Nghiên cứu tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của lectin chiết từ lá tỏi (Allium sativum L.)

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra trong lá tỏi có chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học, trong đó bao gồm lectin [19], [41].. Vì vậy, để tạo tiền đề quan trọng và thuận lợi bước đầu cho việc ng

:TS LÊ ĐÌNH HÙNG

NHA TRANG, 06/2014

LỜI CAM ĐOAN Sinh viên: Nguyễn Thị Ngọc Trinh

Nơi đào tạo: Trường Đại học Nha Trang

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Hướng dẫn 1: ThS Bùi Trần Nữ Thanh Việt

Hướng dẫn 2: TS Lê Đình Hùng

Tên đồ án tốt nghiệp:

“Nghiên cứu các tính chất hóa lý và đặc tính sinh học của Lectin chiết từ

lá tỏi (Allium sativum L.)”

Nội dung cam đoan:

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ bảo của thầy cô hướng dẫn và giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ sinh học biển- Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang- Viện khoa học và công nghệ Việt Nam Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Nha Trang, ngày 01 tháng 06 năm 2014

Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Trinh

LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp, tôi đã gặp không ít khó khăn, trở ngại nhưng nhờ sự giúp đỡ và hướng dẫn của Thầy cô, sự động viên và chia sẻ của gia đình và bạn bè tôi đã vượt qua những khó khăn, trở ngại và hoàn thành nhiệm

vụ nghiên cứu của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại Học Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức trong 4 năm học tập Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu đồ án mà còn là hành trang quý báu để tôi bước vào đời một cách vững chắc và tự tin

Cảm ơn các anh chị tại Phòng Công nghệ sinh học biển- Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang- Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đồ án

Đặc biệt cảm ơn cô Bùi Trần Nữ Thanh Việt và TS Lê Đình Hùng vì sự giúp

đỡ và dìu dắt tận tình của thầy cô trong suốt quá trình tôi thực hiện đồ án

Trong quá trình nghiên cứu, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo đồ

án tốt nghiệp, do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên Nguyễn Thị Ngọc Trinh

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

BSA : albumin huyết thanh bò

BVTV : bảo vệ thực vật

Cmin : nồng độ nhỏ nhất của đường (mM) hoặc glycoprotein

(µg/ml) mà tại đó hiện tượng NKHC do lectin gây ra bị

ức chế hoàn toàn

HA : hoạt độ ngưng kết hồng cầu

HI : giá trị nồng độ pha loãng mà tại đó hoạt độ NKHC vẫn

còn bị ức chế, sau khi lectin đã liên kết với đường hoặc glycoprotein

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1: Phân loại khoa học 4

Bảng 1.2: Giá trị dinh dưỡng 100 g tỏi tươi 4

Bảng 2.1: Các thiết bị, dụng cụ chính được sử dụng trong thí nghiệm 25

Bảng 2.2: Khảo sát khả năng liên kết cacbohydrate của lectin với một số loại đường và glycoprotein 41

Bảng 2.3: Các vi khuẩn dùng trong thí nghiệm khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin từ lá tỏi 43

Bảng 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến MAC, HĐTS và HĐR của lectin .44

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến MAC, HĐTS và HĐR của lectin 47

Bảng 3.3: Ảnh hưởng nồng độ % amonium sunfate (NH4)2SO4 đến MAC, HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin ở dịch tủa 49

Bảng 3.4: Kết quả thu nhận chế phẩm lectin kỹ thuật từ lá tỏi (Allium sativum L.) 55 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi 60

Bảng 3.6: Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi 62

Bảng 3.7: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng một số vi khuẩn của lectin từ lá tỏi .65

Bảng PL.1: Kết quả đo OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) 76

Bảng PL.2: Anova_ Kết quả đo OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) 76

Bảng PL.3: Giá trị mật độ quang OD tương ứng với nồng độ BSA (µg/ml) 77

Bảng PL.4: Kết quả đo OD tương ứng với tỷ lệ chiết khác nhau 78

Bảng PL.5: Anova_ Kết quả đo OD tương ứng với tỷ lệ chiết khác nhau 78

Bảng PL.6: Hàm lượng protein tổng số tương ứng với tỷ lệ chiết khác nhau 79

Bảng PL.7: Kết quả đo OD tương ứng với thời gian chiết khác nhau 79

Bảng PL.8: Anova_ Kết quả đo OD tương ứng với thời gian chiết khác nhau 79

Bảng PL.9: Hàm lượng protein tổng số tương ứng với thời gian chiết khác nhau 80

Bảng PL.10: Kết quả đo OD của dịch tủa tương ứng với nồng độ amonium sunfate

khác nhau 80

Bảng PL.11: Anova_ Kết quả đo OD của dịch tủa tương ứng với amonium sunfate khác nhau 81

Bảng PL.12: Hàm lượng protein tổng số của dịch tủa tương ứng với nồng độ amonium sunfate khác nhau 81

Bảng PL.13: Kết quả đo OD của dịch trong tương ứng với nồng độ amonium sunfate khác nhau 82

Bảng PL.14: Anova_ Kết quả đo OD của dịch trong tương ứng với nồng độ amonium sunfate khác nhau 82

Bảng PL.15: Hàm lượng protein tổng số của dịch trong tương ứng với nồng độ amonium sunfate khác nhau 83

Bảng PL.16: Hoạt độ NKHC và hàm lượng protein tổng số của dịch trong tương ứng với nồng độ amonium sunfate khác nhau 83

Bảng PL.17: Kết quả đo OD tương ứng với các mẫu 84

Bảng PL.18: Hàm lượng protein tổng số tương ứng với các mẫu 84

Bảng PL.19: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi 85

Bảng PL.20: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi 85

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1: Củ tỏi ta 6

Hình 1.2: Hoa và lá tỏi ta 6

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình dự kiến thu nhận lectin từ lá tỏi 26

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của DC từ lá tỏi 29

Hình 2.3: Sơ đồ quy trình xác định ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hoạt độ NKHC của DC từ lá tỏi .31

Hình 2.4: Sơ đồ quy trình xác định ảnh hưởng của nồng độ % amonium sunfate (NH4)2SO4 đến hoạt độ NKHC và hiệu suất thu hồi lectin từ DC lá tỏi .33

Hình 2.5: Sơ đồ quy trình thu nhận lectin từ lá tỏi để xác định tính chất hóa lý và sinh học của nó 35

Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 45

Hình 3.2: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HĐTS và HĐR của lectin 47

Hình 3.3: Ảnh hưởng của nồng độ % amonium sunfate (NH4)2SO4 đến HĐR và hiệu suất thu hồi của lectin ở dịch tủa 50

Hình 3.4: Ảnh hưởng của nồng độ % amonium sunfate (NH4)2SO4 đến hàm lượng protein tổng số và hoạt độ NKHC của lectin ở dịch trong 50

Hình 3.5: Sơ đồ quy trình công nghệ thu nhận chế phẩm lectin kỹ thuật từ lá tỏi 53

Hình 3.6: Hoạt độ NKHC của chế phẩm lectin kỹ thuật từ lá tỏi 56

Hình 3.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi 57

Hình 3.8: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi 59

Hình 3.9: Khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi 63

Hình 3.10: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng một số vi khuẩn của lectin từ lá tỏi 66

Hình PL: Đường chuẩn protein theo phương pháp của Lowry (1951) 77

MỤC LỤC

Trang

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

MỤC LỤC vii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về tỏi 3

1.1.1 Tên gọi và lịch sử 3

1.1.2 Phân loại và thành phần trong tỏi 4

1.1.2.1 Phân loại 4

1.1.2.2 Thành phần trong tỏi 4

1.1.3 Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh trưởng của cây tỏi ta 5

1.1.3.1 Đặc điểm hình thái 5

1.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng 7

1.1.4 Một số công dụng của tỏi 7

1.1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ tỏi 8

1.2 Tổng quan về lectin 9

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin 9

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới 12

1.2.3 Cấu tạo của lectin 14

1.2.4 Một số tính chất hóa lý và sinh học của lectin 15

1.2.5 Ứng dụng của lectin 17

1.3 Lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) 18

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ lá tỏi trong và ngoài nước 18

1.3.2 Cấu tạo của lectin từ lá tỏi 19

1.3.3 Ứng dụng của lectin từ lá tỏi 20

1.4 Các phương pháp thu nhận lectin 20

1.4.1Các kỹ thuật chiết xuất lectin 20

1.4.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin 21

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 24

2.2.1 Vật liệu 24

2.2.2 Hóa chất 24

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu 25

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) 26

2.3.1.1 Quy trình dự kiến thu nhận lectin từ lá tỏi 26

2.3.1.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của dịch chiết (DC) từ lá tỏi (TN1) 28

2.3.1.3 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hoạt độ NKHC của DC từ lá tỏi (TN2) 30

2.3.1.4 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ % (NH4)2SO4 đến hoạt độ NKHC và hiệu suất thu hồi lectin từ DC lá tỏi (TN3) 32

2.3.2 Thí nghiệm nghiên cứu tính chất hóa lý (ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, ion kim loại và khả năng liên kết cacbohydrate) và đặc tính sinh học (khả năng kháng khuẩn) của lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) (TN4) 34

2.3.3 Phương pháp phân tích 37

2.3.3.1 Xác định hoạt độ lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu (NKHC) 37

2.3.3.2 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry (1951) 39

2.3.3.3 Phương pháp khảo sát khả năng liên kết cacbohydrate của lectin 41

2.3.3.4 Phương pháp khảo sát khả năng kháng khuẩn của lectin 42

2.2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 43

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Các điều kiện để thu nhận lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) 44

3.1.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của dịch chiết (DC) lectin từ lá tỏi 44

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hoạt độ NKHC của DC lectin từ lá tỏi 46

3.1.3 Xác định nồng độ % amonium sunfate (NH4)2SO4 đến hoạt độ NKHC và hiệu suất thu hồi lectin từ DC lá tỏi 49

3.1.4 Đề xuất quy trình thu nhận chế phẩm lectin kỹ thuật từ lá tỏi (Allium sativum L.) 52

3.2 Xác định tính chất hóa lý và sinh học của lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.)57 3.2.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi 57

3.2.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi 59

3.2.3 Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt độ NKHC của lectin từ lá tỏi 60

3.2.4 Khả năng liên kết cacbohydrate của lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) 61

3.3.5 Khả năng kháng khuẩn của lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) 65

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 76

Vì vậy, để giảm thiểu tác động xấu của thuốc BVTV đến môi trường và cộng đồng, xu hướng sử dụng các chế phẩm có nguồn gốc sinh học thay thế dần các thuốc hóa học đang ngày càng phát triển, chẳng hạn như thuốc BVTV có nguồn gốc thảo mộc (Botanical hoặc Plant Pesticides) với công nghệ điều chế đơn giản, không độc, dễ sử dụng, giá thành phù hợp và thân thiện với môi trường sinh thái Trong số

đó phải kể đến cây tỏi (Allium Sativum L.), nó là một trong những thảo mộc có tác

dụng tốt với rất nhiều công dụng

Trong cây tỏi thì lá tỏi được xem như là phế liệu, vào mùa thu hoạch chúng

bị loại bỏ với sản lượng lớn Ở Việt Nam, tỏi được trồng phổ biến trong cả nước, tập trung chủ yếu ở các tỉnh, thành Hải Dương, Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Quảng Ngãi

và Ninh Thuận với tổng diện tích khoảng 6.000 ha, nên lượng phế liệu thải ra vào mùa thu hoạch có thể gây ô nhiễm môi trường Như vậy, nếu có thể tận dụng nguồn phế liệu này để tạo ra chế phẩm lectin sẽ góp phần tăng giá trị kinh tế cho cây tỏi, bảo vệ môi trường vừa thu được chế phẩm có nguồn gốc sinh học, giá thành thích hợp, tính cạnh tranh cao với thuốc BVTV hóa học Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra trong

lá tỏi có chứa nhiều chất có hoạt tính sinh học, trong đó bao gồm lectin [19], [41]

Lectin là những glycoprotein hoặc protein có khả năng làm ngưng kết hồng cầu, liên kết với carbohydrate và không có nguồn gốc miễn dịch Chúng giữ vai trò quan trọng như là một phân tử nhận dạng trong sự tương tác giữa chất nền với tế

bào hoặc tế bào với tế bào, vì chúng có thể phân biệt sự khác nhau trong cấu trúc cũng như khả năng liên kết với cacbohydrate trên bề mặt tế bào [50] Những đặc tính này làm cho lectin trở thành công cụ hữu ích cho các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: nghiên cứu miễn dịch, hóa sinh, sinh học tế bào, Theo các nghiên cứu

đã được công bố, lectin từ lá tỏi chủ yếu được ứng dụng trong lĩnh vực BVTV thông qua phương pháp cấy chuyển gen

Vì vậy, để tạo tiền đề quan trọng và thuận lợi bước đầu cho việc nghiên cứu cũng như ứng dụng lectin từ lá tỏi không chỉ trong lĩnh vực nông nghiệp mà còn trong nhiều lĩnh vực khác, tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tính chất

hóa lý và đặc tính sinh học của Lectin chiết từ lá tỏi (Allium Sativum L.)”

2 Mục đích, đối tượng & phạm vi nghiên cứu và ý nghĩa của đề tài

 Mục đích nghiên cứu:

- Xác định điều kiện tối ưu để thu nhận lectin từ lá tỏi (Allium Sativum L.)

- Xác định tính chất hóa lý, đặc tính sinh học của lectin chiết từ lá tỏi (Allium

Sativum L.) để định hướng khả năng ứng dụng lectin này trong các lĩnh vực khác

nhau

 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu:

- Nguyên liệu lá tỏi (Allium Sativum L.)

- Nghiên cứu được thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

 Ý nghĩa khoa học của đề tài

- Là cơ sở cho việc áp dụng nghiên cứu tách chiết lectin từ các phế liệu thực vật một lá mầm

- Cung cấp những thông số khoa học về tính chất hóa lý và đặc tính sinh học

của lectin chiết từ lá tỏi (Allium Sativum L.)

 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Xây dựng quy trình chiết tách và xác định tính chất hóa lý, đặc tính sinh

học của lectin từ lá tỏi (Allium Sativum L.), từ đó có thể thu nhận lectin ở quy mô

lớn hơn để đưa vào ứng dụng thực tế và đề xuất các hướng ứng dụng khác nhau

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về tỏi

1.1.1 Tên gọi và lịch sử

Tên Việt Nam: Tỏi

Tên gọi khác: Tỏi ta, Hồ (vị thuốc), Đại toán (vị thuốc)

Tên tiếng Anh: Garlic, (Leek- chỉ các loại tỏi khác)

Tên khoa học: Allium sativum L hoặc Allium sativum

Cây tỏi (Allium sativum L.) là một loài trong chi Hành tây (Allium) có nguồn

gốc ở Trung Á và sau đó lây lan sang Trung Quốc, Cận Đông, và khu vực Địa Trung Hải trước khi chuyển về phía tây đến Trung và Nam Âu, Bắc Phi (Ai Cập) và Mexico [51] Lịch sử sử dụng trên 7000 năm và đã được sử dụng cho mục đích ẩm thực và làm thuốc

Tỏi đã được sử dụng hàng ngàn năm cho mục đích y tế Tài liệu tiếng Phạn cho thấy tỏi được sử dụng làm thuốc khoảng 5000 năm trước và nó đã được sử dụng

ít nhất 3000 năm trong y học Trung Quốc Người Ai Cập, Babylon, Hy Lạp và La

Mã sử dụng tỏi cho các mục đích chữa bệnh Năm 1858, Pasteur chú ý đến hoạt tính kháng khuẩn của tỏi, và nó đã được sử dụng như một chất khử trùng để ngăn chặn hoại tử trong Thế chiến I và Thế chiến II [53]

Ngày nay, tỏi vừa là cây rau gia vị quan trọng ở khu vực Địa Trung Hải, cũng như một gia vị thường xuyên ở Châu Á, Châu Phi, và Châu Âu, vừa là đối tượng nghiên cứu đầy tiềm năng

1.1.2 Phân loại và thành phần trong tỏi

1.1.2.1 Phân loại

Bảng 1.1: Phân loại khoa học

Họ (familia): Hành (Alliaceae) Phân họ (subfamilia): Hành (Allioideae) Tông (tribus): Hành (Allieae) Chi (genus): Hành tây (Allium) Loài (species): Tỏi- Allium sativum Trong loài Allium sativum, có hai phân loài (giống): -Tỏi ta: Allium sativum var sativum

-Tỏi tây: Allium sativum var ophioscorodon

1.1.2.2 Thành phần trong tỏi

Theo phân tích của Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ [57] Bảng 1.2: Giá trị dinh dưỡng 100 g tỏi tươi

Tỏi tươi Giá trị dinh dưỡng 100 g

Nguồn: Cơ sở dữ liệu USDA [57]

1.1.3 Đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh trưởng của cây tỏi ta

1.1.3.1 Đặc điểm hình thái [2]

Tỏi là loài cây thân thảo, có căn hành (thân rễ)

- Thân: Thân thật là chồi mọc đầu tiên (tép tỏi), thân khi sinh có hình trụ tròn vươn cao, mang phát hoa Thân thật phía dưới mang nhiều rễ phụ, bẹ lá và chồi (tép tỏi) hình thành thân giả, phần bẹ lá và chồi bó thành khối tạo nên củ (giả) Củ tỏi có nhiều tép Từng tép tỏi cũng như cả củ tỏi đều có lớp vỏ mỏng bảo vệ

- Hoa: Tỏi có hoa mọc thành cụm trên đầu một trục hình trụ từ than củ kéo dài ra Cụm hoa là một tán giả hình cầu, màu trắng, đỏ hoặc xanh nhạt Hoa xếp thành tán ở ngọn thân trên một cán hoa dài 55cm hay hơn Bao hoa màu trắng hay hồng bao bởi một cái mo dễ rụng tận cùng thành mũi nhọn dài Hoa lưỡng tính, thụ phấn nhờ côn trùng Hoa nở vào tháng 5-7

Hình 1.2: Hoa và lá tỏi ta

- Quả: Có một hạt, quả ra tháng 9-10

1.1.3.2 Đặc điểm sinh trưởng

Tỏi là các loài thực vật sống lâu năm, phát triển tốt trong vùng ôn đới của Bắc bán cầu Phần lớn các chồi cây trong các loài thuộc chi hành đều gia tăng trưởng bằng cách tạo ra các chồi nhỏ hay "mầm cây" xung quanh chồi già, cũng như bằng cách phát tán hạt Một vài loài có thể tạo ra nhiều củ (quả) nhỏ trong

cụm hình đầu ở gốc lá; tạo ra cụm nhỏ gọi là "mắt hành (tỏi)" (chẳng hạn A

cepa nhóm Proliferum) Các mắt này có thể phát triển thành cây và thường được thu

hoạch vào cuối đông, đầu xuân

1.1.4 Một số công dụng của tỏi [56]

- Lá và cụm hoa tỏi dùng làm rau

Ở Châu Âu và Trung Đông lá và cụm hoa của cây tỏi đôi khi được dùng làm rau để ăn sống hay xào nấu, có hương vị như hành, ít cay nồng so với củ tỏi

- Củ tỏi được dùng làm rau gia vị

Củ tỏi là loại rau gia vị được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới do hương vị cay nồng đặc trưng của nó như là một chất khử mùi tanh và kích thích tiêu hóa

- Tỏi được dùng làm thuốc

+ Theo Đông y

Củ tỏi có vị cay, tính ôn, hơi độc, vào hai kinh Can, Vị, có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát khuẩn, thông khiếu, giải phong, sát trùng, chữa khí hư, tiểu tiện khó, bụng trướng đầy, tiêu nhọt, đờm và hạch ở phổi, tẩy uế, kiết lỵ, trị giun móc, giun kim, phòng trị cảm cúm

Tỏi giúp phục hồi, alycin, một hợp chất tự nhiên trong cơ thể có tác dụng chống ung thư, giảm cholesterol, giảm huyết áp, có khả năng giết 60 loại nấm độc, đồng thời làm phát triển 20 loại vi khuẩn có ích đối với phụ nữ mãn kinh Mỗi ngày

ăn 1-2 nhánh tỏi rất tốt cho sức khỏe

+ Theo Tây y

Tỏi có tác dụng kháng sinh, kháng khuẩn, kháng virus, diệt ký sinh trùng và nguyên sinh động vật, phòng chống các bệnh tim mạch, giảm đường huyết, tăng

cường hệ miễn dịch, phòng tránh các rối loạn tiêu hoá, rối loạn cơ quan và một số tác động y học khác như xua đuổi và diệt côn trùng,

Ngoài ra tỏi còn có hiệu lực trên tế bào ung thư Những nghiên cứu của Trung Quốc và Ý cho biết tỏi có nhiều hoạt chất có thể ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại khối u ung thư [23] Theo các nhà khoa học trường Đại học Pensylvania khả năng ngăn chận khối u ung thư của tỏi liên quan đến các hợp chất S-allyl cysteine, diallyl disulfide và diallyl trisulfide [12] Một hoạt chất khác ít được nhắc đến trong tỏi là ajoene Ajoene cũng có tác dụng làm giảm độ dính của máu Ngoài

ra, tỏi còn có hàm lượng khoáng chất selenium, một chất chống oxy hoá mạnh làm tăng khả năng bảo vệ màng tế bào, phòng chống ung thư và bệnh tim mạch của tỏi

- Các sản phẩm hóa học từ tỏi

+ Ở Trung Quốc dùng dịch ép của tỏi làm chất kết dính trong vá thủy tinh và

đồ sứ Chế phẩm thân thiện với môi trường này được chấp thuận cho sử dụng trong liên minh Châu Âu

+ Tinh dầu tỏi được chế thành thuốc BVTV để xua đuổi ruồi đục quả, thuốc diệt tuyến trùng, thuốc diệt ve bét trên vật nuôi và thuốc trừ sâu ở một số nước như

Mỹ, Anh, [43]

1.1.5 Tình hình sản xuất và tiêu thụ tỏi

Cây tỏi được trồng trên toàn cầu, nhưng Trung Quốc là nhà sản xuất tỏi lớn nhất thế giới với khoảng 13,5 triệu tấn củ tỏi hàng năm, chiếm hơn 80% sản lượng tỏi thế giới Các nước trồng nhiều tỏi khác là Ấn Độ (4,1%), Hàn Quốc (2%), Ai Cập và Nga (1,6%)…[54]

Trong cây tỏi, lá và cụm hoa chỉ được tiêu thụ ở một số nước Châu Âu và Trung Đông Củ tỏi được dùng phổ biến ở các khu vực: Đông Á, Nam Á, Đông Nam Á, Trung Đông, Bắc Phi, miền nam Châu Âu, Nam và Trung Mỹ

- Ở Hàn Quốc, sản phẩm của tỏi được lên men ở nhiệt độ cao được gọi là tỏi đen (syrupy), sản phẩm này hiện đang được bán tại Hoa Kỳ, Vương quốc Anh và Úc

- Ở Đông Âu củ tỏi tươi được ngâm trong hỗn hợp đường, muối và gia vị trong 3-6 tuần như một món dưa chua dùng làm món ăn khai vị

- Ở Ý tỏi là gia vị trong món thịt để làm nhân cho nhiều loại bánh mì nướng

và trong các món ăn truyền thống

Tại Việt Nam, tỏi thường được trồng tại các tỉnh phía Bắc và Duyên hải miền Trung Theo Hiệp hội rau hoa quả Việt Nam, hàng năm tổng sản lượng tỏi xuất khẩu của cả nước khoảng 2000 tấn/năm, chủ yếu từ các vùng trồng tỏi nổi tiếng là

Lý Sơn - Quảng Ngãi, Ninh Hải - Ninh Thuận, Hải Dương, Vĩnh Phúc và Bắc Ninh 1.2 Tổng quan về lectin

1.2.1 Lịch sử nghiên cứu lectin

Cho đến những năm cuối thế kỷ 19, đã bắt đầu có sự tích lũy những bằng chứng đầu tiên về sự hiện diện của một loại protein có khả năng ngưng kết hồng cầu Tuy nhiên, hầu hết các nghiên cứu lúc bấy giờ chủ yếu chỉ tập trung vào việc làm sáng tỏ nguyên lý gây độc của các loại hạt có chứa thành phần gây độc này nhằm sử dụng cho các mục đích y tế Năm 1884 Warden và Waddel đã giải thích

nguyên lý gây độc của các hạt Abrus precatorius, cho đến năm 1887 thì Dixson đã xác định được một dich lỏng có độc tố, được tách chiết từ hạt thầu dầu Ricinus

precatorius là một protein Những protein như vậy được đề cập dưới tên gọi là

hemagglutinin hay agglutinin thực vật, vì ban đầu chúng được tìm thấy ở mẫu chiết

từ thực vật Tuy nhiên, tất cả các nhà khoa học sau này đều cho rằng những mô tả đầu tiên và đầy đủ nhất về hemagglutinin là từ luận văn tiến sĩ của Peter Hermann Stillmark thực hiện tại trường Dorpat (nay là trường Tartu, Estonia) vào năm 1888

Chất hemagglutinin được Stillmark tách chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus

communis và được đặt tên là ricin, một độc tố mà sau đó được xác định là có bản

chất protein [34]

Kể từ đó quá trình nghiên cứu Lectin được chia làm 3 giai đoạn chính:

- Giai đoạn đầu từ cuối thế kỷ 19 đến nửa đầu thế kỷ 20: đây là giai đoạn mang tính điều tra cơ bản về Lectin trong sinh giới Ngoài công trình nghiên cứu của Stillmark vào năm 1888 thì cũng tại trường đại học Tartu, Hellin cũng đã tách

được một độc tố khác có nguồn gốc từ thực vật, đó là dịch chiết từ hạt của cây

Abrus precatororius, nó có khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu người và được đặt

tên là abrin, ngoài ra, đã có một số nghiên cứu chuyển sang đối tượng là các loài động vật… Trong suốt những năm sau đó, các hợp chất có tính chất đặc biệt có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và một số loài động vật được phát hiện ngày một nhiều trong giới sinh vật từ Virus đến con người [46]

- Tiếp đến, trong những năm 1950 đến năm 1970: năm 1954, Boyd đã sử dụng thuật ngữ “Lectin” (thuật ngữ Lectin bắt nguồn từ chữ “Lectus”, dạng quá khứ của dộng từ “Legre”, trong tiếng Latin có nghĩa là “lựa chọn”) để chỉ nhóm các chất gây ngưng kết thực vật có khả năng ngưng kết đặc hiệu nhóm máu [55], đây có thể được coi là khái niệm đầu tiên về lectin

- Trong hai thập kỷ này, bên cạnh các công trình mang tính điều tra về sự hiện diện của lectin trong sinh giới, phần lớn các nhà khoa học đã tập trung vào việc tinh chế lectin để nghiên cứu cấu trúc và ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến hoạt tính của lectin, trên cơ sở đó tìm cách sử dụng lectin nhằm phục vụ cho đời sống con người

- Từ năm 1970 đến nay: giai đoạn này, tiến độ nghiên cứu lectin được đẩy nhanh Nhiều kết quả thú vị đã được công bố như việc tìm thấy lectin ở nấm nhầy (Lucas và Klimpel – 1976) và ở cơ thể người ( Gillian và cộng sự -1980) [26], [40]

Năm 1980, Goldstein và các cộng sự đã đưa ra định nghĩa “Lectin là những protein hoặc glycoprotein có khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu” [27] Khái niệm này đồng nhất với định nghĩa về Lectin mà Houston và Dooley đã đưa ra năm 1982: “Lectin là protein tương tác đặc hiệu đường, đặc tính cơ bản của nó là khả năng gây ngưng kết tế bào hồng cầu”

Năm 1991, Balzarini J đã phát hiện ra Lectin của một số loài thuộc họ thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ lan (Orchidaceae) có tác đụng kìm hãm sự phát triển của virus HIV [14]

Năm 1995, Peuman và Van Dame đã đưa ra một số khái niệm mới về cấu trúc liên quan đến tính chất của Lectin: “Lectin là protein mà cấu trúc phân tử có

chứa ít nhất một vị trí liên kết đặc hiệu đường” [44] Dựa vào cấu trúc phân tử và biểu hiện hoạt tính sinh học, Peuman và cộng sự đã chia Lectin thành 3 loại:

 Merolectin có khối lượng phân tử tương đối nhỏ và chỉ có một trung tâm liên kết đường, do đó không có đặc tính ngưng kết tế bào và không gây kết tủa các hợp chất liên kết đường Thuộc về loại này là một số protein của các cây

họ lan (Orchidaceae)

 Hololectin có chứa ít nhất hai trung tâm liên kết với đường, do đó có khả năng gây ngưng kết tế bào và gây kết tủa, do tương tác với nhiều hợp chất cộng đường Đó chính là các Lectin quen thuộc đã được nghiên cứu nhiều nhất và dễ được phát hiện bởi khả năng gây ngưng kết tế bào của chúng và thường được gọi là hemagglutinin

 Chimerolectin là những phân tử trong đó có ít nhất một vị trí liên kết với đường và có một vùng chức năng sinh học khác (có thể là chức năng xúc tác sinh học) Thuộc về loại này là protein kìm hãm riboxom typ 2 (RIP, Type 2)

có trong hạt thầu dầu (Ricinus Communis L.) hoặc hạt cây cam thảo dây (Abrus precatorius L.)

Song song với các hướng nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học vẫn đi sâu vào tìm hiểu cấu trúc cũng như tính chất của các Lectin, để sử dụng chúng một cách thiết thực và có hiệu quả hơn Hiện nay các nhà khoa học cũng đã hiểu biết khá nhiều về bản chất của Lectin Khoa học hiện đại đã đưa ra một định nghĩa mới nhất

về Lectin như sau: “Lectin là glycoprotein hoặc protein không có nguồn gốc miễn dịch, có khả năng liên kết thuận nghịch, phi hóa trị với carbohydrate mà không làm thay đổi cấu trúc của carbohydrate được liên kết Lectin gắn kết với những tế bào có glycoprotein hoặc glycolipit bề mặt Sự hiện diện của hai hay nhiều vị trí gắn kết đối với mỗi phân tử Lectin cho phép nó gắn kết nhiều loại tế bào và phản ứng gắn kết với hồng cầu được sử dụng rất rộng rãi để kiểm tra sự hiện diện của lectin trong dịch chiết từ các sinh vật khác nhau” [58]

1.2.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới

 Sự phân bố của lectin trong giới thực vật

Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộng trong các cơ quan như thân, lá và hạt Trong đó, các cây họ Đậu có số lượng loài lớn nhất có chứa lectin, ngoài ra còn có một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ (Minosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa lectin [14]

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [7] Lectin

từ họ Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài cây khác như Chay (Artocarpus

tonkinensis), Sake chi Artocarpus (Artocarpus incisa L.) đều chứa lectin có hoạt

tính NKHC rất cao [1], [4], [45]

Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của lectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y (Lichenes) và Rong (Algae) Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là của Boyd và cộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico, Mỹ; từ đó đến nay đã có hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin từ rong biển ở nhiều quốc gia khác nhau như: Anh, Nhật Bản, Brazil, Hàn Quốc, Việt Nam…[52]

Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật vẫn chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật [8]

 Sự phân bố của lectin trong giới động vật

Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm Lectin trong

giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ (Limulus

polyphemus) Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và các loài động vật

ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra Ở Việt Nam, khi khảo sát 30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang – Khánh Hòa xuất hiện 10 loài chứa lectin [8]

Trong khi đó, ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được điều tra cơ bản Một số loài thuộc lớp Cá xương (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia), lớp Bò sát (Reptila), lớp chim (Aves) và lớp thú (Mammalia) cũng có chứa lectin Ngoài ra, còn có một số dạng lecin khác từ huyết tương cá chình

(Aguilla rastiata) hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)… Một số kết quả nghiên

cứu khá thú vị, là ở mô người như mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng chứa lectin Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin Đó cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [16]

 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật

Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện vào năm 1942, khi Hirst và cộng

sự đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [28] Sau này, một số công trình khoa học cũng đã phát hiện lectin ở một số loài virus khác

Trên đối tượng vi khuẩn E.coli, Ofek và Beachey (1987) đã cho biết: trên bề

mặt của tế bào vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào [42] Hoạt tính này mất đi khi có mặt một số loại đường như galactoza và dẫn xuất amin của nó Đó chính là lectin bề mặt màng tế bào vi khuẩn và dạng lectin này cũng được phát hiện ở một số loài vi khuẩn khác

 Sự định khu của lectin trong tế bào và cơ thể sinh vật

Nghiên cứu sự xuất hiện của lectin đã cho thấy, trong một cơ thể, lectin có thể có ở bộ phận, cơ quan này nhưng lại không có ở bộ phận, cơ quan khác Hàm lượng lectin cũng biến đổi trong quá trình sinh trưởng và phát triển của sinh vật

Ở thực vật, sự định khu của lectin khá rộng: ở lá, hoa, thân và đặc biệt là hạt Hầu hết các loài thực vật hạt kín, hạt thường chứa nhiều lectin nhất

Trong cơ thể động vật, lectin có trong huyết thanh ở một số mô và cơ quan đặc biệt là mô cơ Ngoài ra, còn có ở giao tử hoặc tế bào trứng

Ở mức độ tế bào, sự định khu của lectin cũng đã được phát hiện Một số công trình đã khẳng định lectin có trong nguyên sinh chất và một số bào quan của tế bào

Gần đây cũng đã chứng minh sự tồn tại của lectin ở trong nhân tế bào ở một số loài

bò sát và động vật có vú [2]

1.2.3 Cấu tạo của lectin

 Khối lượng phân tử của lectin

Bằng các phương pháp xác định khối lượng phân tử như: phương pháp điện

di trên gel polyacrylamide, phương pháp siêu âm và phương pháp quang phổ khối ion hóa phun điện tử (electron spray ionization- mas spectrometry) khối lượng phân

tử của khá nhiều dạng lectin đã được xác định

Và cho đến nay thì có khá nhiều công bố về khối lượng phân tử của lectin và

đã cho thấy chúng thay đổi khối lượng phân tử trong biên độ khá rộng, từ vài kDa

(lectin của rễ cây gai Uricaceae: 8,5 kDa) đến vài trăm kDa (lectin của sam biển Châu Á Tachypleus tridentatus: 700 kDa) Khối lượng phân tử của lectin không

mang tính đặc trưng cho loài hay cá thể và cũng không phụ thuộc vào mức độ tiến hóa của loài hay cá thể đó [8]

 Cấu tạo phân tử của lectin

Khi nghiên cứu trình tự axit amin trong phân tử lectin, các nhà khoa học đã nhận thấy: trình tự axit amin trong phân tử lectin phản ánh mối quan hệ trong quá trình tiến hóa Trên cơ sở của nhiều dẫn liệu khoa học về cấu trúc bậc nhất của các phân tử lectin, Lis và Sharon (1986) cho rằng: các loài càng có quan hệ họ hàng càng gần gũi thì cấu trúc bậc nhất của phân tử lectin càng giống nhau nhiều hơn [39] Có thể đây là một dấu hiệu để phân loại sinh vật ở mức độ phân tử

Bất kỳ một dạng lectin nào dù có cấu trúc bậc I hay cấu trúc không gian phức tạp đều chứa trung tâm hoạt động Đó là trung tâm liên kết carbohydrate Chính trung tâm này quyết định hoạt tính của lectin Nếu như ở enzyme, trung tâm hoạt động của chúng là các gốc axit min hoặc phần phi protein thì ở hầu hết các lectin trung tâm hoạt động của chúng là do một số gốc axit amin như tyrosin, serin, threonin, tryptophan… có khả năng liên kết mạnh với các gốc đường tạo nên Các dạng lectin khác nhau thì có thành phần axit amin trong trung tâm hoạt động của lectin vẫn còn rất phức tạp [18], [29]

Về cơ chế hoạt động của lectin, các nhà khoa học đều thống nhất là: “Các trung tâm hoạt động của các phân tử lectin đều có khả năng liên kết các gốc đường trong các thụ thể tiếp nhận (receptor) trên bề mặt tế bào Các liên kết sẽ được hình thành giữa các receptor trên bề mặt màng tế bào với trung tâm hoạt động của lectin Nhờ các liên kết này mà lectin đã kết dính các tế bào, tạo nên hiện tượng ngưng kết

tế bào Các dạng lectin khác nhau, khả năng liên kết với các receptor trên bề mặt tế bào cũng khác nhau Giống như enzyme, trung tâm hoạt động của lectin chỉ hoạt động khi nó nằm trong một cấu trúc hoàn chỉnh của phân tử Bất kỳ một tác nhân nào phá vỡ cấu trúc phân tử lectin cũng đều làm giảm hoặc mất khả năng hoạt động của trung tâm này Chính vì vậy, hoạt độ của lectin phụ thuộc chặt chẽ vào một số tác nhân lý hóa của môi trường” [8]

1.2.4 Một số tính chất hóa lý và sinh học của lectin

 Sự tương tác của lectin với các loại đường và dẫn xuất của nó

Phương pháp xác định sự tương tác giữa đường và lectin đang được sử dụng hiện nay là xác định hoạt độ NKHC (ngưng kết hồng cầu) của lectin khi có mặt một loại đường nào đó Trường hợp hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn chứng tỏ đường đã kìm hãm hoạt tính lectin Ngược lại, hoạt độ lectin vẫn ổn định chứng tỏ đường không ức chế

Có thể nói rằng cơ chế của sự tương tác với đường của lectin vẫn còn khá phức tạp Mặt dù vậy, đặc tính này có ý nghĩa cực kỳ quan trọng trong các nghiên cứu lectin Với các lectin tương tác đặc hiệu với một loại glycoprotein nào đó thì có thể sử dụng lectin này để nghiên cứu sâu cấu trúc màng tế bào có mặt glycoprotein

đó Một số nhà khoa học cũng đã sử dụng lectin tương tác đặc hiệu với glycoprotein

để xác định kháng nguyên trên bề mặt tế bào hồng cầu Gần đây, dựa vào các loại

đường ức chế đặc hiệu hoạt độ lectin mà người ta đã sử dụng chúng để tinh chế nhiều loại lectin bằng sắc ký ái lực và hơn nữa người ta cũng sử dụng cột ái lực lectin để tinh chế và nghiên cứu nhiều loại glycoprotein có chức năng sinh học [31]

 Khả năng ngưng kết tế bào

Loại tế bào dễ bị lectin làm ngưng kết là các tế bào hồng cầu của động vật

và người [4], [30] Đây là dấu hiệu đặc trưng nhất để nhận biết lectin Số lượng lectin có khả năng ngưng kết hồng cầu chỉ duy nhất của một nhóm máu là rất ít vì chúng đồng thời có thể gây ngưng kết với nhiều loại hồng cầu như: thỏ, cừu, dê, gà hay ngựa… Theo Sharon và Lis (2003), lectin không những gây ngưng kết tế bào hồng cầu người và động vật mà còn có khả năng ngưng kết tế bào của vi sinh vật và một số dạng tế bào khác như: tế bào giao tử, tế bào khối u, tế bào ung thư hay các tế bào phôi… [50]

 Ảnh hưởng của một số nhân tố đến hoạt độ của lectin

 Ảnh hưởng của pH

Các nghiên cứu về điểm đẳng điện của lectin cho thấy: tại điểm đẳng điện (pHi) hoạt độ lectin là nhỏ nhất Tại đó, lectin dễ bị kết tủa pH ngoài điểm đẳng điện, lectin ở trạng thái phân ly tích điện, dễ hòa tan và có hoạt độ Mỗi dạng lectin thường có pH thích hợp với hoạt độ của nó, đó là giá trị pH mà ở đó hoạt độ lectin mạnh nhất hoặc duy trì ở trạng thái ổn định Ở pH vùng axit và kiềm mạnh, hoạt độ lectin giảm hoặc mất hoàn toàn

 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Lectin có bản chất là protein hoặc glycoprotein nên nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt độ của chúng Hầu hết các lectin đều bị mất hoạt độ ở nhiệt độ cao Ở nhiệt

độ cao, protein lectin bị biến tính không thuận nghịch Hiện tượng sốc nhiệt cũng có thể làm mất hoạt độ lectin

 Ảnh hưởng của một số nhân tố khác

Enzyme có khả năng làm tăng hoạt độ lectin Trong nhiều thí nghiệm, các hồng cầu được xử lý bằng các enzyme như trypsin, chimotrypsin, papain… thì chúng dễ bị lectin làm ngưng kết Sở dĩ có hiện tượng này là vì khi hồng cầu xử lý

với enzyme thì chính enzyme đã giới hạn một số protein trên bề mặt tế bào hồng cầu, làm phơi ra các nhóm carbohydrate của nó, vì vậy lectin dễ dàng gắn kết vào màng tế bào hồng cầu hơn, dễ dẫn đến hoạt độ lectin tăng lên

1.2.5 Ứng dụng của lectin

Lectin đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống Một số lĩnh vực tiêu biểu có thể được tóm tắt như sau:

 Lectin trong huyết học

Sử dụng lectin để phân loại nhóm máu là ứng dụng sớm nhất và đến nay vẫn còn được áp dụng rộng rãi Phương pháp xác định nhóm máu bằng lectin cho kết quả nhanh, chính xác mà không cần dùng huyết thanh mẫu Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi lectin phải tinh khiết và có tính đặc hiệu cao

 Lectin trong tế bào học

Lectin được sử dụng như một công cụ hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc màng

tế bào và những biến đổi trên bề mặt tế bào trong quá trình biệt hóa bệnh lý thông qua sự thay đổi thành phần carbohydrate trên bề mặt tế bào

 Lectin trong BVTV và ngũ cốc

Lectin có khả năng kháng lại nhiều loại sâu bọ và côn trùng có hại cho cây trồng vì chúng có khả năng liên kết với glycoprotein đường ruột và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tự chết [49]

 Lectin trong y học

Lectin có tiềm năng rất lớn trong lĩnh vực này Lectin được sử dụng như một công cụ chuẩn đoán có hiệu quả Dựa vào khả năng phân biệt và ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật, lectin được sử dụng kết hợp với các xét nghiệm thông thường khác để nâng cao giá trị chuẩn đoán và điều trị bệnh trên sinh vật biển Một

số lectin có khả năng liên kết đặc hiệu với glycoprotein dạng high manose N-glycan

ở nồng độ rất thấp, đây là những glycoprotein có mặt chủ yếu trên bề mặt của tế bào HIV, do đó có thể kìm hãm hiện tượng nhiễm HIV và hạn chế khả năng mắc bệnh [31]

Như vậy có thể thấy, lectin đã và đang được nghiên cứu để sử dụng trong chuẩn đoán các bệnh truyền nhiễm và rối loại trao đổi chất, trong nghiên cứu sinh học và miễn dịch, làm mitogen trong nuối cấy tế bào với mục đích chữa bệnh, tăng năng suất trong trồng trọt, chăn nuôi và bảo quản lương thực [8]

 Lectin trong virus học

Lectin được xem là một nguồn sản phẩm tự nhiên phong phú, có khả năng kháng virus mạnh mẽ Không giống với phần lớn các liệu pháp điều trị kháng virus hiện tại, những lectin có khả năng hoạt động qua sự ức chế chu kỳ sống của virus, ngăn chặn sự xâm nhập vào tế bào vật chủ của virus Thêm vào đó, những lectin này thường chịu được nhiệt độ cao, pH thấp, không có mùi, có khả năng liên kết với nhiều loại glycoprotein trên bề mặt lớp vỏ của virus

1.3 Lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.)

1.3.1 Tình hình nghiên cứu lectin từ lá tỏi trong và ngoài nước

 Tình hình nghiên cứu lectin từ lá tỏi ở Việt Nam

Việc nghiên cứu lectin trong nước đã được triển khai từ hơn 30 năm nay Hầu hết các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu theo ba hướng chính: điều tra sự phân bố của lectin; tinh chế và nghiên cứu đặc tính, cấu trúc của lectin; nghiên cứu ứng dụng của lectin Mặc dù thời gian nghiên cứu chưa dài nhưng cũng đã có được những thành công nhất định Tuy nhiên, đối với lectin từ thực vật một lá mầm, cụ

thể là lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) thì cho đến nay vẫn chưa có một công bố

nào cho biết đã tiến hành nghiên cứu với đối tượng này

 Tình hình nghiên cứu lectin từ lá tỏi trên thế giới

Letin từ tỏi (Allium sativum L.) nói chung hay lectin từ lá tỏi nói riêng đã

được các nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng trong một vài lĩnh vực Lectin từ củ tỏi thì được nghiên cứu nhiều hơn so với lectin từ lá tỏi

Năm 1997, Koen và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu tách, đặc tính

nhân bản và phân tử của lectin đặc hiệu manose từ lá và rễ của tỏi (Allium sativum

L.) [37] Sau đó vài tháng, Smeets, Damme và Peumans đã cho thấy được lectin lá

tỏi được tổng hợp đặc biệt trong lá non và vẫn tồn tại cho đến khi héo khi nghiên cứu quá trình phát triển của lectin và alliinase tổng hợp trong củ và lá tỏi [38]

Năm 2001, Santanu và cộng sự đã công bố letin từ tỏi (Allium sativum L.)

được tìm thấy có ảnh hưởng bất lợi đến sự phát triển và tồn tại của rệp và

Dysdercus cingulatus [49]

Năm 2005, báo cáo đầu tiên cho thấy sức đề kháng bền vững trong cây mù

tạt Ấn Độ (Brassica juncea) biến đổi gen lectin từ lá tỏi chống lại rệp (Erysimi

Lipaphis) được công bố [32]

Năm 2007, Amin Sadeghi và cộng sự cũng đã nghiên cứu biểu hiện của

lectin lá tỏi (Allium sativum L.) dưới sự kiểm soát của chất hoạt hóa vỏ cây Arabidopsis thaliana bảo vệ cây thuốc lá chống lại rệp vừng (Myzus nicotianae) đã

cho kết quả: thực vật chuyển gen lectin từ lá tỏi đã có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh sản của rệp trưởng thành, với mức giảm lên đến 40% Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu Amin Sadeghi và cộng sự nhận thấy lectin từ lá tỏi là một protein kháng virus mạnh [10]

Những kết quả đạt được này cho thấy rằng, lectin từ lá tỏi (Allium sativum

L.) là một nguồn nguyên liệu hữu ích trong để ứng dụng trong lĩnh vực nông

nghiệp

1.3.2 Cấu tạo của lectin từ lá tỏi

Theo nghiên cứu của Koen và các cộng sự (1997), lectin được phân lập từ lá tỏi là một dimer của hai tiểu đơn vị giống hệt nhau của 12 kDa cDNA nhân bản của lectin lá và rễ cũng cho thấy trình tự amino acid của chúng hầu như giống hệt nhau

Vì cả hai lectin có chuỗi N-đầu cuối giống hệt các tiểu đơn vị lectin I từ rễ tỏi, nghĩa

là các lectin gốc có chuỗi bổ sung tại C- đầu cuối Những kết quả này không chỉ chứng minh rằng tiền chất polypeptide hầu như giống hệt nhau, chỉ được xử lý khác nhau tại C- đầu cuối trong rễ và lá, mà còn cho thấy sự khác biệt về hoạt tính sinh học [37]

Ngoài ra, khi nguyên cứu về hiệu quả của của một loại protein diệt côn trùng

mới, lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.), chống lại côn trùng homopteran trong thuốc

lá biến đổi gen đã nhận thấy lectin này có khố lượng phân tử 25 kDa và tồn tại ở dạng đơn phân [33]

1.3.3 Ứng dụng của lectin từ lá tỏi

Lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.) chủ yếu được ứng dụng để kháng lại một

vài loại côn trùng bằng cách chuyển cấy gen lectin lá tỏi vào các giống cây trồng

Vì lectin từ lá tỏi được nhận thấy có khả năng tồn tại ngay trong đường ruột của côn trùng và có khả năng liên kết với glycoprotein đường ruột và phá vỡ cơ chế tự phục hồi của enzyme đường ruột dẫn đến côn trùng tự chết [32], [37], [49]

1.4 Các phương pháp thu nhận lectin

1.4.1 Các kỹ thuật chiết xuất lectin

Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiết xuất lectin ra khỏi các mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể thực hiện

dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể

sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau như dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%; CaCl2 0,1 M; dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl, ethanol…[11], [25]

 Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính

Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thể được hòa tan trở lại Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị

I, anion đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2SO4… Các protein khác nhau được kết tủa ở những nồng độ bão hòa khác nhau Người ta sử dụng phương pháp này trong các quy trình chiết xuất lectin để cô đặc dung dịch protein cần tách

Độ hòa tan của protein trong các dung môi khác nhau phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước (sự phân bố các gốc có tính ưa nước kỵ nước trên bề mặt phân tử protein)

Bản chất của kết tủa protein bằng muối là tạo tủa protein nhờ bổ sung vào dung dịch protein muối trung hòa ở nồng độ cao

Kết tủa protein bằng muối phụ thuộc vào nhiều nhân tố như: nhiệt độ, nồng

độ protein, pH và loại muối sử dụng

Các loại muối trung tính thường sử dụng là muối citrate, phophate, sunfate

và cloride tác dụng tủa protein của các ion hóa trị I có thể sắp xếp theo thứ tự sau:

NH4+ > K+ > Na+

 Kết tủa phân đoạn bằng dung môi

Một số dung môi hữu cơ có thể dễ hòa tan trong nước như axetone, polyetylenglycol, ethanol… làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng có thể bị kết tủa nhanh chóng Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất dễ gây biến tính protein, vì vậy việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp

 Thẩm tích

Phương pháp thẩm tích được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán thấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phần tử lớn hơn kích thước màng Trong phương pháp này, màng bán thấm ở dạng túi chứa chất cần thẩm tích đặt trong môi trường có pH nhất định, các phân tử nhỏ trong túi sẽ khuếch tán ra môi trường ngoài nhờ tác động của máy khuấy từ Thẩm tích thường dùng để loại muối và những chất phân tử nhỏ không phải protein ra khỏi dung dịch chưa lectin cần thẩm tích

1.4.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin

 Sắc ký lọc gel

Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thước phân tử Nhựa thường được sử dụng là Sephadex Mỗi hạt Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp Có nhiều loại Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗ xốp khác nhau Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất có kích thước phân tử khác nhau Để tinh chiết lectin, người ta thường dùng loại Sephadex G-75 và Sephadex G-100

Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân tử của chất cần tách

 Sắc ký trao đổi ion

Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích Tùy thuộc vào

pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm Lợi dụng tính chất này người ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như: DEAE-sephadex, DEAE-xeluloza, DEAE-trisacryl… được sử dụng làm chất trao đổi cation Mỗi chất trao đổi ion đều có khả năng trao đổi một lượng ion nhất định gọi là dung lượng trao đổi Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định

 Sắc ký ái lực

Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là phối tử (ligand) được gắn vào một chất mang tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký Chất mang được sử dụng nhiều nhất là một số loại gel: Sephadex, Sepharose, Sephacryl…

Quá trình thực hiện sắc ký ái lực được tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1

là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực

- Giai đoạn 1: thiết kế cột ái lực lectin: việc lựa chọn chất kết hợp có ái lực đặc hiệu với protein cần tách có ý nghĩa rất quan trọng Vì vậy, cần phảu dựa vào tính chất của protein cần tách, đặc tính lý hóa của chất kết hợp và đặc biệt là khả năng liên kết đặc hiệu giữa protein và chất kết hợp Trong các thí nghiệm tinh chế lectin người ta thường lựa chọn các chất đường, glycoprotein hoặc chất cộng hợp đường có ái lực hóa học với một lectin nhất định

- Giai đoạn 2: hấp phụ lectin vào cột và loại bỏ các chất không có ái lực với cột: các protein có ái lực với cột cần được tạo điều kiện tốt cho quá trình hấp phụ (pH, nhiệt độ, quá trình hấp phụ nhiều lần), ở giai đoạn này các protein không có ái lực với ligand và các protein hay lectin thừa sẽ bị đẩy ra khỏi cột

- Giai đoạn 3: giải hay phản hấp phụ lectin ra khỏi cột: cần phải dung một dung dịch giải hấp phụ có ái lực thích hợp để phản hấp phụ lectin ra khỏi cột

Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy…

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: Tỏi (Allium sativum L ) thu ở xã Vạn Hưng, huyện Vạn Ninh, tỉnh Khánh Hòa vào ngày 24/02/2014

Địa điểm nghiên cứu: Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang- Tp Nha Trang- tỉnh Khánh Hòa; Trung tâm thực hành thí nghiệm trường ĐH Nha Trang

Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 1/3/2014 đến tháng 6/6/2014

2.2 Vật liệu, hóa chất và thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

2.2.1 Vật liệu

Trong nghiên cứu này, vật liệu dùng để tiến hành thí nghiệm là lá cây tỏi

(Allium sativum L ) Tỏi được thu mua nguyên cây, tại phòng thí nghiệm được cắt riêng từng bộ phận củ, lá, rễ Lá cây tỏi ta được cho vào các túi nilong (kích thước

25 x 35 cm), cho vào tủ đông -200C để bảo quản

Hồng cầu của máu thỏ lấy từ Viện Vaccine – Nha Trang, được cung cấp hàng tuần

Chủng vi sinh vật được cung cấp từ bộ sưu tập của phòng Công nghệ sinh học biển -Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang

2.2.2 Hóa chất

- Các loại đường chuẩn và glycoprptein: D- glucose, D- mannose, Transferrin, fetuin, Yeast mannan, Bovine thyroglobulin, Porcine stomach mucin: mua từ Merck- Đức

- Na2HPO4.12H2O, NAH2PO4.2H2O, NaCl, Na2CO3, NaOH, sodium citrat, CUSO4.5H2O, (NH4)2SO4, acitic acid, acetat natri, HCl, NaHCO3, EDTA: mua của Trung Quốc

- BSA, Enzym trypsin: Signa – Aldrich, Mỹ

- Yeast Extract Powder (dịch chiết nấm men), Peptone: mua của Himedia,

Ấn Độ; K2HPO4, MgSO4: mua của Merck- Đức; Agar mua từ Việt Nam

2.2.3 Thiết bị, dụng cụ nghiên cứu

Bảng 2.1: Các thiết bị, dụng cụ chính được sử dụng trong thí nghiệm

STT Thiết bị, dụng cụ Model máy, vật

liệu, dung tích Xuất sứ

1

Máy đo quang Microplate

- Khay Elisa 96 giếng mã số

G655061 (40 chiếc/ thùng)

- 1 bộ máy vi tính và máy in,

Gen 5 ELISA

5 Máy khuấy hình đĩa siêu phẳng

Nha

12 Khay 96 giếng đáy chữ V Polystyrene Greiner- Đức

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ lá tỏi (Allium sativum L.)

2.3.1.1 Quy trình dự kiến thu nhận lectin từ lá tỏi

a Sơ đồ quy trình dự kiến

Hình 2.1: Sơ đồ quy trình dự kiến thu nhận lectin từ lá tỏi

b Giải thích quy trình

Cân m (g) lá tỏi đã cắt nhỏ, xay nhuyễn Tiến hành ngâm chiết theo các thông số thích hợp, rồi lọc loại bã Tiếp theo, quá trình tủa lectin được tiến hành bằng amonium sunfate, sau đó ly tâm thu tủa Phần tủa được hòa tan đến một thể

Chế phẩm lectin

kỹ thuật

Loại tủa Hòa tan kết tủa

Ly tâm

Thẩm tích

Ly tâm

tích nhất định trước khi thẩm tích bằng dung dịch đệm phoshate (PBS 0,02M; 0,85% NaCl), để loại bỏ amonium sunfate còn dư Cuối cùng dịch tủa sau thẩm tích được ly tâm để thu phần dịch trong, đây chính là chế phẩm lectin kỹ thuật

c Xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ lá tỏi

Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong quá trình tách chiết như nồng độ dung môi, tỷ lệ chiết, thời gian chiết,… thì các yếu tố còn lại được cố định Yếu tố nào đã khảo sát thì sẽ được cố định ở giá trị tối ưu để tiếp tục khảo sát đến các yếu tố khác

Các điều kiện được khảo sát trong thí nghiệm này là tỷ lệ chiết và thời gian chiết, không tiến hành khảo sát 2 yếu tố: dung môi chiết và nhiệt độ chiết

Từ nghiên cứu trước đây [10], khi khảo sát dung môi chiết thường tiến hành trên 3 hệ dung môi: nước cất, dung dịch đệm phosphat (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%)

và ethanol n% Kết quả hầu hết cho thấy ethanol n% có HĐTS và HĐR của lectin cao nhưng không chênh lệch nhiều so với dung dịch đệm phosphat Điều này có thể

là do tính tan của lectin, chúng dễ hòa tan trong dung dịch muối, mặt khác sự có mặt của PBS giúp ổn định pH của môi trường, phù hợp với khả năng khuếch tán của lectin Xét về tính kinh tế, việc ngâm chiết bằng dung môi ethanol sẽ tạo chế phẩm

có giá thành cao hơn nhiều so với dung dịch đệm phosphate (bao gồm giai đoạn chiết và thu chế phẩm lectin kỹ thuật bằng tác nhân tủa) Vì mục tiêu sau cùng của nghiên cứu này là đưa chế phẩm lectin ra thị trường tiêu thụ, được sự chấp nhận của người dân, giá thành sản phẩm phải phù hợp và có sức cạnh tranh cao nên việc sử dụng dung dịch đệm phosphat (PBS 0,02 M; NaCl 0,85%) làm dung môi chiết là rất phù hợp

Đối với yếu tố nhiệt độ, khi khảo sát chiết ở nhiệt độ phòng và 40C thì với bản chất protein của lectin sẽ cho kết quả chiết ở 40C bằng hoặc tốt hơn ở nhiệt độ phòng Tuy nhiên, vì cùng một lý do như đã nêu trên, xét về tính thuận tiện và giá thành chế phẩm thì việc chiết ở nhiệt độ phòng lại phù hợp hơn Do đó, nhiệt độ phòng được chọn làm thông số nhiệt độ chiết trong nghiên cứu này

d Xác định nồng độ ammonium sunfate thích hợp để tủa lectin từ DC lá tỏi

Mỗi loại tác nhân tủa thường có khả năng làm kết tủa protein lectin ở những nồng độ khác nhau và có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt độ NKHC sau khi kết tủa Lựa chọn amonium sunfate là tác nhân tủa cho nghiên cứu này vì các lý do sau đây:

+ Không làm hại mà làm bền (ổn định) hầu hết các loại protein

+ Rẻ tiền và phổ biến

+ Độ hòa tan rất lớn ngay ở nhiệt độ thấp (bão hòa 767 g/l ở 25oC)

+ Tính kết tủa lựa chọn của muối amino sunfate cao hơn các loại muối khác + Có thể sử dụng aminoum sunfate ở 2 dạng: bột và dung dịch bão hòa Tiến hành khảo sát khả năng tủa của protein lectin từ DC bằng amonium sunfate ở các nồng độ khác nhau (40- 90%) để cô đặc lectin có trong DC lá tỏi 2.3.1.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của dịch chiết (DC) từ lá tỏi (TN1)

a Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Hình 2.2: Sơ đồ quy trình xác định ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) đến hoạt độ NKHC của DC từ lá tỏi

b Giải thích quy trình

Cân m = 10 (g) lá tỏi (bảo quản đông) đã cắt nhỏ, xay nhuyễn Tiến hành ngâm chiết lectin trên máy lắc với vận tốc 17 vòng/ phút bằng dung dịch đệm phosphate (PBS 0,02 M, 0,85% NaCl) ở nhiệt độ phòng với thời gian chiết là 6 giờ

và tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm (w/v) thay đổi lần lượt là 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9 Sau đó, lọc qua lưới lọc rồi ly tâm với tốc độ 6000 vòng/ phút trong 15 phút để loại

bã, thu DC

Xác định hàm lượng protein tổng số, hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR), nồng độ protein nhỏ nhất gây NKHC (MAC) của từng DC So sánh, chọn ra tỷ lệ nguyên liệu: dung dịch đệm phosphate (w/v) thích hợp

2.3.1.3 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ngâm chiết đến hoạt độ NKHC của DC từ lá tỏi (TN2)

a Sơ đồ bố trí thí nghiệm