PHẦN II: ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
2.3. BẢO QUẢN SẢN PHẨM RAU QUẢ 1 Nisin [33, 34]
2.3.1. Nisin [33, 34]
Sản phẩm fresh – cut là một lỉnh vực phát triển nhất của thực phẩm bán lẻ trong hơn 10 năm qua, cung cấp cho người tiêu dùng những thực phẩm dinh dưỡng và tiện dụng. Tuy nhiên sự phát triển của rau quả fresh – cut cần đi đơi với an tồn vệ sinh thực phẩm, bởi vì những mơ lộ ra ngồi dể dàng bị thâm nhập bởi những vi khuẩn gây bệnh hơn những sản phẩm còn nguyên vẹn. Điều này là do giá trị dinh dưỡng cao và sự dễ nhiễm bệnh tại bề mặt cắt. Nghiên cứu của Britta Leverentz và cộng sự (2003) cho thấy rằng số lượng Listeria monocytogenes sống sót và phát triển chỉ ở mức độ không đáng kể trong táo đỏ fresh–cut ở 10oC nhưng lại phát triển đáng kể trong dưa bở ruột xanh fresh–cut ở 10oC trong 7 ngày. Hổn hợp thể thực khuẩn làm giảm số lượng
L.monocytogenes từ 102 đến 104.6 trong dưa bở ruột xanh. Trong táo sự giảm xuống là 100.4. Khi kết hợp với nisin thì hổn hợp thể thực khuẩn làm giảm số lượng
L.monocytogenes xuống trên 105.7 trong dưa bở ruột xanh và 102.3 trong mẩu táo. Nếu chỉ dùng nisin làm giảm số lượng L.monocytogenes 103.2 trong mẩu dưa bở ruột xanh và102 trong mẩu táo. Độ thực khuẩn thì ổn định trong mẩu dưa nhưng suy giảm nhanh chóng trong mẩu táo.
Trong suốt thập niên vừa qua xảy ra sự bùng nổ các căn bệnh do thực phẩm. Có thể có nhiều lý do cho sự gia tăng này, bao gồm gia tăng tiêu dùng các sản phẩm chế biến tối thiểu (hay sản phẩm fresh–cut) và chương trình vệ sinh dịch tể. Sản phẩm fresh – cut phát triển nhanh chóng từ 10–12 triệu đô/năm và tốc độ phát triển hàng năm tăng từ 10–20% (Hiệp hội sản phẩm fresh–cut quốc tế). Khả năng gia tăng của các bệnh thực phẩm trong sản phẩm fresh–cut cao hơn trong sản phẩm khơng bóc vỏ do bề mặt cắt có giá trị dinh dưỡng cao hơn và chỉ được bảo vệ bằng cách làm lạnh.
Một nguồn bệnh thực phẩm là Listeria monocytogennes, có liên quan đến một số lượng bệnh nghiêm trong đang bùng nổ hiện nay. Vi khuẩn này là một lồi ưa lạnh vì nó tồn tại và phát triển ở nhiệt độ nhỏ hơn hoặc bằng 8oC và vì vậy có thể trở thành một vấn đề lớn đối với thực phẩm lạnh. Sự nhiễm L.monocytogenes có liên quan đến các sản phẩm sữa, thịt bị, thịt heo, gia cầm và hải sản. Tuy nhiên ngày càng có thêm cơ sở về phạm vi ảnh hưởng của L. monocytogenes đối với rau xà lách, cải bắp, cần tây, rau diếp, dưa chuột, hành ,tỏi, cải xoong, củ cải, khoai tây, thì là…Trong nghiên
cứu về sự tồn tại và phát triển mầm bệnh trong rau trái, bệnh nhiễm Listeria chỉ xảy ra
ở nồng độ trên 103 CFU/g hay CFU/ml.
Một nghiên cứu khác của Britta Leverentz và cộng sự (2003) cho thấy rằng thể thực khuẩn làm giảm sự nhiễm bệnh trong sản phẩm fresh–cut thuận tiện hơn dùng tác nhân hóa học. Ví dụ như những phương pháp thơng thường trong cơng nghiệp như rửa bằng nước clorin hay nước sạch làm giảm số lượng Listeria ít hơn tới 10 lần. Đặc biệt thể thực khuẩn chỉ tấn cơng mầm bệnh, do đó nó có tác dụng chống lại vi sinh vật trong chính bản thân thực phẩm. Để làm giảm khả năng đột biến kháng thể thực khuẩn, chúng ta nên áp dụng nhiều công thức pha thể thực khuẩn khác nhau.
Nisin có phổ tác dụng rộng, được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic thường được tìm thấy trong sản phẩm. Nó có tác dụng chống lại vi khuẩn gram dương , bao gồm
L.monocytogenes. Nisin đặc biệt tác dụng ở pH thấp hơn giá trị pH đặc trưng của rau
trái. Nisin là chất bảo quản sinh học an toàn và được cho phép sử dụng bởi FAO, WHO, FDA. Sự sử dụng của nó ở những cấp độ khác nhau được cho phép ở hơn 70 quốc gia và áp dụng trong nhiều loại thực phẩm như sản phẩm sữa hay thực phẩm lên men. Nisin có thể được sử dụng riêng lẻ hay trong hổn hợp để bảo quản rau trái, thịt, thực phẩm nướng, thực phẩm đóng hộp, trứng, bia.
Sử dụng hổn hợp thể thực khuẩn LM103, LMP102 nồng độ 109PFU/ml hòa tan trong dung dịch muối NaCl 0,85%(w/v) và Nisaphin (sản phẩm công nghiệp của Nisin) hịa tan trong nước vơ trùng ở những nồng độ khác nhau để kháng khuẩn trong dưa và táo fresh–cut. Dựa vào đồ thị 2.20 và 2.21 ta thấy hoạt tính tốt nhất khi kết hợp thể thực khuẩn với nisin (nồng độ 400UI/µl).
Đồ thị 2.20: Sự phục hồi của L.monocytogenes trong mẫu dưa bỡ khi dùng nisin hay
nisin kết hợp với thể thực khuẩn sau 7 ngày (To, T7) ở 10oC. C: không dùng nisin và thể thực khuẩn.
Đồ thị 2.21:Sự phục hồi của L.monocytogenes trong mẫu táo đỏ khi dùng nisin hay
nisin kết hợp với thể thực khuẩn sau 7 ngày (To, T7) ở 10oC. C: không dùng nisin và thể thực khuẩn.
Đồ thị 2.22: Số lượng L.monocytogenes trong mẫu dưa khi ức chế bằng nước (W),
nisin (N), thể thực khuẩn (P), kết hợp nisin-thể thực khuẩn (NP) ở 10oC sau 7 ngày.
Nisin thể hiện hoạt tính tốt ở pH dưới 5 và tan tốt hơn ở pH thấp nên nó thích hợp sử dụng trong rau trái, do pH rau trái trong khoảng từ 3-6. Sử dụng hổn hợp này có thể làm giảm 105.8 vi khuẩn (đến nồng độ vi khuẩn cuối cùng là 1,4 CFU/ml) trong dưa bở ruột xanh và làm giảm 103.5 vi khuẩn (đến mật độ cuối là 0,6CFU/ml) với mẫu táo. Hiệu quả này lớn hơn nhiều so với sử dụng nước clorin hay nước thông thường.
Ở mẩu táo (pH 4,4) thì dường như tác động đối với vi khuẩn chỉ do nisin, mức độ hoạt tính của thể thực khuẩn ở pH thấp của táo giảm sút nhanh chóng. Khi tăng dần tỉ lệ thể thực khuẩn – Nisin/Listeria thì tác động giảm vi khuẩn càng tăng. Trong trái cây có pH thấp, nếu thêm nisin nồng độ cao hơn sẽ làm tăng hoạt tính của thể thực khuẩn kiểm sốt L. monocytogenes. Phương pháp này có tiềm năng lớn áp dụng trong cơng nghiệp cùng với việc kiểm sốt các yếu tố pH, nhiệt độ…[33]
Trong một nghiên cứu khác của Ukuku và cộng sự (2004) về ứng dụng nisin trong bảo quản trái cây cũng cho kết quả rất tốt. Trong nghiên cứu này, hổn hợp nisin (25 µg/ml) với hydrogen peroxide (1%), natri lactate (1%), acid citric (0.5%) (gọi là HPLNC) được kiểm tra khả năng làm giảm số lượng Escherichia coli O157:H7,
Escherichia coli O157:H7 và Listeria monocytogenes ban đầu lần lượt là 105.27 và 104.07
CFU/cm2, còn trong dưa bở ruột xanh lần lượt là 103.45và 103.05 CFU/cm2, chúng được giữ ở 5oC. Sau 7 ngày thì số lượng vi khuẫn trong hai mẫu dưa giảm từ 103 đến 104
CFU/cm2. Trong thí nghiệm cũng cho thấy rằng dùng HPLNC có hiệu quả tiêu diệt vi khuẩn tốt hơn chỉ dùng hydrogen peroxide 2,5%. [34]
2.3.2. Enterocin AS - 48 [35, 36, 37]
Listeria.monocytogenes gây ra nhiều bệnh cho con người như nhiễm trùng, viêm
màng nảo. Những người dễ mắc những bệnh này là người già, người có hệ miễn dịch bị tổn thương, phụ nử có mang. Sự bùng nổ bệnh do Listeria cũng như bệnh thực phẩm bắt đầu tử hơn hai thập kỷ trước. Trung tâm phòng ngừa và kiễm soát bệnh của Hoa Kỳ ước lượng mỗi năm nước này có 2500 ca nhiễm bệnh Listeria, trong đó có 500 ca tử vong. Listeria phân bố rộng rải trong môi trường và nhiều loại thực phẩm và có khả năng phát triển trong nhiều loại rau quả ở nhiệt độ làm lạnh và điều kiện thiếu oxi (để kéo dài thời gian bảo quản của thực phẩm lạnh ăn liền).
Những ca nhiễm Listeria tập trung vào những người tiêu dùng sử dụng rau sống, do nhiễm từ phân bón có nguồn gốc động vật. Đặc biệt từ những loại rau như: cần tây, khoai tây, rau diếp, xà lách, mầm đậu, mầm linh lăng. Sự gia tăng tiêu dùng các sản phẩm rau và hạt mầm khác trong những năm gần đây trong ăn sống, salad trộn hay trong các loại sandwich làm cho mối quan tâm về an toàn thực phẩm ngày càng gia tăng do chúng được xem là phương tiện cho sự lây nhiễm và bùng nổ các bệnh nhiễm trùng. Đến bây giờ vẫn chưa có phương pháp xử lý hóa học hay một loại nước rửa vừa có hiệu quả trong việc khử trùng vừa có thể ăn sống sản phẩm.
Bacteriocin là chất kháng khuẩn tự nhiên với khả năng to lớn trong bảo quản thực phẩm. Tuy nhiên hầu hết các nghiên cứu tập trung vào việc sử dụng bacteriocin trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, rất ít những nghiên cứu áp dụng bacteriocin trong bảo quản rau thực phẩm. Phổ kháng khuẩn rộng của Enterocin AS- 48 từ
Enterococcus faecalis, mang lại một tiềm năng lớn trong bảo quản thực phẩm. Nhiều
nghiên cứu khác nhau đã làm sáng tỏ về thành phần, cấu tạo phân tử, phương thức hoạt động, yếu tố di truyền của nó. Enterocin đã được nghiên cứu ứng dụng trong bảo quản sản phẩm sữa, thịt, trái cây và cả trong rau sống.
Trong một nghiên cứu của Antonio Cobo Molinos về tác động của dung dịch ngâm chỉ chứa Enterocin AS – 48 hay kết hợp với những chất bảo quản hóa học đến sự tồn tại và phát triển của Listeria. monocytogenes CECT 4032 trên mầm đậu nành, mầm cỏ linh lăng và măng tây xanh. Khi ngâm các loại rau này (5 phút ở nhiệt độ phịng) với dung dịch AS - 48 (25µg/ml) làm giảm số lượng Listeria từ 102 đến 102.4 CFU/g. Điều kiện nhiệt độ thuận lợi nhất cho sự ức chế Listeria là 22oC. Nếu sử dụng dung
dịch chứa AS – 48 cùng với acid citric, acid acetic, Natri propionate (0,1 – 0,5%), trisodium phosphate (1,5%), sodium thiosulfate, kali permanganate (25ppm), n – propylphydroxybenzoate (0,5%), acid peracetic (80ppm), hexadecylpyridium chloride (0,5%), hypo chloride (100ppm) hay natri nitrate (50ppm) làm giảm số lượng Listeria sống sót khoảng 102.6 đến 102.7 CFU/g sau 24 giờ.[35]
Đồ thị 2.23. Ảnh hưởng của việc nhúng trong dung dịch chứa AS-48 lên sự sống sót
của L.monocytogenes CECT4032 trong alfalfa sprouts (A, B, and C), soybean sprouts (D, E, and F), and green asparagus (G, H, and I). Sau khi nhúng 5 phút tại nhiệt độ phòng ở những nồng độ AS-48 0 (○),5(⌂), 12.5 (●), and 25 (□)µg/ml, sau đó mẫu được giữ ở 6oC (A, D, and G), 15°C (B, E, and H), or 22°C (C, F, and I).
Đồ thị 2.24. Ảnh hưởng của dung dịch chứa enterocin AS-48 (25µg/ml) và / hay acetic
acid, citric acid, sodium propionate, potasium sorbate, trisodium phosphate (TSP), trisodium trimeta phosphate (TSTMP), sodium thiosulfate, potassium permanganate, n-propyl-p-hydrobenzoate, (propyl-p-HB), p-hydrobenzoic acid methyl ester (p- HBME), peracetic acid, hexadecylpyridinium chloride (HDP), hay sodium chloride lên sự sống sót và phát triển của L.monocytogenes CECT 4032 trong măng tây xanh. Nhúng trong 5 phút ở nhiệt độ phịng. Số lượng tế bào sống sót ngay sau khi áp dụng (□) và sau 24 giờ tại 22oC (■).
Trong một nghiên cứu khác của R. Lucas, Enterocin AS-48 được kiểm tra tính kháng Bacillus coagulans trong ba loại rau quả đóng hộp: bột nhão cà chua (pH 4.64), syrup đào đóng hộp (pH 3.97) và nước dứa đóng hộp (pH 3.65). Khi những tế bào sinh dưỡng của B.coagulans CECT12 vào bột nhão cà chua rồi bổ sung 6 µg/ml AS-48 và trữ ở nhiệt độ khác nhau. Số lượng tế bào sống sót tương ứng là 102.37 (4oC), 104.3
(22oC) và 103 (37oC) sau 24 giờ. Sau 15 ngày tàng trữ thì khơng tìm thấy vi khuẩn sống sót ở bất cứ mẫu nào. Bacteriocin này cịn thể hiện hoạt tính với B.coagulans CECT 12 trong nước dứa đóng hộp ở 22oC, hoạt tính giảm khơng đáng kể trong syrup đào đóng hộp. Trong những mẩu có bổ sung thêm 1,5% acid lactic thì số lượng tế bào sinh dưỡng giảm tăng lên đáng kể sau 24 giờ tàn trữ. Khi thêm vào glucose và sucrose (10% &20%) thì hoạt tính của AS-48 chống lại tế bào sinh dưỡng của B.coagulans CECT12 tăng thêm. Đối với bào tử B.coagulans CECT12 thì hoạt tính của Enterocin AS-48 là khơng đáng kể. Tuy nhiên, nếu sử dụng AS-48 kết hợp với tác dụng nhiệt (80-95oC trong 5 phút) thì tác dụng đối với bào tử Bacillus thể hiện rỏ rệt. [36]
Còn Grande và cộng sự (2005) cũng đã nghiên cứu tác động của enterocin AS- 48 từ Enterococcus faecalis A-48-32 đối với Alicyclobacillus acidoterrestris- một vi khuẩn gây bệnh trong nước trái cây. Khi cho thêm enterocin AS-48 nồng độ 2,5µg/ml vào nước trái cây được ủ với tế bào sinh dưỡng của Alicyclobacillus acidoterrestris DSMZ 2498 thì sau 90 ngày khơng cịn một tế bào nào sống sót ở nhiệt độ 37 oC, 15 oC, 4oC. Đối với nước trái cây ủ với bào tử của vi khuẩn này thì hiệu quả cịn nhanh hơn nhiều, chỉ sau 1 phút bào tử đã bị mất hoạt tính ở nồng độ AS-48 là 2,5µg/ml. [37]