Sử dụng chỉ thị phân tử để định danh các loài ốc cối

Cùng với việc góp phần vào sự đa dạng sinh học biển, ốc cối cũng có vai trò quan trọng về mặt sinh thái - có đến hơn 36 loài cùng xuất hiện ở 1 nhánh triền san hô Kohn, 2001; về mặt tiến

em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của nhà trường, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, đặc biệt là các thầy cô giáo và cán bộ trong Viện Công Nghệ Sinh Học

và Môi Trường đã truyền những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong những năm học vừa qua

Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Thúy Bình và Th.S Khúc Thị An

đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn và chỉ bảo giúp em hoàn thành

đề tài tốt nghiệp này

Cuối cùng em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ động viên của gia đình, bạn bè, người thân, cảm ơn những ý kiến đóng góp và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Mặc dù đã có nhiều cố gắng hoàn thiện đề tài của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của quý thầy cô và các bạn

Nha Trang, tháng 6 năm 2011

Sinh viên

Nguyễn Thị Thúy Hà

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

LỜI NÓI ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (Conus spp.) 3

I TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG 3

I.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI 3

I.1.1 Hệ thống phân loại của ốc cối (Conus spp.) 3

I.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố 3

I.1.3 Đặc điểm hình thái ngoài của ốc cối 5

I.1.4 Cấu tạo bên trong của ốc cối 8

I.1.5 Chế độ ăn và phương thức săn mồi 9

I.1.6 Đặc điểm sinh sản của ốc cối 12

I.2 NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI 13

I.2.1 Cấu tạo bộ máy sinh độc tố (envenomation apparatus) 13

I.2.2 Phân loại độc tố conotoxin 17

I.2.3 Cơ chế tác động của độc tố ốc cối 21

I.2.4 Ứng dụng y học của độc tố ốc cối 21

I.3 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VỀ ỐC CỐ 23

I.3.1 Hệ gen cơ quan tử 23

I.3.2 Giới thiệu về hệ gen ty thể và hệ gen ribosom 23

1.3.3 Tình hình nghiên cứu di truyền ốc cối 28

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

II.1 PHƯƠNG PHÁP, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU VÀ ĐỊA ĐIỂM THU MẪU 33

II.2 MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 34

II.3 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA ỐC CỐI 37

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 43

III.1 MÔ TẢ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI 43

III.1.1 Conus marmoreus Linnaeus, 1758 43

III.1.1.1 Đặc điểm hình thái 43

III.1.1.2 Tập tính sống 44

III.1.1.3 Phân bố 45

III.1.1.4 Nhận xét 45

III.1.2 Conus bandanus BRUGUIÈRE, 1792 45

III.1.2.1 Đặc điểm về hình thái 45

III.1.2.2 Tập tính sống 46

III.1.2.3 Phân bố 46

III.1.2.4 Nhận xét 46

III.1.3 Conus imperialis Linnaeus, 1758 49

III.1.3.1 Đặc điểm hình thái 49

III.1.3.2 Tập tính sống 50

III.1.3.3 Phân bố 50

III.1.3.4 Nhận xét 50

III.1.4 Conus quercinus Lightfoot, 1786 52

III.1.4.1 Đặc điểm hình thái 52

III.1.4.2 Tập tính sống 53

III.1.4.3 Phân bố 54

III.1.4.4 Nhận xét 54

III.1.5 Conus lividus Hwass in Bruguière, 1792 54

III.1.5.1 Đặc điểm hình thái 54

III.1.5.2 Tập tính sống 56

III.1.5.3 Phân bố 56

III.1.5.4 Nhận xét 56

III.1.6 Conus capitaneus Linné, 1758 58

III.1.6.1 Đặc điểm hình thái 58

III.1.6.2 Tập tính sống 59

III.1.6.3 Phân bố 59

III.1.6.4 Nhận xét 59

III.1.7 Conus caracteristicus Fischer, 1807 60

III.1.7.1 Đặc điểm hình thái 60

III.1.7.2 Tập tính sống 61

III.1.7.3 Phân bố 62

II.1.7.4 Nhận xét 62

III.1.8 Conus betulinus Linné, 1758 62

III.1.8.1 Đặc điểm hình thái 62

III.1.8.2 Tập tính sống 63

III.1.8.3 Phân bố 63

III.1.8.4 Nhận xét 63

III.2 GIẢI PHẪU TUYẾN NỌC ĐỘC 66

III.3 KIỂM CHỨNG PHÂN LOẠI 3 NHÓM LOÀI CÓ HÌNH THÁI CHƯA RÕ NÉT BẰNG GIẢI TRÌNH TỰ DNA TY THỂ 68

III.3.1 C marmoreus và C bandanus 69

III.3.2 Conus leopardus và Conus litteratus 72

III.3.3 C distans và Conus cf distans 75

III.4 THẢO LUẬN 78

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 81

IV.1 Kết luận 81

IV.2 Kiến nghị 81

TÀI LIỆU THAM KHẢO 82

A TÀI LIỆU TRONG NƯỚC 82

B TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 82

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Superfamily của conotoxin và conopeptide (Bingham, 2010) 20

Bảng 1.2: Các peptide độc tố với những liệu pháp tiềm năng 23

Bảng 1.3: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein 26

Bảng 2.1: Thông số dùng để phân loại kích cỡ chiều dài của ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995) 35

Bảng 2.2: Công thức được dùng để phân loại trọng lượng của các loài ốc theo Verlag Christa Hemmen (1995) 35

Bảng 2.3: Công thức dùng để phân loại hình thái của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995) 35

Bảng 2.4: Công thức dùng để phân loại kích cỡ của ốc cối theo Verlag Christa Hemmen (1995) 36

Bảng 2.5: Trình từ các đoạn mồi được sử dụng trong phản ứng PCR 40

Bảng 3.1: Bảng giá trị tính theo công thức chuẩn quốc tế của các loài ốc cối 43

Bảng 3.2: Các thông số hình thái của Conus marmoreus 44

Bảng 3.3: Các thông số hình thái của Conus bandanus 46

Bảng 3.4: Các thông số hình thái của Conus imperialis 49

Bảng 3.5: Các thông số hình thái của Conus quercinus 53

Bảng 3.6: Các thông số hình thái của Conus lividus 55

Bảng 3.7: Các thông số hình thái của Conus capitaneus 59

Bảng 3.8: Các thông số hình thái của Conus caracteristicus 61

Bảng 3.9: Các thông số hình thái của Conus betulinus 63

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1: Khu vực phân bố của Conus marmoreus (1) và C bandanus (2) trên thế

giới 4

Hình 1.2: Các thông số hình thái vỏ của ốc cối (Conus ssp.) 6

Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.) 7

Hình 1.4: Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở biển Việt Nam .7

Hình 1.5: Cấu tạo bên trong của ốc cối 8

Hình 1.6: Phương thức săn mồi theo dạng móc câu của ốc cối 10

Hình 1.7: Phương thức săn mồi (cá) dạng móc câu của Conus striatus 10

Hình 1.8: Phương thức bắt mồi dạng lưới của ốc cối 11

Hình 1.9: Cơ chế bắt mồi theo dạng lưới của Conus geographus 11

Hình 1.10: Vòng đời của ốc cối 12

Hình 1.11: a: Conus achatinus :bọc trứng gắn trên vật bám (động vật 2 mảnh vỏ); b: Bọc trứng của C nivifer 13

Hình 1.12: Cấu tạo tuyến độc tố của ốc cối 14

Hình 1.13: Cấu trúc răng kitin của ốc cối 16

Hình 1.14: Cấu trúc răng kitin của một số loài ốc cối 16

Hình 1.15: DNA ty thể người 24

Hình 1.16: Cấu trúc hệ gen ribosome 26

Hình 1.17: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile 32

Hình 2.1: Địa điểm thu mẫu ốc cối tại vùng biển Nam Trung Bộ 33

Hình 2.2: Cấu tạo bên ngoài của ốc cối và các thông số hình thái 34

Hình 2.3: Các dạng hình dạng vỏ của Conus tính theo công thức 36

Hình 2.4: quy trình tách chiết ADN, khuếch đại gen và giải trình tự 38

Hình 2.5: Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR của gen 16S mtDNA 40

Hình 2.6: Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR của gen ITS2 rRNA 41

Hình 3.1 Hình dáng bên ngoài của Conus marmoreus và C bandanus 47

Hình 3.1.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus marmoreus tại các vùng địa lý trên thế giới 48

Hình 3.1.2: Các dạng hình thái khác nhau của Conus bandanus tại các vùng địa lý

trên thế giới 48

Hình 3.2: Đặc điểm hình thái ngoài của Conus imperialis và C quercinus 51

Hình 3.2.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus imperialis tại các vùng địa lý trên thế giới 51

Hình 3.2.2: Các dạng hình thái khác nhau của Conus quercinus tại các vùng địa lý trên thế giới 52

Hình 3.3: Đặc điểm hình thái ngoài của Conus lividus (Hình trên) và C capitaneus (Hình dưới) a: mặt trước; b: tháp vỏ; c: mặt sau 57

Hình 3.3.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus lividus tại các vùng địa lý trên thế giới 57

Hình 3.3.2 Các dạng hình thái khác nhau của Conus capitaneus tại các vùng địa lý trên thế giới 58

Hình 3.4: Đặc điểm hình thái ngoài của C caracteristicus và C betulinus 64

Hình 3.4.1: Các dạng hình thái khác nhau của Conus caracteristicus tại các vùng địa lý trên thế giới 65

Hình 3.4.2 : Các dạng hình thái khác nhau của Conus betulinus tại các vùng địa lý trên thế giới 65

Hình 3.5: Tuyến nọc độc của một số loài ốc cối 66

Hình 3.6: Cấu trúc răng kitin của ba loài ốc cối 67

Hình 3.7: Kết qủa điện di DNA tổng số của ốc cối 68

Hình 3.8: Sản phẩm PCR gen 16S mtDNA và ITS2 rDNA 68

Hình 3.9: Trình tự gen 16S mtDNA của Conus marmoreus và C bandanus 70

Hình 3.10: Trình tự gen ITS2 rDNA của Conus marmoreus và C bandanus 71

Hình 3.11: Đặc điểm hình thái của Conus leopardus và C litteratus (hình dưới) 72

Hình 3.12: Trình tự gen 16S mtDNA của Conus litteratus và C Leopardus 74

Hình 3.13: Đặc điểm hình thái của C distans và Conus cf distans 75

Hình 3.14: Trình tự gen 16S mtDNA của Conus distans (from Genbank) và Conus cf distans 77

LỜI NÓI ĐẦU

Với hơn 550 loài được biết đến hiện nay, giống ốc cối (Conus spp.) dường

như là giống lớn nhất trong các động vật sống ở đại dương Cùng với việc góp phần vào sự đa dạng sinh học biển, ốc cối cũng có vai trò quan trọng về mặt sinh thái - có đến hơn 36 loài cùng xuất hiện ở 1 nhánh triền san hô (Kohn, 2001); về mặt tiến hóa - tỉ lệ đa dạng (net diversification rate) của ốc cối cao nhất trong lớp chân bụng (Stanley 2007); về mặt kinh tế thì ốc cối rất đa dạng về hình dạng cũng như màu sắc hoa văn vì vậy vỏ của chúng được khai thác làm đồ mỹ nghệ và về mặt sinh học thần kinh và y học - ốc cối có rất nhiều các neuropeptides đặc hiệu trong độc tố của chúng (Olivera, 2006) Chính vì vậy, việc định danh loài và xác định mối quan hệ tiến hóa của ốc cối là rất cần thiết

Hiện nay, phân loại ốc cối chủ yếu dựa vào kích thước vỏ, kiểu, hoa văn và màu sắc hay vân trên vỏ, cụ thể là những đường gờ hay phần lồi trên vỏ (Kohn và

cs, 1999) Tuy nhiên, việc định danh loài ốc cối bằng mẫu sống thường gặp nhiều khó khăn do sự biến dị liên quan đến vùng phân bố hoặc biến dị cá thể Hơn nữa, lớp bọc ngoài vỏ ốc (periostracum) thường đục và bao phủ toàn bộ vỏ khiến các vân màu sắc bị che khuất Việc lọai bỏ lớp bao này bằng KOH (hoặc NaOH) có thể ảnh hưởng đến các vân màu và không thể áp dụng đối với mẫu vật sống Đặc điểm hình thái có thể chịu tác động của môi trường, biến dị cá thể cùng loài (Intraspecific) và khác loài (Interspecific), dễ gây nhầm lẫn trong quá trình phân loại Không chỉ có các thành phần độc tố là đặc trưng cho loài, các biến dị liên quan đến vùng địa lý và tuổi cũng đã được ghi nhận (Bingham và cs, 1996) Chính vì vậy, hệ thống phân loại của loài ốc cối hiện nay vẫn còn nhiều tranh cãi và đôi khi mang lại kết quả không chính xác

Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và xác định một cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần thiết (Blaxter 2003, 2004; Hebert và cs, 2003a, b; Stoeckle 2003) Các chỉ thị phân tử của DNA ty thể thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị của DNA nhân Đối với các động vật

thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài (Grande và cs, 2008)

Nghiên cứu của chúng tôi kết hợp đặc điểm hình thái và di truyền để định

danh phân loại một số loài ốc cối (Conus spp.), đặc biệt là các loài có hình thái chưa

rõ nét và đưa ra các chỉ tiêu phân loại có tính chất đặc trưng cho định danh loài

Mục tiêu nghiên cứu:

 Mô tả khái quát hình dáng bên ngoài và các cơ quan của tuyến nọc độc từ đó phân loại ốc cối

 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và di truyền để định danh phân loại một số loài

(Conus spp.) thu thập ở vùng biển Miền Trung, Việt Nam

CHƯƠNG I:

TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI (Conus spp.)

I TỔNG QUAN VỀ CÁC LOÀI ỐC CỐI VÀ ĐỘC TỐ CỦA CHÚNG

I.1 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, SINH HỌC VÀ PHÂN BỐ CỦA ỐC CỐI

Giống ốc cối thuộc nhóm họ Conidae là một trong những giống có số lượng loài lớn nhất trong ngành động vật thân mềm Cho đến nay, trên thế giới người ta đã

xác định có khoảng hơn 500 loài ốc cối, chủ yếu thuộc giống Conus Ốc cối là loại

động vật ăn thịt, săn mồi sống và có nọc độc Thức ăn chính của chúng là cá, giun biển và nhuyễn thể Nhiều loài trong họ Conidae có vỏ rất đẹp và là mặt hàng mỹ nghệ có giá trị Ngoài ra một số loài trong họ ốc này có tuyến độc rất nguy hiểm có thể gây chết người Do vậy chúng đã thu hút sự chú ý của các nhà nghiên cứu động vật thân mềm từ hàng trăm năm nay

I.1.1 Hệ thống phân loại của ốc cối (Conus spp.)

I.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Giống ốc cối phân bố khắp nơi trên thế giới, chúng thường phân bố ở vùng vĩ độ giữa 400 Bắc và 400 Nam, tương đương với các vùng biển: Ấn độ - Thái Bình Dương, Panamic, Caribbean, Peru, Patagonic, Tây và Nam Phi và Địa Trung Hải Một số loài có thể phân bố ở vĩ độ trên 400 như ở Nam Phi, Nam Australia, Nam Nhật Bản và biển Địa Trung Hải Ngoài ra chúng còn phân bố ở các vùng biển nhiệt đới và vùng biển ấm như

Philippine, Indonesia, Australia, Mexico, Florida, Hawaii, Tuy nhiên, các nghiên cứu cũng cho thấy một số loài có thể thích ứng với sự thay đổi của điều kiện môi trường như ở vùng biển nóng mũi Cape, Nam Phi hay vùng biển lạnh phía tây Califonia, Hoa Kỳ Trong khi đó, một số loài cận nhiệt đới được tìm thấy vùng triều dưới độ sâu 10 - 30 m và dưới các tảng đá ở vùng triều nông (Stewart và Gilly, 2005) Chúng có thể ẩn mình trong cát hoặc dưới các rặng đá vôi (Rockel và cs, 1995) Một số loài có thể sống ở các rừng ngập

mặn, hoặc sống ở vùng nước sâu đến 400 m Sự phân bố của Conus marmoreus và C bandanus được mô tả ở hình 1.1.

Hình 1.1: Khu vực phân bố của Conus marmoreus (1) và C bandanus (2) trên

thế giới (Rockel và cs, 1995)

Tại Việt Nam, ốc cối phân bố chủ yếu ở các vùng ven biển thuộc khu vực Nam Trung Bộ từ Đà Nẵng đến Kiên Giang và quanh các hải đảo (Trường Sa, Hoàng Sa, Côn Đảo)

Nguyễn Ngọc Thạch (2007) mô tả 39 loài ốc ở Việt Nam thuộc họ Conidae Trong đó có rất nhiều loài phân bố ở Bình Thuận, Ninh Thuận, Khánh Hòa

Hylleberg và Kilburm (2003) trong khuôn khổ dự án Tropical Marine Molluscs Program (TMMP) đã công bố 76 loài ốc cối được tìm thấy ở vùng biển Việt Nam dựa trên việc thu thập mẫu, khảo sát các bộ sưu tập ở bảo tàng sinh vật biển Việt Nam

Nghiên cứu của Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Đại học Nha Trang cho thấy ốc cối ở khu vực Nam Trung Bộ (khảo sát ở 4 tỉnh Quảng Nam, Quảng Ngãi, Khánh Hòa và Bình Thuận) khá đa dạng về thành phần loài Trong đợt khảo sát 2008-2009, khoảng 20 loài đã được phân loại dựa trên đặc điểm hình thái

và di truyền (gen 16S của DNA ti thể - 16S mtDNA) (theo Báo cáo tổng kết dự án

“Bảo tồn tiềm năng di truyền các loài thủy hải sản Việt Nam” năm 2008-2009)

I.1.3 Đặc điểm hình thái ngoài của ốc cối

Giống Conus là tập hợp gồm khoảng 700 loài Ốc cối có hình dạng như trái

tim (một số vùng ở Việt Nam ngư dân thường gọi là ốc trái tim), cùng với sự đa dạng về loài thì chúng cũng có kích cỡ rất khác nhau Loài có kích cỡ lớn nhất có chiều cao vỏ đến 23 cm Nhưng hầu hết các loài đều có kích thước nhỏ dưới 8 cm,

và khối lượng dưới 100 g ( Rockel và cs, 1995) Các loài ốc cối thường có màu sắc sặc sỡ với những hoa văn rất đẹp mắt Vỏ thuôn dài, bằng đá vôi, chắc, nặng, xoắn theo chiều kim đồng hồ Đầu có 1 xúc tu (râu), toàn thân được bao bọc trong lớp vỏ dày vững chắc Ốc cối là động vật ăn thịt, chúng ăn mồi sống, chúng thường đi săn mồi và ăn các loại giun, nhuyễn thể, cá nhỏ và thậm trí cả một số loài ốc cối khác

Vì chúng chuyển động rất chậm nên khi bắt một số con mồi di chuyển nhanh như cá chúng sử dụng độc tố để tấn công con mồi

Để phân loại ốc cối người ta thường dựa vào màu sắc hoa văn trên vỏ, các dạng khác nhau của vỏ và các chỉ tiêu phân loại về hình thái bao gồm tháp vỏ, mương trước miệng vỏ, mương sau miệng vỏ, mép ngoài miệng vỏ, mép trong

miệng vỏ như ở mô tả ở hình 1.2, 1.3 Bên cạnh đó việc đo đạc các thông số hình

thái như chiều cao tháp vỏ, chiều cao vỏ, chiều cao tầng thân và chiều rộng cũng góp phần quan trọng trong việc định danh các loài ốc cối Hình 1.4 thể hiện sự đa dạng về màu sắc hoa văn trên vỏ, cũng như các hình dạng khác nhau của một số loài

ốc cối thu tại Việt Nam

Các chỉ tiêu phân loại dựa vào hình thái vỏ

cũng không thấp quá như ở Conus ebraeus hay những loài có phần chóp thấp hay bằng phẳng như Conus betulinus thì phổ biến hơn so với những loài có phần chóp cao so với cơ thể như loài Conus lynceus Tại Việt Nam thì hình dạng của các loài

ốc cối cũng khá đa dạng Loài C betulinus, C litteratus và C leopardus thuộc nhóm ốc có hình nón rộng Loài C capiteneus, C bandanus và C marmoreus thuộc

Hình 1.3: Các dạng hình thái vỏ khác nhau của ốc cối (Conus spp.)

Hình 1.4: Hình thái vỏ của các loài ốc cối phân bố ở biển Việt Nam

1: Conus betulinus; 2: C leopardus; 3: C litteratus; 4: C textile; 5: C tesulates; 6,7,13,22: C caracteriscus; 9: C bandanus; 10: C marmoreus; 11: C imperalis; 12: C terebra; 14: C lividus; 15: C miles; 16: C vexilum; 17: Conus sp.; 18:C quercinus; 19: C striatus; 20: C capitaneus; 21: C cf distans; 23: C magus

C lynceus

I.1.4 Cấu tạo bên trong của ốc cối

Cấu tạo trong của ốc cối gồm các bộ phận như mô tả dưới đây (Hình 1.5)

Hình 1.5: Cấu tạo bên trong của ốc cối

(http://www.theconesnail.com/explore-cone-snails/body-anatomy)

Vòi hút (Proboscis): Vòi hút là vũ khí săn mồi của ốc cối Độc tố được tiêm

vào con mồi bằng các răng chứa trong túi răng kitin Vòi hút có thể duỗi dài ra gấp

2 lần cơ thể ốc cối Vòi hút là dạng biến đổi của cơ màng áo, nó dẫn nước thông với xoang màng áo Vòi hút dài hoạt động như một ống thở, nên một số loài ốc cối có khả năng vùi mình sâu dưới cát tránh kẻ thù trong lúc vòi hút vẫn vươn lên trong

nước

Súc tu (Siphon): siphon của ốc có chức năng như mũi hay còn gọi là cơ quan

khứu giác Cơ quan này lớn và phức tạp, là một túi có thể duỗi dài ra và được xem như là cơ quan thứ hai Cơ quan này tập trung nhiều dây thần kinh kết nối tới não

bộ, nó thu nhận những tín hiệu hóa học trong môi trường sống sinh vật, ví dụ như những mùi phát ra từ con mồi hoặc kẻ thù Giống như hầu hết các loài động vật thân mềm khác, vì vậy ốc cối có thể nhận được tín hiệu bằng cách đánh hơi mùi hóa học, nhờ trang bị đó chúng có thể phát hiện ra sự có mặt của thức ăn hoặc kẻ thù ở một khoảng cách nào đấy Cơ quan này nằm ở xoang màng áo giữa vòi hút và mang, nên tất cả nước từ xoang này đều phải đi qua cơ quan khứu giác vì vậy nó góp phần đưa nước đến mang giúp cho quá trình hô hấp

Mắt: Ốc cối có 2 mắt, nằm ở 2 bên miệng Hiện tại vẫn chưa biết được về

khả năng nhìn của ốc cối hay câu hỏi đặt ra là liệu chúng có đủ ánh sáng khi sống ở các vùng biển sâu hay không?

Miệng: Ốc cối có miệng có thể mở rộng ra phía trước để nuốt con mồi Hệ

thống cơ có thể co duỗi để đưa miệng vào trong vỏ

Chân: Chân có cấu tạo bằng cơ giúp ốc cối di chuyển trên các bề mặt

I.1.5 Chế độ ăn và phương thức săn mồi

Ốc cối là động vật ăt thịt, chúng ăn mồi sống Ốc cối được phân loại dựa vào loại thức ăn của chúng ví dụ như loài ăn giun biển, ăn nhuyễn thể, ăn cá và thậm chí chúng ăn ngay cả một số loài ốc cối khác (Rockel và cs, 1995) Do di chuyển chậm nên khi bắt một số con mồi di chuyển nhanh như cá, chúng sử dụng độc tố để tấn công làm tê liệt con mồi Chúng tấn công mồi bằng việc bắn mũi tên nhỏ có chất độc vào con mồi Do cấu tạo vỏ của chúng có kẽ hở rộng nên chúng có thể thò vòi tiếp xúc với con mồi ở phạm vi khá rộng, dễ gây nguy hiểm cho con mồi Khi con vật phóng mũi tên (răng kitin) hoặc chích vào con mồi, vòi thò ra và một bộ phận hình mũi tên đâm con mồi, rồi phóng chất độc vào Nọc độc là một hỗn hợp chứa nhiều loại phân tử protein độc, trong đó mỗi loại phân tử chứa hàng trăm chất độc, khiến con mồi không thể nào kháng cự được

 Loài ăn cá (Piscivorous)

Ốc cối săn mồi là các loại cá nhỏ được goi là piscivorous Có 2 loại phương thức săn mồi đối với ốc cối ăn cá: săn mồi bằng móc câu (hook-and-line hunters) và săn mồi bằng lưới (net hunters)

Phương thức săn mồi theo dạng móc câu

Ốc cối săn mồi bằng móc dùng vòi hút như dạng cần câu cá Ốc sẽ dùng siphon để tìm kiếm con mồi Nếu ốc cối phát hiện ra con mồi, nó sẽ phóng vòi hút (có thể gấp 2 lần chiều dài cơ thể) (hình 1.5) Trong vòi hút có các răng chứa độc tố

sẽ được bắn vào con mồi khi vòi hút chạm vào cơ thể cá Độc tố từ răng thâm nhập vào con mồi và nhanh chóng làm tê liệt chúng

Độc tố ốc cối là hỗn hợp các conotoxin có khả năng làm tê liệt con mồi bằng nhiều cách khác nhau Các loài ốc săn mồi bằng móc câu cần con mồi trở nên cứng

đờ để chúng có thể dễ dàng nuốt chúng Chúng tiêm độc tố tạo ra sự shock đồng bộ Đầu tiên cá bị co giật, trong vòng 1 giây rồi trở nên cứng đờ và không cử động Cá

bị bất động và không thể gây đau đớn cho ốc cối hoặc trốn thoát Răng kitin có ngạch vì vậy, con mồi sẽ bị giữ lại trong vòi hút Cá sau đó nhanh chóng bị hút vào miệng ốc

Hình 1.6: Phương thức săn mồi theo dạng móc câu của ốc cối

Hình 1.7: Phương thức săn mồi (cá) dạng móc câu của Conus striatus

Phương thức săn mồi theo dạng lưới (hình 1.8)

Những loài ốc cối bắt mồi bằng lưới mở rộng miệng vể phía trước để nuốt nhiều con mồi Một số loài có vòi hút bên ngoài dạng ngón tay có thể khiến con mồi nhầm tưởng đó là hải quì Phần miệng mở rộng cũng có thể trông giống san hô dạng chén hoặc là một nơi trú ẩn trên sạn sạn hô

Ngay khi con mồi (cá) lọt vào trong miệng, ốc cối sẽ phóng răng kitin chứa độc tố vào con mồi và làm tê liệt chúng Ở loài săn mồi dạng lưới, độc tố của chúng

tạo ra dạng tê liệt mềm Ốc cối địa lý (Conus geographus) (hình 1.9) là một ví dụ

Vòi hút Súc tu

điển hình của kiểu săn mồi này Các nhà khoa học tin rằng ốc cối tiết hóa chất vào môi trường nước để làm giảm hoạt động của con mồi Hầu hết các loài ốc cối đều kiếm ăn vào ban đêm (nocturnal) khi mà các loài cá đang ngủ Quá trình tiêu hóa con mồi có thể diễn ra nhiều giờ đến nhiều ngày, ốc cối sẽ thải ra xương cá, răng kitin và có thể cát hoặc sỏi bị nuốt vào

Hình 1.8: Phương thức bắt mồi dạng lưới của ốc cối

Hình 1.9: Cơ chế bắt mồi theo dạng lưới của Conus geographus a: Phần miệng

mở rộng giống san hô dạng chén; b: Ngay khi cá lọt vào trong miệng, Conus geographus sẽ phóng răng kitin chứa độc tố vào con mồi và làm chúng bị tê liệt mềm; c: Quá trình tiêu hóa con mồi

(http://www.aquariumadvice.com/forums/f16/will-this-snail-eat-my-cleaner-shrimps-122890.html)

c

 Loài ăn nhuyễn thể (Molluscivores)

Ốc cối ăn các loài nhuyễn thể khác được goi là molluscivores Một vài loài

ốc cối ăn các loài ốc khác như là ốc tiền (cowries), olive shells, turbo snails, và conch snails, trong khi đó các loài khác lại ăn các loài ốc cối khác Những loài ốc này có thể giết và nuốt những con mồi lớn hơn chúng Đã có ghi nhận rằng ốc cối

có thể nuốt những con mồi nặng bằng nửa trọng lượng của chúng

 Loài ăn giun biển (Vermivores)

Ốc cối ăn các loài giun biển (polychate) được goi là vermivores, ví dụ loài

Conus chaldeus, C ebraeus và C capitaneus Thì Conus chaldeus và C ebraeus thuộc về cùng 1 nhóm, nghĩa là chúng có cùng tổ tiên Còn Conus capitaneus ở 1

nhóm khác so với 2 loài trên Ốc cối ăn giun biển dùng hệ thống phân phối độc tố tương tự như ốc ăn cá và nhuyễn thể Khi con mồi bị tiêm nọc độc và tê liệt, ốc cối

sẽ nhanh chóng tiêu hóa chúng

I.1.6 Đặc điểm sinh sản của ốc cối

Hình 1.10: Vòng đời của ốc cối ( Rockel và cs, 1995 )

Vòng đời của ốc cối kéo dài khoảng 10 - 15 năm trong tự nhiên, cũng như trong điều kiện nuôi nhốt Sinh sản ở ốc cối không được nghiên cứu nhiều nhưng hầu hết là sinh sản hữu tính nhờ quá trình thụ tinh giữa con đực và con cái Vòng đời của ốc cối được mô tả ở (hình 1.10) Trứng đươc đẻ mỗi năm một lần và gắn với vật bám (Kohn, 1961), (hình 1.11.a) và nằm trong vỏ bao (hình 1.11.b), mỗi vỏ bao chứa một số lượng trứng khác nhau Các giai đoạn phát triển ban đầu rất quan trọng

và không kéo dài quá vài ngày Hai giai đoạn con non đã được ghi nhận là veligers (giai đoạn ấu trùng) và veliconcha (giai đoạn ốc nhỏ) Giai đoạn sống trôi nổi ngoài biển thường từ 1 - 50 ngày

Hình 1.11: a: Conus achatinus :bọc trứng gắn trên vật bám (động vật 2 mảnh

vỏ); b: Bọc trứng của C nivifer (Rockel và cs, 1995) I.2 NGHIÊN CỨU VỀ ĐỘC TỐ CỦA ỐC CỐI (Conus spp.)

I.2.1 Cấu tạo bộ máy sinh độc tố (envenomation apparatus)

Bộ máy nọc độc của ốc Conus gồm 4 bộ phận: túi nọc độc, ống dẫn độc, túi

răng kitin và vòi hút như ở hình 1.12

đầu ra

Trứng

Vỏ bao Chất nhờn

Thân

Đáy

Đầu ra (lỗ hổng thoát ra) của trứng

a

b

Hình 1.12: Cấu tạo tuyến độc tố của ốc cối

Túi nọc độc: còn được gọi là túi Leiblin, là bộ phận lớn nhất của bộ máy nọc

độc có hình lưỡi liềm, màu trắng nằm ở góc phải so với trục cơ thể hình nón, mặt lõm hướng về phía trước Tuyến độc dài khoảng 2,2 - 2,5 cm, rộng 0,5 - 0,7 cm Những mô tả về mô học đã cho thấy chức năng cơ học của tuyến này, nó đảm nhiệm việc bài tiết chất độc Khi cắt ngang tuyến độc cho thấy cấu trúc bên trong có

3 lớp: 2 lớp bao gồm các tế bào hình đa giác, nằm giữa các lớp là một vòng cơ dày

100 micron, đóng vai trò như một loại bộ khung, tăng cường cho sự liên kết của lớp ngoài

Ống dẫn độc: là cơ quan chính của bộ máy nọc độc Nó là một ống dài màu

vàng và có đường kính khoảng vài trăm micrometer, cuộn lại thành từng búi, chiều dài của ống độc có thể tới 6 - 10 cm (hình 1.12) Nó nằm ở phía sau hầu về phía bên phải ngay sau vòng cơ Khi cắt dọc ống này cho thấy một vùng sáng rõ rất lớn được lấp đầy chất độc trong các cấu trúc dạng dây của các hạt màu, được bao quanh bởi một lớp biểu mô mỏng của các tế bào tiết hình khối nằm ở phần gốc sợi cơ Thành ống bao gồm một lớp cơ vòng nhẵn trung gian và một lớp cơ theo chiều dọc bên ngoài Ngay từ năm 1946, Hermitte đã lưu ý rằng, nó không chỉ là một ống dẫn đơn giản để vận chuyển chất độc đến bộ máy đầu độc mà còn là cơ quan nơi mà chất độc được hình thành có vai trò dẫn chất độc từ túi nọc đi ra răng kitin để tiêm vào con mồi

Vòi hút: là phần cuối cùng của tuyến nọc độc, rỗng phía trong, hình chóp cụt,

lớn hơn ở phần nối với hầu, nhỏ hơn đối với phần còn lại, có khả năng thay đổi kích thước và độ đàn hồi rất tốt Khi tấn công con mồi, vòi hút sẽ phình to lên hút con

mồi vào bên trong đưa đến nhánh ngắn của túi răng kitin và răng kitin được phóng vào, tiếp đến chất độc sẽ được bơm đầy làm tê liệt con mồi Cấu trúc mô học của vòi hút là lớp tế bào cơ vân, chính cấu trúc này giải thích cho khả năng đàn hồi và sức chứa đựng lớn

Túi răng kitin (dải răng kitin): chứa các răng kitin Dải răng này bao gồm hai

nhánh như hai cánh tay Nhánh dài có màu đỏ ở phần nối với ống dẫn và vàng nhạt

ở phần còn lại, nhánh còn lại trong suốt (Hình 1.12) Phía cuối túi răng kitin này có

tế bào odontoblast (tế bào tạo răng) có vai trò tạo ra các răng kitin Các răng kitin ban đầu mềm sau đó trở nên cứng khi chúng di trú từ nhánh dài đến nhánh ngắn Các dải răng kitin được xếp thành 2 hàng theo chiều dọc và xếp song song với nhau, các đầu nhọn quay về phía đáy túi Khi ở bên trong nhánh ngắn, các răng trưởng thành và cứng Phần này được bao bọc bởi một lớp biểu mô ngoài dày khoảng 7,5

µm, một lớp mô liên kết hẹp và một lớp biểu mô bên trong của các tế bào dài khoảng 25 µm Biểu mô bên trong cuộn nếp phức tạp và dày khoảng 125 µm Quá trình đi tới nhánh ngắn răng kitin đi song song dọc theo túi Chỉ một răng kitin trưởng thành, cứng lên và đi về phía hầu chuẩn bị cho việc tấn công Cấu trúc răng kitin của ốc cối được thể hiện ở hình 1.13 và cấu trúc răng kitin của một số loài ốc cối được thể hiện ở hình 1.14

Hình 1.13: Cấu trúc răng kitin của ốc cối

Hình 1.14: Cấu trúc răng kitin của một số loài ốc cối: A: C augur B:

C bayani C : C betulinus D : C caracteristicus E C figulinus F:

C loroisii G: C malacanus H: C hyaena I: C inscriptus

Gai trước

Gai thứ 2

Gai thứ 3 Lưỡi

Thân răng

Eo

Khớp đáy

Lưỡi kim Cựa đáy

Thân răng

Dây chằng

Kohn và cs (1972) nghiên cứu răng kitin của Conus imperialis bằng kính hiển

vi điện tử đã làm sáng tỏ cấu trúc và mối liên hệ giữa các bộ phận: đầu răng, các ngạnh, lưỡi cắt, đường răng cưa, nếp gấp bên ngoài, trục thân và đáy Nhóm tác giả

cũng đề xuất các vai trò chức năng của các bộ phận này trong việc bắt mồi

James (1980) nghiên cứu răng kitin của các loài ốc cối ở vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương đã ghi nhận 3 nhóm riêng biệt dựa trên phương thức săn mồi; loài

ăn cá răng kitin gồm 2 loại, loại thứ 1 (2 ngạnh với đầu uốn cong, không có cựa đáy); loại thứ 2 (2 ngạnh phía trước, phần lưỡi có cấu trúc răng cưa, không có cựa đáy và khớp đáy); loài ăn nhuyễn thể răng có 2 ngạnh phía trước một số loài có đường răng cưa và cựa đáy; loài ăn giun biển cho thấy sự biến dị loài cao với 2 ngạnh phía trước, vùng răng cưa gần đỉnh, lưỡi kim ở vị trí cựa đáy Nghiên cứu còn cho thấy cấu trúc răng kitin sẽ chuyên biệt cho từng loại con mồi và rất có giá trị trong việc phân loại các loài ốc cối

Franklin và cs (2007) nghiên cứu hình thái răng kitin của một số loài ốc cối ở các vùng ven biển Ấn Độ, kết quả cho thấy sự khác biệt trong cấu trúc răng kitin ở các loài này và họ đã phân loại các loài nghiên cứu làm ba nhóm: ăn cá, ăn nhuyễn thể, ăn giun biển Nhóm A gồm các loài ăn cá (có 3 ngạnh với các đầu gai uốn cong, không có đường răng cưa, eo, lưỡi kim, cựa đáy); nhóm B ăn nhuyễn thể (1 ngạnh

và 1 lưỡi hoặc lưỡi thay bằng ngạnh thứ 2, đường răng cưa dài kết thúc ở chỗ lồi lên của lưỡi kim, có hay không có eo, không có cựa đáy); nhóm C ăn giun biển (1

ngạnh và 1 lưỡi, có đường răng cưa, có cựa đáy, có eo răng)

I.2.2 Phân loại độc tố conotoxin

Tùy thuộc vào khả năng gây tử vong, mỗi loại peptide của độc tố ốc được thuộc loại conotoxin (gây tử vong) hoặc conopeptide (không gây tử vong) Mỗi loại độc tố ốc là một dãy duy nhất chứa trên 100 loại peptide khác nhau Khi giải mã gen, người ta thấy rằng các conotoxin là các propeptide, sau đó chúng được enzym endoprotease phân cắt để tạo thành các peptide độc cuối cùng Các peptide này có kích thước nhỏ, tương đối dễ tổng hợp, cấu trúc ổn định, tác dụng vào các mục tiêu

chuyên biệt làm cho chúng trở thành các đầu dò (probe) lý tưởng trong dược học Một điều rất ngạc nhiên là đa số các độc tố ốc có liên quan sự giảm đau đớn và được dùng trong trị liệu giảm đau Người ta ước lượng có khoảng trên 50.000 đến 100.000 loại conopeptide nhưng chỉ mới khoảng 0,1% được đặc trưng hóa về dược học Chính số độc tố lớn lao này là một nguồn vật liệu dồi dào cho việc nghiên cứu đặc tính và ứng dụng Các độc tố này tác dụng lên các kênh canxi (ω-conotoxin), natri (µ-, µO- và δ- conotoxin) và kali (κ- conotoxin), chất vận chuyển norepinephrine (χ-conopeptide), thụ thể (receptor) acetylcholine nicotinic (α-conotoxin), α1-adrenoceptor (ρ-conopeptide), thụ thể NMDA (conantokins), thụ thể

vasopressin (conopressin) và thụ thể neurotensin (contulakins)

Độc tố ốc cối được phân ra thành 6 superfamily (A-, M-, O-, P-, S-, và T-) dựa trên khung cystein của chúng, sự tương đồng của trình tự pre-pro của gen , kiểu cuộn và tác dụng sinh lý Chúng được biết có hoạt tính antinoceptive, chống động kinh, bảo vệ tim, bảo vệ thần kinh, do đó chúng trở nên các công cụ hữu ích trong nghiên cứu ung thư, neuromuscular và rối loạn tâm lý (Bingham, 2010)

Superfamily A gồm 4 họ độc tố: α-, αA-, κA- và ρ-conotoxin Trong đó α-,

và αA-conotoxin là các nAChR đối kháng, κA- conotoxin tấn công vào các kênh

K+ trong khi ρ-conotoxin là các antagonist ưa thích tấn công vào các a1Badrenoceptor α-conotoxin làm ngăn cản các thụ thể acetylcholine nicotinic (nAChR) Các α-conotoxin có chứa từ 12 đến 25 acid amin và có 4 cystein, tạo nên hai liên kết disulfid α-conotoxin SII có chứa 6 cystein và 3 liên kết disulfid Việc

ức chế các thụ thể này cho thấy có liên quan trực tiếp đến việc học, antinoception, nghiện nicotin, và rối loạn thần kinh thuộc bệnh Parkinson và Alzheimer

Superfamily M nhỏ hơn, có hai họ là µ- và ψ-conotoxin Psi (ψ)-conotoxin

tấn công vào kênh nAChR, không cạnh tranh trong khi mu (µ)-conotoxin làm nghẽn kênh natri phụ thuộc điện thế (voltage) Nav trong các tế bào excitable như cơ, tim,

mô cơ xương và mô thần kinh Với kích thước trung bình, 22 acid amin, conotoxin có 6 cystein và 3 liên kết disulfid

Superfamily O là lớn nhất và có 5 họ: µO-, δ-, ω-, κ- và γ-conotoxin Cả hai

họ µO- và δ-conotoxin tấn công kênh Nav ( khác vùng với µ-conotoxin) trong khi các họ khác tương ứng tấn công các kênh Ca2+, kênh K+ và kênh Pacemaker δ-conotoxin có chứa khoảng 30 acid amin và có bản chất kỵ nước mạnh

Superfamily P chỉ chứa một họ có tính ức chế cystein knot motif, gây chứng

co cứng cơ Các độc tố này gây chứng liệt cơ (spastic paralysis) nhưng phân tử của chúng vẫn chưa xác định được Một ví dụ của conotoxin gây liệt cơ là Tx9a, là một peptid chứa acid glutamic gamma carboxy được tìm thấy trong độc tố của loài ốc ăn

nhuyễn thể là Conus textile Sự biến đổi sau khi phiên dịch mã (post-translational

modifications, PTMs) trong các conotoxin là phổ biến và thay đổi; đặc điểm này làm làm tăng tính đa dạng sinh học và khả năng tấn công mục tiêu

Superfamily S cũng chỉ có một họ, tách ra từ Conus geographus, cũng chưa

được biết rõ Họ σ-conotoxin có peptide khá lớn, 41 acid amin, chứa 8 cystein và 4 liên kết disulfid Họ này có đặc điểm hóa học rất khác so với các họ đã nói trên Chúng là antagonist của thụ thể 5HT3, có đáp ứng kích thích kéo theo trong neuron khi serotonin liên kết (5-hydroxytryptamine)

Cuối cùng là superfamily T bao gồm hai họ là τ- và χ-conotoxin Các

peptide thuộc các họ này có 4 cystein và hai liên kết disulfid τ-conotoxin ức chế kênh Ca2+ pre-synap trong khi χ-conotoxin ức chế NET

Các lớp nhỏ hơn của các conopeptid không được xếp vào các superfamily nói trên Chúng hoặc là chỉ chứa một liên kết disulfid hoặc có bản chất tuyến tính không chứa cystein

Bảng 1.1: Superfamily của conotoxin và conopeptide ( Bingham, 2010 )

Super-family

Khung disulfide Họ

Mục tiêu (thụ thể/kênh)

K+

α-Iml ρ-TIA αA-PIVA κA-SIVA

K+

GIIIA Ψ-PIIIE κM-RIIIK

MrVIA δ-TxVIA ω-MVIIA κ-PVIIA γ-PnVIIA

χ

Ca2+

Chất vận chuyển Norepinephrin

e

τ-TxIX χ-MrIA

Contryphans

Vasopressin

Kênh Ca2+

kiểu L

cono-pressin-

Lys-G Am975

O-linked

Conantokins Conorfamide Contulakin

Glutamate(NMDA)

RF amide Neurotensin

Pr1 CNF-Sr2 Contulakin

C parius

C spurius

C geographus

I.2.3 Cơ chế tác động của độc tố ốc cối

Tuyến nọc độc chứa lượng lớn các peptide có tác động chọn lọc lên hệ thần kinh

ngoại biên và trung tâm thần kinh của động vật có xương sống và không có xương sống Các thành phần khác nhau sẽ có tác động riêng biệt lên các ion và các thụ thể

cũng như các nhân tố khóa khác của hệ thống thông tin liên lạc giữa các tế bào

Tuyến nọc độc của ốc cối chứa các peptide ngắn được gọi là conotoxin, mỗi loài ốc cối sản sinh ra một hỗn hợp các peptide độc rất phức tạp, có cấu trúc và tính

dược lý đặc trưng Conotoxin gồm những nhóm sau :

- Conotoxin tác động ức lên kênh natri: µ-, µ0- và δ-conotoxin

- Conotoxin tác động lên kênh canxi: nhóm ω-conotoxin

- Conotoxin tác động lên thụ thể nicotinic acetylcholine:họ α-conotoxin

- Conotoxin tác động lên kênh kali: κ-conotoxin

- Conotoxin tác động lên N-methyl-D-aspartate: họ conantokin

I.2.4 Ứng dụng y học của độc tố ốc cối

Trong vòng 20 năm qua, đã có hơn 2.600 cuộc nghiên cứu được tiến hành nhằm đánh giá một cách chính xác về đóng góp quan trọng của các độc tố chiết xuất

từ loài ốc cối đối với ngành dược và sinh học tế bào Trong khi nghiên cứu chất độc

có thể gây chết người của một loài ốc biển, các nhà khoa học đã phát hiện chất này

có tác dụng giảm đau Hiện nay có trên 1000 chuỗi peptid được định danh và xác định được tính chất ức chế các kênh ion của chúng So với nguồn từ trên 50.000 cho đến 100.000 loại peptide trong độc tố ốc cối, đây mới chỉ là một con số nhỏ bé Hiện nay người ta đã phát hiện ra các kênh nhạy cảm với điện thế được xếp thành sáu nhóm theo các tính chất điện sinh lý và tính chất dược học, được ký hiệu

là L-, N-, P-, Q-, T-, và R- (type) Kênh canxi loại N bao gồm 5 tiểu đơn vị, trong

đó, tiểu đơn vị α2-δ có ái lực mạnh với các độc tố, ví dụ ω-conotoxin MVIIA Độc

tố ω-conotoxin MVIIA đi vào cơ thể sẽ liên kết với tiểu đơn vị α2-δ, làm thay đổi

cấu hình của tiểu đơn vị này, dẫn tới kìm hãm sự vận chuyển ion canxi qua màng tế bào, sự truyền tín hiệu của các nơron thần kinh bị khóa Khả năng ngăn chặn này rất chính xác, làm cho tín hiệu đau đớn không tới não được mà thần kinh vẫn làm việc bình thường (Becker và Terlau, 2008; Olivera và cs, 1987; Hillyardetal, 1992) Do vậy, các độc tố ốc cối được sử dụng trong điều trị các cơn đau mạn tính, các bệnh thần kinh như Parkinson, bệnh thuộc hệ thần kinh tự động, ung thư, tim mạch và nhiều bệnh khác

Cho đến nay, có 6 peptide độc tố ốc cối đã được thử nghiệm lâm sàng, trong

đó, Prialt (tên thường gọi là Ziconitide), ω-conotoxin MVIIA từ Conus magus, đã

được cấp phép sử dụng trong điều trị các cơn đau bởi Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) vào tháng 12 năm 2004 Ngoài ra, 2 độc tố khác cũng đang được thử nghiệm cận lâm sàng (bảng 1.2) Một loại peptide khác, cũng hoạt

động theo cơ chế như trên, là ω-conotoxin GVIA từ Conus geographus cũng được

ứng dụng rộng rãi trong khoa học thần kinh, với khoảng hơn 2000 nghiên cứu trên giấy tờ, cũng như trong nghiên cứu dược lý học (Terlau H, 2004)

Loại peptid kỵ nước TxVIA tách chiết từ ốc Conus textile là loại

δ-conotoxin đầu tiên được phân lập do tác dụng độc tính lạ thường của nó khi tiêm vào ốc và tôm hùm (Hillyard và cs, 1989) Tác dụng của nó là làm chậm sự bất hoạt kênh natri VGSC của neuron trong các loài nhuyễn thể δ-conotoxin EvIA có tác dụng chọn lọc đối với các kênh Nav 1.2, 1.3 và 1.6 điều này làm cho nó có tác dụng với các neuron của động vật có vú ( Barbier và cs, 2004)

Contulakin-G có khả năng yếu hơn 100 lần so với neurotensin đối với thụ thể neurotensin I, nhưng lại có khả năng làm giảm đau nhiều hơn khoảng 100 lần Do khả năng của nó có thể giảm đau mạnh mẽ và trong một dải rộng contulakin-G (CGX-1160) đã được áp dụng rất sớm bởi công ty Cognetix Inc để giảm đau

Các ứng dụng độc tố ốc cối trong sinh học thần kinh và bào chế thuốc đang gia tăng nhanh chóng, như sản xuất thuốc hỗ trợ trong gây mê, thuốc giảm đau, điều

trị một số bệnh (đau mãn tính, động kinh, tim mạch, rối loạn tâm thần, ung thư, đột quỵ) (Mclntosh 2001)

Bảng 1.2: Các peptide độc tố với những liệu pháp tiềm năng

I.3 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN VỀ ỐC CỐ

I.3.1 Hệ gen cơ quan tử

Hầu hết genome của cơ quan tử, nhưng không phải luôn luôn, có dạng phân

tử DNA mạch vòng đơn của một chuỗi duy nhất Genome của cơ quan tử mã hóa cho một số, không phải tất cả, các protein được tìm thấy trong cơ quan tử Do có nhiều cơ quan tử trong một tế bào, cho nên có nhiều genome của cơ quan tử trên một tế bào Mặc dù bản thân genome của cơ quan tử là duy nhất Nhưng nó cấu tạo gồm một chuỗi lặp lại liên quan với mọi chuỗi không lặp lại của nhân Về nguyên tắc, các gen cơ quan tử được phiên mã và dịch mã bởi các cơ quan tử

I.3.2 Giới thiệu về hệ gen ty thể và hệ gen ribosom

 Hệ gen ty thể (Mitochondrial DNA – mtDNA)

DNA ty thể (mitochondrial DNA-mtDNA) là một genome độc lập, thường là mạch vòng, được định vị trong ty thể Bộ gen ty thể có cấu tạo xoắn kép, trần, mạch vòng với 2 chức năng chủ yếu:

- Mã hóa nhiều thành phần của ty thể

- Mã hóa cho một số protein tham gia vào chuổi chuyền điện tử

DNA ty thể của tế bào động vật mã hóa đặc trưng cho 13 protein, 2 rRNA và

22 tRNA DNA ty thể của nấm men Sacharomyces cerevisiae dài hơn mtDNA của

tế bào động vật năm lần do sự có mặt của các đoạn intron dài

Các genome ty thể có kích thước tổng số rất khác nhau, các tế bào động vật có kích thước genome nhỏ (khoảng 16,5 kb ở động vật có vú) (hình 1.15) Có khoảng một vài trăm ty thể trên một tế bào Mỗi ty thể có nhiều bản sao DNA Số lượng tổng số của DNA ty thể so với DNA nhân là rất nhỏ (<1%)

Hình 1.15: DNA ty thể người, bao gồm 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng

mã hóa protein Mũi tên chỉ các vùng gen đang được sử dụng trong nghiên cứu

Trong nấm men Sacharomyces cerevisiae, genome ty thể có kích thước khá lớn

(khoảng 80 kb) và khác nhau tùy thuộc vào từng chủng Có khoảng 22 ty thể trên

một tế bào, tương ứng khoảng 4 genome trên một cơ quan tử Ở những tế bào sinh trưởng, tỷ lệ mtDNA có thể cao hơn (khoảng 18%)

Kích thước của genome ty thể ở các loài thực vật là rất khác nhau, tối thiểu khoảng 100 kb Kích thước lớn của genome đã gây khó khăn cho việc phân lập nguyên vẹn DNA, nhưng bản đồ cắt hạn chế (restriction map) trong một vài loài thực vật đã cho thấy genome ty thể thường là một chuỗi đơn, được cấu tạo như một mạch vòng Trong mạch vòng này có những chuỗi tương đồng ngắn và sự tái tổ hợp giữa chúng đã sinh ra các phân tử tiểu genome (subgenome) mạch vòng nhỏ hơn, cùng tồn tại với genome “chủ” (master genome) hoàn chỉnh, đã giải thích cho sự phức tạp của các DNA ty thể ở thực vật

Bảng 1.3 tóm tắt sự phân công của các gen trong một số genome ty thể Tổng số gen mã hóa protein là khá ít, và không tương quan với kích thước của genome Ty thể động vật có vú sử dụng các genome 16 kb của chúng để mã hóa cho 13 protein,

trong khi đó ty thể nấm men S cerevisiae dùng các genome từ 60 - 80 kb mã hóa

cho khoảng 8 protein Thực vật với genome ty thể lớn hơn nhiều mã hóa cho nhiều protein hơn Các intron được tìm thấy trong hầu hết các genome của ty thể, nhưng lại không có trong các genome rất nhỏ của động vật có vú

Hai rRNA chính luôn được mã hóa bởi genome ty thể Số lượng các tRNA được mã hóa bởi genome ty thể dao động từ không cho đến đầy đủ (25-26 trong ty thể) Nhiều protein ribosome được mã hóa trong genome ty thể của thực vật và sinh vật nguyên sinh, nhưng chỉ có một ít hoặc không có trong genome của nấm và động vật

Ty thể di truyền theo dòng mẹ Hệ gen ty thể có số lượng gen ít hơn hệ gen nhân, không có hiện tượng trao đổi chéo, các thay đổi chủ yếu do đột biến nên dựa vào tốc độ thay đổi nucleotide có thể xác định thời gian tiến hóa, xác lập đồng hồ phân tử

Bảng 1.3: Các genome ty thể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và

tRNA

 Hệ gen ribosom (Ribosomal DNA – rDNA)

Ribosomal DNA (rDNA) bao gồm một trình tự lặp lại song song của một phân đoạn đơn vị, một operon, bao gồm các NTS, ETS (External transcribed Space), vùng gen 18S, ITS1 (Internal Transcribed Space 1), vùng gen 5.8S, ITS2 (Internal Transcribed Space 2) và vùng gen 28S

Hình 1.16: Cấu trúc hệ gen ribosome Mũi tên chỉ vùng gen sử dụng trong

nghiên cứu hiện tại

Các cụm gen DNA ribosome: Một tế bào có nhân điển hình đang phát triển

có chứa khoảng 10 Mio ribosome, là bộ máy di động để sản xuất protein (bản dịch của mRNA thành protein) RNA ribosome là thành phần cấu trúc cơ bản của ribosome 10 Mio bản sao của từng loại phân tử RNA ribosome (5S, 5.8S, 18S, 28S rRNA) phải được tổng hợp trong mỗi thế hệ để đáp ứng các yêu cầu tế bào để tổng hợp protein Để sản xuất đủ số lượng RNA ribosome có chứa nhiều bản sao của gen

mã hóa cho RNA ribosome (rRNA gen = rDNA) Nhân tế bào có chứa khoảng 200

bản sao của gen rRNA mỗi bộ gen đơn bội, lan ra các cụm nhỏ trên nhiễm sắc thể khác nhau năm (nhiễm sắc thể 13, 14, 15, 21, 22), trong khi các tế bào của ếch

Xenopus laevis chứa khoảng 600 bản sao của gen rRNA trong một cụm trên một

nhiễm sắc thể Tuy nhiên, mô hình chung của các tổ chức gen rRNA và tổng hợp rRNA là giống hệt nhau trong tất cả các sinh vật nhân chuẩn Các bản sao của gen rRNA bảo tồn trên một nhiễm sắc thể được nằm trong một loạtsắp xếp lặp lại, trong

đó mỗi gen được tách ra từ các khu vực kế tiếp được gọi là đoạn chèn DNA, mà thay đổi theo chiều dài và trình tự giữa các loài Một nhóm duy nhất bao gồm các gen rRNA cho 18S, 5.8S, và 28S rRNA phân tử mà được phân cách bởi các đoạn chèn bên trong (ITS-1 và ITS-2) cụm lân cận có chiều dài khoảng 10.000 nucleotide từng được ngăn cách bởi các vùng đệm bên ngoài (ETS)

Các gen rRNA được phiên mã bởi RNA polymerase I, và mỗi bộ gen tạo ra cùng một bản sao RNA, được gọi là 45 rRNA tiền rRNA (pre-rRNA) Trước khi rời khỏi tập hợp các hạt nhân trong ribosome, các tiền 45-rRNA bị cắt bỏ một bản sao của rRNA 28S (khoảng 5000 nucleotide), các rRNA 18S (khoảng 2000 nucleotide),

và rRNA các 5.8S (khoảng 160 nucleotide ) của ribosome cuối cùng Các bộ phận còn lại của từng phiên mã sơ cấp (ETS, ITS-1 và ITS-2) được lọai bỏ Cùng với khoảng 200 protein khác nhau của tế bào và rRNA 5S bắt nguồn từ một quỹ tích nhiễm sắc thể, các rRNA mới tổng hợp được đóng gói để tạo ra các ribosome, quá trình này diễn ra trong nhân của tế bào, trong một cấu trúc lớn khuếch tán, được gọi

là nucleolus

Các phân tử rRNA là rất cần thiết cho hệ ribosome, tổng hợp protein, và chức năng tế bào Vì vậy, gen ribosome thuộc về các gen được bảo tồn nhất trong các tế bào có nhân điển hình Tuy nhiên, sự tương đồng trong các vùng đệm bên trong (ITS-1 và ITS-2) là rất thấp, vì các khu vực này DNA không đóng góp vào quá trình tổng hợp protein Vì vậy, ít áp lực chọn lọc và sự khác biệt trình tự DNA (đột biến điểm), thậm chí giữa các loài của một giống, có thể được tìm thấy trong các khu vực này Do các tính năng này dữ liệu phân tử rDNA là rất hữu ích để xác

định mối quan hệ phát sinh loài (cây phả hệ) hoặc phân loại giữa các loài có mối quan hệ gần gũi

1.3.3 Tình hình nghiên cứu di truyền ốc cối

 Sử dụng chỉ thị DNA ty thể trong phân loại và xây dựng hệ thống phát sinh loài của ốc cối

Việc phân tích mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài dựa trên các đặc điểm hình thái giải phẫu (mà chủ yếu là kích thước, màu sắc, hoa văn vỏ, cấu tạo tuyến độc tố, cấu trúc răng kitin, …) đôi khi mang lại kết quả không chính xác, đặc biệt là đối với các loài có quan hệ gần gũi vì chúng có nhiều đặc điểm hình thái giải phẫu giống nhau Vì vậy, việc sử dụng các chỉ thị phân tử để định danh loài và xác định một cách chính xác quan hệ phát sinh chủng loại loài là điều rất cần thiết Việc xây dựng cây phát sinh chủng loại có thể dựa trên phân tích trình tự một gen hoặc một họ gen Tuy nhiên, dữ liệu phân tích cũng có thể mở rộng hơn, chẳng hạn kết hợp nhiều gen hoặc nhiều vùng DNA khác nhau

Với những loài có quan hệ gần, các gen hay vùng DNA có độ linh động cao (như intron, các vùng liên gen - đoạn chèn) thường hay được sử dụng Song với các loài có quan hệ xa thì các gen hay vùng DNA có độ bảo thủ cao như gen mã hóa các rRNA hay một protein ty thể hoặc nhân thường được sử dụng Để tăng độ tin cậy, các nghiên cứu hiện nay thường sử dụng kết hợp cả hai (vùng DNA có độ bảo thủ với vùng DNA có độ biến thiên cao) Hơn thế nữa, các chỉ thị ty thể cũng thường được sử dụng kết hợp với các chỉ thị nhân Đối với các động vật thân mềm, DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan hệ loài Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b, cytochrome oxydase, tRNA, và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và cs, 2008; Michael và Robert, 2005) Tuy nhiên, sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể sẽ giúp nâng cao độ phân giải và ý nghĩa thống kê so với việc sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ Gen 16S rRNA mang đặc điểm cấu trúc cơ bản, có mặt ở

khắp nơi và có đặc tính tiến hóa, bởi vậy nó trở thành marker phổ biến nhất trong sinh học phân tử

Bandyopadhyay và cs (2008) khi phân tích trình tự bộ gen DNA ty thể của

C textile đã phát hiện đoạn chèn (intergenic) giữa gen coxI/coxII của C textile lớn

hơn (165bp), nghiên cứu đã chứng minh đoạn chèn giữa gen này rất hữu dụng trong các nghiên cứu về tiến hóa, cũng như định danh loài

 Nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa

Đối với lớp chân bụng Gastropoda, DNA ty thể đã được chứng minh là công

cụ hữu hiệu trong phân tích đa dạng loài (Grande và cs, 2008) Các marker chuẩn của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa cytochrome b, 12S rRNA, 16S rRNA, tRNA-Val, và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP Việc sử dụng toàn bộ trình tự DNA ty thể cũng nâng cao độ phân giải và độ tin cậy thống kê so với sử dụng từng đoạn gen riêng lẻ

Tuy nhiên, cho tới nay, mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài thuộc giống ốc cối vẫn chưa được giải quyết một cách triệt để do các marker phân tử của DNA ty thể tỏ ra ít tin cậy khi được áp dụng để xác định vị trí phân loại của các loài mới tách ra (Espiritu và cs, 2002; Duda và cs, 2001; Duda và Kohn, 2005) Vì vậy, trong các nghiên cứu tiến hóa gần đây, các marker DNA ty thể thường được sử dụng kết hợp với các marker nhân có tốc độ tiến hóa thấp hơn và trong một số trường hợp cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Duda & Palumbi, 1999; Cunha

và cs, 2005; Duda và Kohn, 2005; Bandyopadhyay và cs, 2008; Nam và cs, 2009) Một số marker nhân đã được khảo sát bao gồm các vùng gen mã hóa 18S rRNA, 28S rRNA, EF1-α, Histone H3, calmodulin,…và vùng không mã hóa như đoạn chèn ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2)

Các marker phân tử cũng được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu sự tiến hóa

và mối quan hệ loài của độc tố ốc cối Espiritu và cs (2001) nghiên cứu sự đa dạng của độc tố δ-conotoxin trên 9 loài ốc cối Kết quả cho thấy độc tố của các loài trên

phân thành những nhóm chuyên biệt (distinct clade): nhóm 5 loài ốc ở khu vực biển

Ấn Độ Dương sử dụng thức ăn là cá (Clade 1), nhóm 2 loài ốc ăn nhuyễn thể (Clade 5) và nhóm 2 loài ốc ăn cá ngoài khu vực biển Ấn Độ Dương (Clade 3)

Duda và Kohn (2005) khảo sát giả thuyết về sự phát sinh loài dựa trên trình

tự của DNA ti thể (16S) và gen calnodulin của DNA bộ gen của 138 loài ốc cối ở vùng biển Ấn Độ Dương, Tây Thái Bình Dương và Đại Tây Dương Kết quả chỉ ra rằng các loài ốc cối là con cháu từ 2 dòng chính và phân hóa ít nhất cách đây 33 triệu năm Dựa trên sự phân bố địa lý, 1 nhóm bắt nguồn từ vùng biển Ấn Độ Dương và nhóm kia thuộc khu vực Đông Thái Bình Dương và Tây Đại Tây Dương Duda và cs (2001) tiến hành nghiên cứu nguồn gốc của chế độ ăn của ốc cối dựa trên các marker phân tử 16S, calmodulin và sự kết hợp của 2 gen trên Kết quả

từ cây tiến hóa cho thấy chế độ ăn giun biển (errant polychaetes) là phương thức ăn

cổ xưa nhất Sự chuyên hóa trong chế độ ăn dựa trên các loài nhuyễn thể khác cũng như sự chuyển chế độ ăn trên các họ giun biển khác nhau như Terebellidae, Nereidae, và Amphinomidae, được tiến hóa riêng biệt và có lẽ chỉ 1 lần, trong khi

đó chuyên hóa trên chế độ ăn các loài cá có thể xuất hiện 2 đến 3 lần Sự khác biệt trình tự gen cho thấy sự phân hóa chế độ ăn của ốc cối xuất hiện ở kỷ Miocene và tồn tại cho đến ngày nay

Nam và cs (2008) đề xuất việc sử dụng marker bộ gen (nuclear marker), đoạn chèn giữa gen N02 (đoạn giữa của 5,8S và 28S) của DNA ribosome - Internal Transcribed Spacer 2 (ITS2) Với 1 số đặc tính được ghi nhận (là đoạn không mã hóa nên ít chịu áp lực của quá trình tiến hóa, chứa tần suất lớn các indel), trình tự của ITS 2 rất hữu hiệu trong việc xác định vị trí phân loại ở mức độ loài Các tác giả

đã sử dụng 26 trình tự của ITS2 để xác định mối quan hệ loài của các loài ốc ăn nhuyễn thể với loài ăn cá và giun biển Kết quả cho thấy trình tự ITS2 rất conserved giữa các cá thể của cùng 1 loài, nhưng lại thể hiện sự đa dạng ở mức độ phù hợp cho việc xác định vi trí phân loại của các loài mới phân hóa Khi đoạn ITS2 được kết hợp với gen CO1 của DNA ti thể và các gen bảo tồn của DNA ribosome (16S và

12S), và với mô hình tiến hóa phù hợp, giá trị tin cậy tăng lên khi xây dựng cây tiến hóa, Có 3 nhánh chính được xác định trong nhóm 12 loài ốc ăn nhuyễn thể, đó là

Conus marmoreus và C bandanus có quan hệ gần gũi với nhánh Cylinder (Montfort, 1810; textile, ammiralis, dalli and gloriamaris) và nhánh Darioconus

(Iredale, 1930, aulicus, crocatus, episcopatus, omaria và furvus)

 Nghiên cứu đinh danh các loài ốc cối và phân biệt các loài cận giống

Hiện nay, phân loại ốc cối chủ yếu dựa vào kích thước vỏ, kiểu, hoa văn và màu sắc hay vân trên vỏ, cụ thể là những đường gờ hay phần lồi trên vỏ (Kohn và

cs, 1999) Bên cạnh đó, mô tả các dải răng chitin cũng được coi là một chỉ tiêu phân loại quan trọng (Frankin và cs, 2007, Duda và cs, 2009) Sự định danh chính xác loài ốc cối và chế độ ăn của ốc cối cũng cần đến các nghiên cứu về mối quan hệ tiến

hóa giữa các loài trong giống Conus (Duda và cs, 2001) Hơn thế nữa, chỉ thị phân

tử DNA ty thể đã được chứng minh là công cụ hữu hiệu trong phân tích mối quan

hệ loài, đa dạng di truyền, định danh phân loại và phân biệt các loài cận giống (Baxter 2003, 2004 Hebert và cs, 2003 a, b; Stoekle 2003)

Duda và cs (2009) phát hiện trình tự DNA ty thể và DNA nhân khác biệt ở

những cá thể loài ốc cối C ebraeus có vùng phân bố rộng ở vùng biển nhiệt đới

Okinawa Các cá thể này không thể phân biệt được bằng hình dạng và kiểu vân trên

vỏ Trên thực tế, kích thước và hình dạng răng kitin, loại mồi trong tự nhiên và khu vực sống thể hiện sự khác biệt đáng kể và có thể phân thành 2 dạng hình thái Cá

thể trưởng thành với kiểu gen và hình thái răng kitin chuẩn của C ebraeus chủ yếu

ăn giun biển, trong khi đó dạng với trình tự DNA chủ yếu săn loại mồi là Sedentary capitellids (giun biển cố định) Răng kitin của dạng khác biệt về trình tự tượng tự

với loài C judaeus vốn được phân biệt với C ebraeus bởi Rudolph Bergh năm

1895 (chỉ dựa vào răng kitin của 1 mẫu vật thu ở Philippine) Nhóm tác giả khẳng

định sự tồn tại của loài C judaeus dựa vào các dẫn liệu hình thái, sinh thái và di

truyền

 Nghiên cứu cấu trúc hệ gen

Bandyopadhyay và cs (2008) tiến hành phân tích trình tự gen DNA ti thể của ốc cối

cho thấy thứ tự gen (gene orders) là tương tự giữa Conus textile và Lophiotoma cerithiformis (loài khác thuộc Conoidean) và Neogastropod Ilyanassa obsoleta (không thuộc tổng họ Conoidea) Tuy nhiên, đoạn chèn (intergenic) giữa gen coxI and coxII của C textile lớn hơn (165 bp) Nghiên cứu đã chứng minh đoạn chèn

giữa gen này rất hữu dụng trong các nghiên cúu về tiến hóa, cũng như định danh

loài

Hình 1.17: Cấu trúc hệ gen ty thể của Conus textile Mũi tên ký hiệu gen CO1

và 16S

Hệ gen ty thể của Conus textile là một phân tử DNA dạng vòng, có chiều dài

15562 nucleotide, mã hóa cho: 13 protein ty thể [3 cytochrome oxidase (các gen

coxI, coxII, coxIII); cytochrome b (gen cob); tiểu đơn vị 6 và 8 của ATPasegen atp6

và atp8); các tiểu đơn vị từ 1-6 và tiểu đơn vị 4L của NADH dehydrogenase (các gen nad1-nad6 và nad4L)]; 2 rRNA; 22 tRNA [D, V, L (1), L (2), P, S (1), S (2), H,

F, K, A, R, N, I, M, Y, C, W, H, G, E và T] (Bandyopadhyay và cs, 2008)