PHẦN II: ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
2.2.2. Pediocin PA–1 [28]
Pediocin PA – 1 được sinh tổng hợp từ Pediococcus acidilactici PAC 1.0 được tìm thấy có khả năng ức chế Listeria monocytogenes. Một canh trường bột PA – 1 tăng cường thêm 10% sữa bột được nhận thấy có hoạt tính bacteriocin, chống lại L. monocytogenes trong canh trường nước thịt. Sự ức chế bởi bột PA – 1 xảy ra ở pH từ 5,5 – 7,0 và ở hai nhiệt độ 4oC và 32oC. Thêm vào đó, sự ức chế L.monocytogenes
được xác định ở một vài thực phẩm như phô mai tươi, kem…
L. monocytogenes là một trực khuẩn gram dương, di chuyển hổn độn. Từ lâu nó được biết là nguyên nhân gây bệnh ở người và thú vật như nhiễm Listeria ở trẻ sơ sinh hay kí sinh phá hũy hệ miễn dịch. L.monocytogenes được tìm thấy trong đất hay thực vật chết, phân hủy và trong đường ruột của hơn 50 loài chim , động vật như cừu, gia cầm, gia súc… Trước 1967, bệnh nhiễm Listeria được biết như một bệnh lạ đối với con người. Sự bùng nổ các dạng thực phẩm chứa L.monocytogenes càng làm tăng sự nghiêm trọng của nó đối với sức khỏe cộng đồng. Những thực phẩm như sữa, xà lách, bắp cải, phô mai,… gây ra bùng nổ những bệnh liên quan đến Listeria. Những đặc tính đặt biệt khiến L. monocytogenes có sự đe dọa lớn trong thực phẩm nhiễm trùng là nó có khả năng phát triển cực nhanh ở nhiệt độ thấp. Mc Laughlin đã phát hiện một khả năng khác của L. monocytogenes là di chuyển cực nhanh trong thực phẩm.
Hiện nay những phương pháp sản xuất nhằm tránh sự nhiễm L.monocytogenes
trong thực phẩm chú trọng vấn đề vệ sinh, tác dụng nhiệt hợp lý và tránh sự nhiễm vi sinh vật sau giai đoạn tiệt trùng. Thời gian gần đây, Gonzalez và Kunka đã mô tả một bacteriocin, cụ thể là Pediocin PA – 1, sinh tổng hợp bởi Pediococcus acidilactici PAC 1.0 có một phổ tác dụng rộng chống lại vi khuẩn lactic gram dương.
Đồ thị 2.13. Ảnh hưởng của bacteriocin PA-1 lên sự phát triển của L.monocytogenes trong nước luộc thịt ở 32oC. Bột PA-1 được thêm vào và đo độ đục ở 660nm. Kí hiệu: ●, control(no PA-1); ○, 200 AU of PA-1 per ml; x, 500 AU of PA-1 per ml. Mũi tên xác
định thời điểm PA-1 được thêm vào.
Nghiên cứu của Pucci và cộng sự (1988) về hoạt tính ức chế Listeria monocytogenes đã cho nhiều kết quả rất khả quan về khả năng sử dụng Pediocin PA-1 trong bảo quản các sản phẩm từ sữa. Theo đó, sự phân giải L.monocytogenes bởi PA-1 được xác định bằng cách đo độ đục của dung dịch trong canh trường có bổ sung PA -1 theo thời gian. Tốc độ phân hủy được tính toán bằng cách sử dụng thời gian cần thiết để giảm độ đục đi một nửa. Tốc độ phân hủy chủng L. monocytogenes LM01 rất cao: 0,19/h đối với canh trường chứa 200AU/ml và 0,17/h đối với 500AU/ml (xem đồ thị 2.13).
Pucci cũng khảo sát trên các sản phẩm phô mai và cho kết quả như sau:
Creamed cottage cheese: phô mai thu được từ nguồn thương mại được làm
sạch lần thứ nhất bằng clorin lạnh (100ppm), làm khô hoàn toàn. Kem đã đồng hóa, thanh trùng, làm lạnh được thêm vào khối phô mai trên với tỉ lệ khối lượng 66/34. Hổn hợp này hòa tan vào nhau chia thành 3 phần (mỗi phần 300g) vào 3 hộp plastic đã làm sạch bằng clorin, chỉnh pH về 5,1. Ba hộp đều được cho khoảng 103–104 CFU L. monocytogenes/g vào, lần lượt không thêm, thêm 10AU bột PA-1/g và 50AU/g vào 3 hộp A, B và C. Ba hộp đều ủ ở 4oC rồi đếm số khuẩn lạc theo theo gian.
Half-and-half cream: L.monocytogenes sinh trưởng trong 5h ở 32oC trong môi trường dịch thể, cho kem đã thanh trùng, đồng hóa, làm lạnh vào (18% chất béo sửa, pH 6,6). Cho L.monocytogenes vào với nồng độ 102-104CFU/ml, chia thành 2 phần bằng nhau. Phần 1 thêm 100AU (PA-1)/ml, phần 2 giữ nguyên. Đếm số khuẩn lạc L.monocytogenes của mẫu trữ ở 4oC sau 1, 7, 14 ngày.
Cheese sauce: phô mai Cheddar đóng hộp được hoàn nguyên, pH dịch hoàn
nguyên được đưa về 6,0 nhờ dung dịch NaOH 1N. Dịch này được chia thành 4 phần bằng nhau và cho vào 4 bình riêng, tác dụng nhiệt 100oC/ 60 phút và làm lạnh về 4oC trong một bể đá. Sau khi làm lạnh, hai bình được ủ sau khi thêm L.monocytogenes
nồng độ 103CFU/ml, trong đó 1 bình có thêm 100AU (PA-1)/ml. Hổn hợp được làm lạnh về 4oC và đếm số khuẩn lạc sau 1, 7, 14 ngày.
Bảng 2.7. Ảnh hưởng của bacteriocin PA-1 lên L.monocytogenes khi được thêm vào
thực phẩm và giữ ở 4oC
Kết quả thu được (bảng 2.7) cho thấy rằng ngoại trừ cottage cheese, trong hai hệ còn lại vi khuẩn gây bệnh phát triển rất nhanh ở 4oC. Sau 14 ngày số lượng
L.monocytogenes tăng xấp xỉ 106 lần trong cả half-and-half cream và cheese sauce. Nếu dùng PA-1, số lượng vi khuẩn trong cottage cheese giảm 10 lần sau 7 ngày. Trong cả 3 hệ lượng vi khuẩn đều giảm nhanh khi có mặt PA-1. Tuy nhiên,có sự phát triển trở lại của L.monocytogenes sau 7 ngày ở 4oC trong hai hệ thực phẩm acid yếu (pH 6,0 trong Cheese sauce, nồng độ protein và béo cao) và trung tính (pH 6,6 trong half-and-
half cream, béo cao: 18% chất béo sữa). Tuy nhiên trong cottage cheese (pH acid) số lượng vi khuẩn vẫn giữ nguyên sau 7 ngày ở 4oC, mặc dù nồng độ PA-1 chỉ bằng 1/10 trong cheese sauce và 1/5 trong half-and-half cream.
Pediocin PA–1 có tiềm năng ứng dụng bảo quản trong tất cả các loại thực phẩm có chứa L. monocytogenes như sản phẩm sữa, sản phẩm thịt…
2.2.3. Lacticin 3147 [29, 30, 31]
Lacticin 3147 là một chất kháng vi sinh vật tự nhiên, được cấu tạo bởi hai chuỗi peptide: Lac 1, Lac 2 và các thành phần khác như lanthionine, dehydrat amino acid, D – alanine. Nó có thể được sử dụng kiểm soát vi sinh vật phát triển trong suốt quá trình sản xuất phô mai làm tăng mùi vị,chất lượng và độ đặc cho sản phẩm.
Nghiên cứu của Ross, Hill (2001) đã đánh giá khả năng của lacticin 3147 làm tăng chất lượng của nhiều loại sản phẩm từ sữa, đặt biệt là phô mai Cheddar. Sự vận dụng bacteriocin vào hệ vi sinh vật trong phô mai mang lại cho nhà sản xuất sự kiểm soát to lớn về độ đặc và chất lượng sản phẩm cuối cùng, thêm vào đó là đảm bảo an toàn cho sản phẩm. nghiên cứu đã chứng minh khả năng ức chế vi sinh vật rất đặc trưng và phức tạp của Lacticin 3147.
Lacticin thể hiện khả năng ức chế Listeria monocytogenes, vi sinh vật gây bệnh thực phẩm rất nguy hiểm trong phô mai tách kem (cottage cheese). Sử dụng Lacticin 3147 trong phô mai Cheddar ít béo càng cho hiệu quả ở nhiệt độ cao.
Như chúng ta đã biết, số lượng vi khuẩn lactic đóng vai trò thiết yếu trong thực phẩm len men và vi khuẩn được dùng trong sản xuất phô mai Cheddar là Lactococcus subsp. Số lượng các vi sinh vật tự nhiên – các acid lactic tạp (non starter lactic acid bacteria – NSLAB) có thể phát triển và chiếm số lương vượt trội trong phô mai trong quá trình quá trình ủ chín. Vai trò của NSLAB là không rỏ ràng trong tác động đối với mùi vị cho sản phẩm. Tuy nhiên, dù muốn hay không chúng chắc chắn tác động đến chất lượng sản phẩm theo một cách nào đó. Điều quan trọng là những NSLAB có liên quan đến những ảnh hưởng xấu cho phô mai như hình thành tủa lactate canxi hay tạo vết nứt trên phô mai.
Khi mà nhu cầu của con người ngày càng cao, nhà sản xuất phô mai phải đương đầu với thách thức là phải đáp ứng nhu cầu về an toàn-vệ sinh, mùi vị tốt và độ đặc thích hợp. Một cách cải thiện mùi vị phô mai được cân nhắc lựa chọn đó là thêm
lactobacili trong quá trình sản xuất, bên cạnh đó sử dụng lacticin 3147 để ức chế vi khuẩn gây bệnh.
Đồ thị 2.14: Sự phát triển của vi khuẩn lactic tạp trong phô mai Cheddar ít béo
(reduced fat Cheddar cheese) - a) kí hiệu rổng: ủ ở 7ºC và b) kí hiệu bôi đen: ủ ở 12ºC. (■), (●) đại diện cho số lượng NSLAB trong phô mai khi không có chủng sản xuất lacticin3147trong canh trường. (▲) đại diện cho số lượng NSLAB trong phô mai khi có chủng sản xuất lacticin3147trong canh trường.
Phô mai Cheddar:
Lacticin 3147 ức chế một dãy rộng vi khuẩn gram dương gây bệnh và làm hư hỏng thực phẩm như: listeria, Clostridia, Staphylococci. Gen mã hóa Lacticin 3147 được chứa tong một plasmid tiếp hợp PMRC 01. Những chủng sản xuất Lacticin 3147 được đánh giá khả năng ức chế sự phát triển những vi khuẩn không mong muốn trong phô mai. Kết quả cho thấy Lacticin 3147 có thể sử dụng tốt trong sản xuất phô mai khi giảm pH trong một khoảng thời gian mong muốn. Hơn nữa, hoạt tính của Lacticin 3147 vẫn không đổi trong suốt thời gian ủ chín.
Phô mai Cheddar ít béo (Reduced fat Cheddar):
Lacticin 3147 được đánh giá khả năng kiểm soát mật độ NSLAB trong phô mai Cheddar ít béo ở 12 oC. Tốc độ phát triển NSLAB tăng rất cao ở nhiệt độ này nhưng nếu dùng Lacticin 3147 thì làm giảm đáng kể NSLAB trong mẩu thí nghiệm. Ý nghĩa của kết quả này là ta có thể ủ phô mai ở nhiệt độ cao hơn nếu sử dụng Lacticin 3147. Điều này có thể làm tăng năng suất cũng như cải thiện mùi vị, chất lượng sản phẩm.
Việc sử dụng Lacticin 3147 bảo vệ phô mai Cottage chống lại Listeria. Monocytogenes – một vi khuẩn gây bệnh trong phô mai đã được nghiên cứu. Hoạt tính của Lacticin 3147 sau 6 ngày ở 4oC làm giảm số lượng Listeria đi 1000 lần. tốc độ tiêu diệt L. monocytogenes thậm chí còn tăng thêm ở nhiệt độ cao hơn. Kết quả này chứng minh ảnh hưởng của Lacticin 3147 ức chế L. monocytogenes trong thực phẩm, nơi mà sự nhiễm trong quá trình sản xuất bởi vi sinh vật là một vấn đề nan giải.
Đồ thị 2.15. Sự sống sót của Listeria monocytogenes trong phô mai tách kem (Cottage cheese) khi canh trường sản xuất có mặt ( ) và không có ( ) Lacticin 3147.
Phô mai ủ mốc (mould- and smear-ripened cheese):
Những chủng sinh Lacticin 3147 được kiểm tra khả năng ức chế bề mặt đối với
Listeria trong phô mai ủ mốc. Những năm gần đây có sự bùng nổ về số lượng các bệnh thực phẩm do ăn những loại thực phẩm chứa vi sinh vật gây bệnh L. monocytogenes. Vì lý do này, một chủng sinh lacticin 3147 được phun lên bề mặt phô mai đã cấy L. monocytogenes. Trong quá trình ủ chín có sự giảm đáng kể L.monocytogenes. Nghiên cứu này đã chứng minh tiềm năng của Lacticin 3147 trong bảo quản phô mai. [29]
Trong một nghiên cứu trước đó của Hill, Ross và cộng sự (1998) về ảnh hưởng của lacticin 3147 lên mùi vị trong phô mai Cheddar và tác động ức chế vi sinh vật có hại trong phô mai mốc (mould ripened cheese) cũng đã cho kết quả tương tự. kết quả thể hiện trong hai đồ thị dưới đây.
Đồ thị 2.16. Sự ức chế NSLAB trong sản xuất phô mai Cheddar khi dùng và không
Đồ thị 2.17. Sự ức chế Listeria trong phô mai mốc ( mould ripened cheese) được sản xuất với sự có mặt và không có lacticin 3147.[30]
Sunderen và cộng sự (2001) cũng đưa ra những kết luận rất tốt về tác động của lacticin 3147 đối với sản phẩm sữa như: thực phẩm cho trẻ em, phô mai Cheddar, bột súp, yagurt tự nhiên. Cụ thể những kết quả được tóm tắt như sau:
o Trong các loại sữa dùng cho trẻ em có dùng bột lacticin 3147 thì hơn 99% Listeria monocytogenes ScottA bị tiêu diệt sau 3h ở 30oC.
o Tác dụng của bột lacticin 3147 trong việc ức chế Listeria monocytogenesScottA trong yagurt đã được chứng minh là hơn 98.3% đã bị tiêu diệt trong 5 phút ở 30oC, còn nếu sau 60 phút thì không còn
Listeria sống sót.
o Trong trường hợp của phô mai Cottage, 40% Listeria monocytogenes ScottA bị tiêu diệt sau 5 phút ở 30oC và sau 160 phút chỉ còn sống sót 14%, như đồ thị 2.18:
o Trong bột súp ở 30oC sau 24h có tới 99.9% Bacillus cereus bị tiêu diệt. o Bột lacticin 3147 ngăn chặn sự nảy mầm của bào tử Bacillus cereus
nhưng không tiêu diệt bào tử.
Đồ thị 2.18: (a) sản phẩm bột lacticin 3147, (b) sự ức chế Listeria monocytogenes ScottA trong phô mai cottage khi sử dụng bột lacticin 3147.
Cũng trong nghiên cứu này nếu ta kết hợp lacticin với áp suất cao cho kết quả tốt khi áp dụng ức chế Listeria innocua DPC1770 trong sữa và whey (xem hình 2.19)
Đồ thị 2.19. Ảnh hưởng của áp suất cao và lacticin 3147 (riêng rẽ và kết hợp) đối với sự sống sót của Listeria innocua DPC1770
Những nghiên cứu này cho thấy rằng lacticin 3147 có thể sử dụng như một chất bảo quản sinh học trong các loại sản phẩm sữa. Tuy nhiên một vài yêu cầu cần phải nghiên cứu thêm như là giảm lượng lacticin sử dụng mà vẫn đảm bảo tác dụng bảo quản của nó.[31]