.7.15 Cerecin [5]

Cerecin đầu tiên được tìm ra trong nghiên cứu về Bacillus của Mclloy Hamon

và Peron đã nghiên cứu 8 loại cerecin sinh bởi B cereus trong một nghiên cứu khác.

Chỉ có một chi tiết về phổ hoạt động của chúng được đưa ra là chúng không hoạt độngvới bất kì một chủng chỉ thị nào của vi khuẩn Gram âm

1.7.16 Enterococin [5]

Brock, Peacher và Pierson tìm ra hơn một nửa trong số 100 chủng thuộc những

loài Streptococcus khác nhau của nhóm Enterococcus có khả năng sinh bacteriocin Có

thể phân các bacteriocin này thành 5 nhóm dựa trên đặc tính nhạy cảm hay kháng lạienzyme, nhiệt, chloroform và phổ hoạt động của chúng Nhóm 1 được sinh bởi tất cả

các chủng của S zynogenes Nó hoạt động trên tất cả các chủng khác của Enterococci

và tất cả các vi khuẩn Gram dương được kiểm tra khác Nhóm 2 được sinh bởi vài

chủng S liquefaciens và hoạt động với tất cả các chủng S.faecium và vài chủng S.

faecalis Nhóm 3 được sinh bởi vài chủng S faecalis và S faecium và hoạt động với tất

cả các chủng S.zymogenes, S liquefaciens và vài chủng S.faecalis, S faecium Nhóm 4 được sinh bởi vài chủng S faecium và hoạt động với vài chủng S faecium, S faecalis

và tất cả các chủng S zymogenes, S liquefaciens Nhóm 5 chỉ được sinh bởi 1 chủng S.

zymogenes và chống lại các chủng S zymogenes khác Do đó, sự sản sinh enterococin

và sự nhạy cảm với enterococin có liên quan nhưng không tuyệt đối với sự phân nhóm

streptococci Nhóm 1 chống lại một dãy rộng các vi khuẩn gram dương, trong khi

những nhóm khác chỉ chống lại những loài có quan hệ mật thiết

1.7.17 Staphylococin [5]

Fredericq đã nghiên cứu lần đầu tiên về bacteriocin của Staphylococcus, ông ta

đã quan sát 5 staphylococin Mỗi staphylococin có phổ kháng khuẩn chống lại những

chủng khác nhau thuộc giống staphylococcus Chúng còn chống lại cả các vi khuẩn thuộc giống Bacillus Hamon và Peron nghiên cứu 20 Staphylococin và tìm ra rằng

Listeria, bacillus và corynebacterium thường nhạy cảm với staphylococin.

1.7.18 Sự khác nhau giữa các họ bacteriocin [5]

Như đã trình bày ở trên, một vài họ bacteriocin khác nhau được bàn luận mộtcách riêng rẽ Sự tìm thấy colicin, alveicin, caratovoricin, arizonacin, cloacin,

marcescin, pneumocin và aerocin cho ta thấy rằng bacteriocin được tìm thấy ở nhiều họ

vi khuẩn khác nhau

Do đó sự sinh bacteriocin dường như là một hiện tượng phổ biến Trong tất cảcác trường hợp, mỗi họ bacteriocin gồm có nhiều nhóm khác nhau được chỉ ra bởi sựkhác nhau về phổ tác dụng Đồng thời phổ tác dụng được Hamon và Peron sử dụngnhư một công cụ hổ trợ việc phân loại vi khuẩn Họ tranh luận rằng vì các bacteriocinthường chỉ tác dụng đến những chủng có quan hệ gần gủi với chủng sinh ra bacteriocin

đó nên những chủng này có mối liên quan mật thiết với nhau Họ sử dụng điều này như

một nguyên tắc phân loại Serratia, Erwinia, Aeromonas và Xanthomonas.

Tuy nhiên vẫn có những ngoại lệ về sự tác động của bacteriocin Ta thấy, mộtvài alveicin, caratovoricin, cloacin và arizonacin tác động đến một hay nhiều hơn trong

4 chủng chỉ thị colicin là E coli K-12S, B, 36 và S paradysenteriae Y6R Tuy nhiên,

không một bacteriocin nào trong họ này tác động đến cả 4 chủng chỉ thị, đó là điểmphân biệt chúng với colicin Các pneumocin và aerocin có thể là có quan hệ mật thiếtvới nhau khi cả hai cùng hoạt động với cùng các chủng chỉ thị, nhưng không bao gồm

chủng chỉ thị colicin Trong số các bacteriocin của họ Enterobacterioceae, chỉ có caratovoricin là có hoạt tính với họ Pseudomonadaceae.

Pyocin và fluocin nhìn chung rất giống với các bacteriocin của

Enterobacteriaceae, dù vậy thì chúng hoạt động với dãy vi khuẩn khác Pesticin khác

với các bacteriocin khác được thảo luận là dường như có sự khác biệt rất nhỏ giửa hailoại pesticin Sau nhiều nghiên cứu chỉ có hai loại pesticin đựợc tìm ra, dù vậy, pesticincũng nên được xem là một bacteriocin Chỉ có những ngihên cứu kỹ hơn về bacteriocinmới có thể giải đáp rỏ điều này

Trong 5 họ bacteriocin sinh ra từ vi khuẩn gram dương, megacin và monocinkhác với các họ khác là hầu hết các thành viên trong họ có phổ tác dụng gần giốngnhau Điều này gần giống với pesticin, một bacteriocin chỉ tìm thấy hai loại (pesticin I

& II) Hamon và Peron xem abcteriocin từ vi khuẩn gram dương khác với bacteriocincủa vi khuẩn gram âm ở vài điểm Điểm khác nhau quan trọng nhất đó là phổ khángkhuẩn không hạn chế trong khi bacteriocin của vi khuẩn gram âm chỉ tác dụng với

những loài có quan hệ gần gủi Theo đó, monocin tác dụng với tỉ lệ lớn bacillus và

staphylococcus; staphylococin còn tác dụng đến các chủng của vài giống vi khuẩn

gram dương; enterococin 1 tác dụng với tất cả vi khuẩn gram dương Tuy nhiên,

megacin mặc dù có hoạt tính với vài chủng B anthracis và Micrococcus thì lại chống

các loài khác không hiệu quả và 4 loại enterotocin còn lại rất hạn chế trong hoạt độngcủa mình Những nghiên cứu sâu hơn cho rằng bacteriocin của vi khuẩn gram dương

có phổ kháng khuẩn rộng và một vài loại có thể hoạt động với những loài không liên

quan như trường hợp của pesticin và pyocin hoạt động với E coli, một vài loại caratovoricin hoạt động với Pseudomonas.

PHẦN II: ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Ngày nay người tiêu dùng ngày càng quan tâm đến mức độ an toàn của chất bảoquản hóa học trong thực phẩm do đó người tiêu dung đã quay sang tìm kiếm, tiêu thụcác sản phẩm tươi hay các sản phẩm không có phụ gia hóa học

Bacteriocin sinh tổng hợp từ vi khuẩn lactic được xem như chất bảo quản tựnhiên hay chất bảo quản sinh học có thể đáp ứng những đòi hỏi trên

Thông thường có ba phương pháp dùng bacteriocin trong quá trình bảo quảnthực phẩm:

 Ủ thực phẩm với vi khuẩn lactic mà vi khuẩn này có khả năng sinh tổnghợp bacteriocin trong môi trường chính là thực phẩm bảo quản

 Bổ sung bacteriocin đã được tinh sạch hay chế phẩm bacteriocin thô như

là chất bảo quản

 Sử dụng một sản phẩm đã lên men trước với chủng sinh tổng hợpbacteriocin như là một thành phần trong quá trình chế biến thực phẩm.Hiện nay chỉ có Nisin và Natamysin mới được thương mại hóa cũng như đượcchấp nhận như phụ gia bảo quản ở một số nước trên thế giới Nisin lần đầu tiên đượcRogers phát hiện năm 1928 Nisin là sản phẩm polypeptide được sinh tổng hợp bởi vi

khuẩn Lactococcus lactis, được sản xuất theo quy trình công nghiệp năm 1950 với tên

bùng nổ của bào tử Bacillus licheniformis và Clostridium sporogenes PA3679

(Raymon, 1981) và của vi khuẩn lactic từ thịt lên men (Collins-Thompson, 1985)

Bên cạnh đó, King-Thom Chung (1989) cũng tiến hành nghiên cứu để xác địnhtính khả thi của nisin trong việc dùng nó như một chất bảo quản thịt Thí nghiệm được

tiến hành như sau: 1 gam Nisaplin (10 IU nisin/g) được hòa tan trong dung dịch HCl0.02N chứa 0.75% NaCl và chỉnh pH về 3,0 nhờ dung dịch NaOH 1N Dung dịch cuối

có nồng độ nisin 104 IU/ml và giữ ở 5oC Thịt sử dụng là thịt bò giữ ở 15oC cắt thànhmẫu có kích thước 1,0-1,0-0,5cm, những mẫu này chứa ít hơn 100 CFU/mẫu Các vikhuẩn trong nghiên cứu có nồng độ 107 tế bào/ml môi trường tryptic soy broth (TSB)

Kết quả cho thấy trong thịt nisin có tác động ức chế những vi khuẩn gram dương

như Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Streptococcus lactic (ví dụ trường hợp L.monocytogenes ở đồ thị 2.1), nhưng không có tác động ức chế vi khuẩn gram âm như Serratia marcescens, Salmonella typhimirium, Pseudomonas aeruginosa (ví dụ trường hợp Serratia marcescens ở đồ thị 2.2) Có thể tham khảo tác động của

nisin sau 10 phút đối với vi khuẩn gram âm và gram dương trong thịt ở bảng 2.1

Đồ thị 2.1 Ảnh hưởng của nisin đến L.monocytogenes trong thịt ở nhiệt độ phòng