thực hành vi sinh vật

- Sử dụng đèn cồn đèn gas Trong phòng thí nghiệm vi sinh thường sử dụng đèn cồn để khử trùng vòng cấy của que cấy, miệng bình, miệng ống nghiệm.. Hướng dẫn chung thực hành vi sinh vật t

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CN THỰC PHẨM

BIÊN SOẠN

TS Nguyễn Minh Trí

ThS Nguyễn Thị Thanh Hải

THỰC HÀNH

VI SINH VẬT

Họ và tên SV:

MSSV:

Lớp:

Nhóm:

NHA TRANG 2012

MỤC LỤC

Trang

Bài 1: MỘT SỐ QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 2

Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT 4

Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 12

Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT 16

Bài 5: CÁC ĐẶC ĐIỂM VỀ SINH HÓA 20

Bài 6: ỨNG DỤNG VI SINH VẬT CÔNG NGHIỆP 24

Bài 7: LẤY MẪU THỰC PHẨM VÀ CHUẨN BỊ MẪU 25

Bài 8: KIỂM TRA SƠ BỘ MẪU THỰC PHẨM BẰNG KÍNH HIỂN VI 26

Bài 9: TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHÍ (APC – AEROBIC PLATE COUNT) 27

Bài 10: XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG COLIFORM VÀ ESCHERICHIA COLI 29

Bài 11: SALMONELLA 33

Bài 12: VIBRIO 34

Bài 13: STAPHYLOCOCCUS AUREUS 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 40

Bài 1: MỘT SỐ QUY ĐỊNH TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

Thực hành Vi sinh vật đại cương nhằm trang bị cho người học một số kỹ năng cơ bản, giúp bước đầu tìm hiểu về thế giới vi sinh vật rộng lớn Phần trình bày ở đây liên quan đến vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Chúng ta sẽ tìm hiểu về cả hai nhóm vi sinh vật có lợi và có hại

Nhằm tránh không gây tạp nhiễm, ảnh hưởng đến thí nghiệm hay không gây phân tán

vi sinh vật ra môi truờng xung quanh, cần thực hiện các thao tác cấy đúng kỹ thuật Việc này liên quan đến việc học các kỹ thuật vô trùng và thực hành phương tiện an toàn phòng thí nghiệm Chúng ta cần phải biết và thực hiện đúng các quy định trong phòng thí nghiệm

Lịch thí nghiệm:

Trước khi đến phòng thí nghiệm, bạn phải biết bài thí nghiệm sắp làm, phải chuẩn bị hiểu bài trước khi đến phòng thí nghiệm

Mỗi buổi thí nghiệm đều bắt đầu bằng phần trình bày và thảo luận các ý chính Do

vậy, điều quan trọng là không đến lớp trễ

THUẬT NGỮ Một số thuật ngữ cần phân biệt:

Vô trùng là 1 quá trình mà tất cả các vi sinh vật sống bị phá huỷ Các vi sinh vật này

bị giết bởi hơi nóng áp lực hay ở nhiệt độ cao trong điều kiện khô, hay đốt thành tro Nếu chúng ta nói một vật vô trùng, chúng ta hiểu rằng vật đó hoàn toàn không có các vi sinh vật sống Nói chung khi nói đến sự vô trùng, ý nói đến sự an toàn phòng thí nghiệm, chủ yếu chúng ta nói đến vô trùng bởi hơi nóng áp lực bằng autoclave Phương pháp khử trùng cơ bản

là đốt cháy các tác nhân khử trùng hoặc đốt thành tro Tất cả các chất thải sinh học phải được đốt cháy kỹ trước khi thải bỏ

Khử trùng là quá trình trong đó các sinh vật không sinh bào tử, sinh dưỡng bị phá

huỷ Các tác nhân gây được quá trình này gọi là chất khử trùng hay chất giết khuẩn Các tác nhân như vậy chỉ được sử dụng cho các vật dụng do chúng độc với mô người và động vật

Nhiễm trùng được xác định khi có sự phát triển (nhân lên) của các vi sinh vật trong

mô của cơ thể Thuật ngữ vô trùng dùng để chỉ bất cứ quá trình nào mà ngăn cản sự xâm

nhập của các tác nhân nhiễm trùng vào mô vô trùng, do vậy ngăn ngừa sự nhiễm trùng Các

kỹ thuật vô trùng chỉ những thao tác mà các nhà vi sinh vật học dùng để loại tất cả các vi sinh vật khỏi môi trường nhiễm hay mô sống tiếp xúc Các chất kháng khuẩn là các hoá

chất (thường là các chất khử khuẩn hoà tan) có thể sử dụng an toàn cho bên ngoài cơ thể nhằm phá huỷ hay ức chế các vi khuẩn sinh dưỡng

CÁC KỸ THUẬT VÔ TRÙNG Khi bắt đầu làm vệc với các canh cấy vi khuẩn trong các bài trình bày ở sau, bạn phải học các kỹ thuật Một số điều cơ bản chúng ta phải tuân theo:

- Rửa tay

Trước khi bắt đầu làm việc ở phòng thí nghiệm bạn phải rửa tay Sử dụng các dung dịch sát khuẩn Lau khô bằng giấy lau Kết thúc công việc, trước khi rời phòng thí nghiệm, chúng ta phải rửa tay bằng xà phòng

- Khử trùng mặt bàn làm việc

Bắt đầu buổi làm việc phải lau bàn bằng chất diệt khuẩn quá trình này nhằm loại bụi bẩn có trên mặt bàn, làm giảm thiểu nguy cơ nhiễm khuẩn các canh cấy mà chúng ta làm việc Kết thúc công việc, trước khi rời phòng thí nghiệm, chúng ta phải tiến hành khử trùng lại để bảo vệ cho người học ở buổi thực hành tiếp theo

- Sử dụng đèn cồn (đèn gas)

Trong phòng thí nghiệm vi sinh thường sử dụng đèn cồn để khử trùng vòng cấy của que cấy, miệng bình, miệng ống nghiệm

Để khử trùng vòng cấy cần đốt cho đến khi nóng đỏ Để không giết chết vi sinh vật

mà chúng ta muốn cấy chuyền, trước khi đưa que cấy vào canh cấy, cần để cho vòng cấy nguội xuống bằng cách giữ vòng cấy ở vùng vô trùng xung quanh ngọn lửa một thời gian

Để an toàn khi sử dụng đèn cồn, cần lưu ý không di chuyển đèn cồn khi đang cháy Không dùng miệng thổi tắt đèn cồn, phải dùng nắp chụp đậy lại

- Pipette

Để chuyển canh cấy bằng pipette phải sử dụng thiết bị hút cơ học, Không sử dụng miệng để hút

- Thải bỏ canh cấy

Các bình, ống nghiệm, hộp lồng nuôi cấy vi sinh vật trước khi thải bỏ, phải được hấp khử trùng (autoclave) để giết chết vi sinh vật

XỬ LÝ KHI LÀM ĐỔ CANH CẤY Tất cả các trường hợp sự cố làm đổ canh cấy vi sinh vật phải báo cáo ngay với giáo viên hướng dẫn Mặc dù đa số các vi sinh vật sử dụng trong các bài thực hành là không gây bệnh, nhưng có một số ít gây bệnh Do vậy, chúng ta phải xử lý tất cả các trường hợp sự cố làm đổ dịch cấy, phòng khi có liên quan đến vi sinh vật gây bệnh Biện pháp xử lý:

- Tất cả áo bảo hộ, vải lau dính dịch cấy phải được đem autoclave

- Dùng giấy, vải thấm dịch sát khuẩn đặt vào vùng canh cấy đổ

- Đổ thuốc sát khuẩn quanh nơi có canh cấy vi sinh, để hạn chế lây lan ra xung quanh

2 Không hút thuốc, ăn uống trong phòng thí nghiệm

3 Không đưa tay lên sờ miệng

4 Dọn dẹp, lau chùi sau khi làm việc Lam kính, lá kính sau nhuộm soi cần rửa, làm khô

và để đúng nơi quy định

5 Các dụng cụ, lọ hoá chất sau khi dùng xong phải để đúng nơi quy định

6 Khi làm việc với các dụng cụ cần cẩn thận, nhất là đối với kính hiển vi Khi không hiểu vận hành như thế nào, bạn phải hỏi người phụ trách

7 Hợp tác, làm việc cùng sinh viên khác trong nhóm, nhưng phải tự mình phân tích kết quả thí nghiệm

Hướng dẫn chung thực hành vi sinh vật thực phẩm

Để có thể làm việc tại phòng thí nghiệm vi sinh vật thực phẩm, chúng ta cần nắm vững một số vấn đề về lý thuyết và thực hành, nói chung có thể chia thành 3 nhóm vấn đề lớn :

 Làm quen với phòng thí nghiệm vi sinh

 Phân lập và định danh vi sinh vật

 Định tính và định lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm

I Làm quen với phòng thí nghiệm vi sinh

Trước khi làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh vật, chúng ta cần tìm hiểu kỹ:

- Nội quy, quy định điều này giúp chúng ta tránh được: (1) làm lây lan vi sinh vật gây bệnh, ảnh hưởng đến sức khỏe của bản thân và mọi người làm việc trong phòng thí nghiệm; (2) Sai lệch thí nghiệm đang tiến hành của bản thân và của người khác

- Bố trí của phòng thí nghiệm: Nơi để của hóa chất, thiết bị dụng cụ tránh phải mất nhiều thời gian trong khi tìm hóa chất dụng cụ, cũng như sử dụng cac thiết bị có tại phòng thí nghiệm và các phòng thí nghiệm liên quan

- Cách sử dụng và bảo quản thiết bị dụng cụ Điều này giúp không làm hư hỏng thiết

bị dụng cụ, thu nhận kết quả thí nghiệm chính xác, giảm được thời gian và chi phí thí nghiệm

II Phân lập và định danh vi sinh vật

Đây là công việc quan trọng của phòng thí nghiệm vi sinh vật Chúng ta có thể xác định được sự có mặt của một loại vi sinh vật đích trong một mẫu nghiệm qua các bước:

- Phân lập vi sinh vật đích Sử dụng kỹ thuật cấy phân lập trên môi trường đặc trưng chúng ta bước đầu phân tách vi sinh vật đích ra khỏi quần thể vi sinh trong mẫu nghiệm Tìm chọn các khuẩn lạc có biểu hiện giống với loại vi sinh vật cần tìm Cấy chuyển sang ống thạch nghiêng để giữ chủng và tiến hành định danh

- Định danh chủng vi sinh phân lập được thường dựa vào: hình thái (nhuộm gram, soi kính hiển vi dưới vật kính dầu), khảo sát các đặc tính nhu cầu sinh lý, các đặc điểm hóa sinh khác

III Định tính và định lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm

Đối với phòng thí nghiệm vi sinh thực phẩm, chúng ta cần phải đánh giá các chỉ tiêu

vi sinh theo các tiêu chuẩn quy định xác định mẫu thực phẩm Có thể xếp thành 2 nhóm là định tính và định lượng vi sinh vật trong mẫu thực phẩm

- Một số vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm cho người tiêu dùng, nên trong thực phẩm không được có mặt, các chỉ tiêu thường quy định không phát hiện trong 25 gam thực phẩm

Ví dụ như Salmonella

- Một số vi sinh vật gây bệnh được quy định ở một giới hạn nào đó Ví dụ: S aureus,

E coli … Chúng ta phải tiến hành định lượng, theo phương pháp MPN, hoặc Phương pháp đếm khuẩn lạc

Bài 2: NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI TẾ BÀO VI SINH VẬT

1 KÍNH HIỂN VI:

Hiện nay có rất nhiều loại kính hiển vi, một số loại được dùng phổ biến trong phòng thí nghiệm vi sinh vật : kính hiển vi trường sáng, kính hiển vi trường tối, phản pha, và huỳnh quang ; trong bài này chỉ trình bày kính hiển vi trường sáng Nếu trước đây bạn đã tìm hiểu

về kính hiển vi, thì bài này sẽ không có nhiều thông tin cung cấp cho bạn ; tuy nhiên nếu đây

là lần đầu tiên tìm hiểu về vi sinh vật, bạn cần đọc kỹ để sử dụng đúng kính hiển vi

Kính hiển vi là dụng cụ cần được chăm sóc đặc biệt để tránh hư hỏng hệ thống quang học và cơ học Thực tế kính hiển vi được nhiều người sử dụng và di chuyển nhiều dẫn đến dễ

hư hỏng kính so với chỉ do 1 người sử dụng Bạn cần thực hiện đúng các chỉ dẫn khi sử dụng kính

KÍNH HIỂN VI TRƯỜNG SÁNG Trong kính hiển vi trường sáng, tia sáng đi trực tiếp từ nguồn đến mắt người mà không bị lệch hướng do tấm mờ nằm giữa tụ quang Đây là loại kính được học sử dụng đầu tiên dành cho người bắt đầu học về sinh học, thường đuợc sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh vật

Tất cả các loại kính hiển vi trường sáng có cấu trúc chung, hơi khác về hệ thống cơ Bài tập sẽ giúp bạn hiểu được về các điểm giống và khác nhau giữa cac loại Trước khi thao tác trên kính cần đọc các bài tập và trả lời các câu hỏi trong bản tường trình

CHĂM SÓC KÍNH Kính hiển vi dễ hư hỏng, nếu bất cẩn sẽ không

sử dụng được Cần thực hiện đúng các chỉ dẫn sau:

Vận chuyển: Khi chuyển kính hiển vi từ vị trí này

sang vị trí khác trong phòng thí nghiệm, phải đỡ dụng

cụ bằng cả hai tay Nếu chỉ cầm 1 tay rất dễ va chạm

vào vật dụng khác Không được cầm 2 tay 2 kính hiển

vi cùng một lúc, bất kể trong trường hợp nào

Ngăn nắp: Giữ nơi soi kính ngăn nắp, cất sách vở,

dụng cụ không cần thiết Vùng soi kính gọn gàng,

ngăn nắp sẽ ít xảy ra sự cố hơn

Dây điện: Dây dẫn điện bóng đèn kính hiển vi rất dễ

làm sinh viên vấp, kéo kính hiển vi rơi xuống đất

Chú ý dây điện sao cho mọi người đi lại trong phòng

thí nghiệm không bị vấp

Lau chùi thấu kính: Bắt đầu buổi thí nghiệm kiểm tra xem các thấu kính đã sạch hay chưa

Khi sử dụng dầu để soi kính, cuối buổi thí nghiệm phải lau vật kính bằng các dụng dịch lau kính (nước ấm xà phòng, xylene, alcohol, cũng có thể dùng acetone nhưng chú ý acetone là dung môi mạnh có thể làm tan keo gắn các thấu kính) Giấy lau sử dụng loại chuyên dùng, không tạo xơ bụi khi lau, giấy sạch không bám bụi có thể làm trầy sướt kính Bạn phải tuân theo sự chỉ dẫn của Giáo viên phụ trách

Bảo vệ chống bụi: Hầu hết các dụng cụ trong phòng thí nghiệm đều có tấm che phủ nhằm

bảo vệ dụng cụ khỏi bụi Cuối buổi làm việc, cần đậy lại để chống bụi

CÁC BỘ PHẦN CHÍNH CỦA KÍNH HIỂN VI Khung đỡ gồm chân và thân kính

Bàn soi có bộ phận kẹp lam kính, vít trượt điều chỉnh vị trí lam kính trên bàn soi

Hệ thống thấu kính gồm thị kính, vật kính và tụ quang

Hình 1: Hai tay đỡ dụng cụ một

cách chắc chắn trong khi di chuyển kính hiển vi

Hình 2: Các bộ phận chính của kính hiển vi

ĐIỀU CHỈNH KÍNH

Độ phóng đại: Độ phóng đại cuối cùng của ảnh soi được bằng độ phóng đại của thị kính nhân với độ phóng đại của vật kính

Soi kính ở vật kính có độ phóng đại thấp:

thường dùng vật kính 10x Gồm các bước sau:

- Kẹp tiêu bản lên bàn soi đúng vị trí, chú ý mẫu

cần soi ở mặt trên

- Bật nguồn sáng, chỉnh ở mức ánh sáng vừa

phải (chỉnh nguồn, tụ quang),

- Chỉnh mẫu soi đến vị trí trung tâm nguồn

nâng bàn soi đến vị trí cao nhất tuỳ

theo kính hiển vi (vị trí này đã được

- Dùng ốc điều chỉnh thanh trượt bàn soi để di chuyển lam kính tìm hình cần soi

Soi kính ở vật kính có độ phóng đại cao hơn: thường dùng vật kính 40x

- Sau khi chỉnh ở vật kính 10x có ảnh rõ, bạn xoay vật kính 40x đến vị trí cần soi

- Chỉ dùng ốc chỉnh tinh để chỉnh cho ảnh rõ (không được dùng ốc thỉnh thô)

Hình 5: Sơ đồ giải thích lý do dùng dầu soi kính

Khi sử dụng xong kính hiển vi :

1 Lấy lam kính ra khỏi bàn soi

2 Nếu dùng vật kính dầu, lau dầu khỏi vật kính bằng giấy lau và dng dịch lau theo quy định của phòng thí nghiệm

3 Xoay vật kính có độ phóng đại nhỏ nhất về vị trí soi kính

4 Các bộ phận di chuyển được đưa về vị trí cao nhất

5 Điều chỉnh thanh trượt trên bàn soi về vị trí ở giữa

- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi

- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống

- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi

Cách làm tiêu bản giọt treo

Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích

- Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa

- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính

- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính

- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính

Hình 6: Các bước làm tiêu bản giọt treo

b/ Phương pháp làm tiêu bản cố định

Thực hành vô trùng tạo vết bôi:

- Lắc đều ống nghiệm để vi khuẩn lơ lửng trong ống Không làm ướt nút ống nghiệm

- Hơ đỏ đầu que cấy và phần kim loại Hơ nóng phần tay cầm

- Mở nút ống nghiệm và hơ nóng miệng ống Không đặt nút xuống bàn

- Làm nguội đầu que cấy ít nhất 5 giây, lấy một vòng que cấy dịch chứa vi sinh vật Tránh chạm vào thành ống nghiệm

- Hơ nóng miệng ống nghiệm lần nữa

- Đậy nút ống nghiệm và đặt lên giá

- Đặt vòng cấy chứa vi khuẩn chính giữa vòng mục tiêu trên phiến kính

- Hơ que cấy lại trước khi chuyển vòng cấy khác từ canh cấy hoặc đặt sang chỗ khác

Thực hành cố định tế bào:

Đối với mẫu lấy từ môi trường dịch lỏng:

- Định sẵn một vòng tròn mục tiêu trên phiến kính

- Đặt 2 vòng que cấy dịch chứa vi sinh vật vào chính giữa vòng tròn mục tiêu

- Tán đều vi sinh vật khắp vùng của vòng mục tiêu

- Vết bôi làm khô ở nhiệt độ phòng

Đối với mẫu lấy từ môi trường rắn:

- Định sẵn một vòng tròn mục tiêu trên phiến kính

- Đặt 2 vòng que cấy nước vào chính giữa vòng tròn mục tiêu

- Một lượng nhỏ vi sinh vật được tán đều bằng que cấy khắp vùng của vòng mục tiêu

- Vết bôi làm khô ở nhiệt độ phòng

Đưa phiến kính qua ngọn lửa vài lần để tiêu diệt và gắn vi khuẩn vào phiến kính

Hình 7: Các bước làm tiêu bản vi khuẩn

Hình 8: Kỹ thuật vô trùng

Nhuộm đơn

- Đặt tiêu bản nằm ngang trên khay nhuộm

- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Xanh Methylene, để yên 1 phút

- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ qua vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa

- Để khô tự nhiên (có thể dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn.)

- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi

Hình 9: Các bước nhuộm đơn

Nhuộm Gram:

Năm 1884 nhà vi khuẩn học Đan mạch

Chrischian Gram phát triển kỹ thuật nhuộm để tách

vi khuẩn ra làm 2 nhóm: một nhóm là Gram dương

và một nhóm là Gram âm Các bước nhuộm dựa

trên hiện tượng một số vi sinh vật giữ màu tím của

crystal violet trong quá trình tẩy màu bằng alcohol

Vi khuẩn Gram âm bị mất màu tím của crystal

violet bởi alcohol Vi khuẩn gram dương không bị

mất màu và giữ lại màu tím của crystal violet Sau

khi mất màu tím, đỏ safranin được sử dụng tạo màu

hồng cho vi khuẩn gram âm đã bị mất màu

Hình bên cho thấy sự ảnh hưởng của các yếu

tố khác nhau trên tế bào vi khuẩn tại mỗi thời điểm

của quá trình nhuộm Chú ý rằng việc nhuộm

crystal violet đầu tiên là nguyên nhân cả 2 nhóm

gram dương và âm có màu tím sau 20 giây của quá

trình nhuộm Khi chất nhuộm màu iodine được phết

lên vết bôi tế bào vi khuẩn trong 1 phút, màu của

gram dương và gram âm màu tím tương tự nhau Chức năng của iodine ở đây là để kết hợp với crystal violet tạo thành hợp chất không hòa tan trong vi khuẩn gram dương Khi cồn 95%

là tác nhân làm mất màu được thêm vào trong 10 -20 giây, vi khuẩn gram âm bị mất màu tím còm vi khuẩn gram dương giữ lại màu tím Trong bước cuối cùng, chất nhuộm ngược lại safranin thêm màu hồng để vi khuẩn gram âm bị mất màu không ảnh hưởng màu tím vi khuẩn gram dương

Các kỹ thuật nhuộm dùng trong việc nhân diện vi khuẩn chưa biết Nhuộm gram là một thí nghiệm quan trọng trong PTN vi sinh vật Mặc dù kỹ thuật này dường như khá đơn giản, nhưng cần tiến hành thí nghiệm này cẩn thận Các bạn chú ý: (1) không làm vết bôi quá dày, và (2) Chú ý bước tẩy màu

Lưu ý: canh cấy của vi khuẩn gram dương già có khuynh hướng mất màu nhanh hơn canh cấy non, khiến chúng xuất hiện gram âm thay vì vi khuẩn gram dương Để có kết quả đáng tin cậy nên sử dụng một canh cấy khoảng 16 giờ Một điểm khác cần chú ý, vài loài

Bacillus có thử nghiệm nhuộm gram thay đối: đôi khi bắt màu gram dương, đôi khi bắt màu

gram âm

Bạn cần làm thí nghiệm với vài loài vi khuẩn khác nhau Cần nhớ rằng, nếu bạn không nắm vững kỹ thuật này bây giờ, bạn sẽ khó khăn với những vi khuẩn chưa biết sau này

Thực hành nhuộm

Vật liệu: Lam kính với vết bôi đã cố định bằng nhiệt

Thuốc nhuộm gram và bình tia chứa nước cất Giấy thấm

1 Phủ crystal violet lên vết bôi và giữ trong 20 giây

2 Dùng bình tia rửa sạch vết thuốc nhuộm trong một thời gian ngắn Làm ráo nước thừa

3 Phủ vết bôi với dung dịch lugol và giữ trong 30 giây đến 1 phút

Hình 10: Sự thay đổi màu trong

các bước nhuộm Gram

4 Nghiêng đổ hết dung dịch lugol trên phiến kính và phủ vết bôi với ethyl alcohol 95% trong 10-20giây Đây là bước quyết định Vết bôi dày sẽ cần khoảng thời gian lâu hơn vết bôi mỏng

5 Dừng bước tẩy alcohol bằng cách rửa phiến kính với nước trong bình tia

6 Phủ safranin trên vết bôi và giữ trong 20 giây hoặc lâu hơn

7 Rửa nhẹ nhàng trong vài giây, để khô tự nhiên hoặc thấm khô bằng giấy thấm

8 Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi

Hình 11: Các bước nhuộm Gram

Thực hành

Các vi sinh vật dùng cho bài thực hành nhuộm gram cần đại diện cho sự đa dạng hình thái và đặc điểm nhuộm Vài loại trực khuẩn và cầu khuẩn là gram dương và loại khác là gram âm Một vi sinh vật hình que là dạng bào tử và loại khác là vi khuẩn kháng cồn-acid Vấn đề thử thách ở đây là làm các tiêu bản với hỗn hợp các loài vi khuẩn khác nhau và phát hiện ra chúng

Vật liệu:

- Canh cấy Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Moraxella

catarrhalis

- Ống thạch nghiêng cấy Bacillus megaterium và Mycobacterium smegmatis

Chuẩn bị 3 tiêu bản với ba vết bôi trên mỗi tiêu bản Trên phần bên trái của mỗi tiêu

bản làm một vết bôi của Staphylococcus aureus Trên phần bên phải mỗi phiến kính làm một vết bôi của Pseudomonas aeruginosa Ở phần giữa tiêu bản là vết bôi của hỗn hợp cả hai vi

khuẩn này, dùng 2 que cấy vòng cho mỗi vi khuẩn Hãy chắc chắn hơ lửa que cấy đủ để tránh gây nhiễm

Báo cáo kết quả của bạn trong phần báo cáo thí nghiệm bằng việc vẽ một vài tế bào trong vòng tròn thích hợp

Bài 3: CHUẨN BỊ DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT

1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy:

Từ bây giờ hầu hết các thí nghiệm trong tài liệu này sẽ sử dụng cho các môi trường dùng để nuôi cấy vi khuẩn Hầu hết các môi trường được chuẩn bị sẵn Tuy nhiên, có thể phát sinh trường hợp bạn cần một vài môi trường đặc biệt mà đã không được chuẩn bị sẵn, các bạn trong nhóm phải cùng nhau chuẩn bị

1 Các loại môi trường:

Một môi trường nuôi cấy vi sinh vật là thực phẩm cho canh cấy vi khuẩn, nấm mốc,

và các vi sinh vật khác Nó có thể tồn tại 3 dạng: lỏng, đặc và bán rắn

Môi trường lỏng: bao gồm canh thang dinh dưỡng, canh thang citrate, canh thang

glucose, sữa-quỳ … Các môi trường đó được sử dụng cho việc nhân giống một lượng lớn vi sinh vật, nghiên cứu sự lên men, và nhiều thử nghiệm khác

Môi trường rắn: thực hiện bằng cách đưa thêm vào một tác nhân tạo đông như agar,

gelatin, hoặc silica gel vào môi trường lỏng Một tác nhân tạo đông tốt là một chất mà không

bị sử dụng bởi vi sinh vật, không ức chế sự phát triển của vi khuẩn và không hóa lỏng ở nhiệt

độ phòng Agar và silica gel không hóa lỏng ở nhiệt độ phòng và không bị sử dụng bởi nhiều sinh vật Trái lại, gelatin bị thủy phân bởi khá nhiều vi sinh vật và hóa lỏng ở nhiệt độ phòng

Thạch dinh dưỡng, thạch máu và Sabouraud là ví dụ môi trường rắn được dùng cho

sự phát triển các khuẩn lạc của vi khuẩn và nấm mốc trên bề mặt Sự phát triển các khuẩn lạc trên bề mặt môi trường là cần thiết khi cố gắng phân lập vi sinh vật từ canh cấy hỗn hợp

Môi trường bán rắn: là dạng môi trường ở giữa môi trường lỏng và rắn Mặc dù

chúng tương tự môi trường rắn trong việc chứa tác nhân tạo đông như agar, gelatin, chúng là dạng thạch đông nhờ có phần trăm các chất tạo đông thấp Các môi trường đó hữu dụng trong việc xác định vi khuẩn có thể di động hay không

2 Nhu cầu dinh dưỡng cần thiết của vi khuẩn

Bất cứ môi trường nào phù hợp cho một nhóm vi sinh vật cụ thể đều bao gồm 7 yếu

tố sau: nước, carbon, nguồn năng lượng, nitrogen, khoáng, yếu tố sinh trưởng, pH Vai trò của mỗi yếu tố như sau:

Nước: Nguyên sinh chất chứa 70-85% nước Nước trong sinh vật đơn bào gắn liền

với nước trong môi trường, các phân tử này ra vào qua màng tế bào như một giá mang các chất dinh dưỡng vào và bài tiết các chất ra khỏi tế bào Tất cả các enzyme kiểm soát các phản ứng hóa học chỉ xảy ra trong tế bào khi có lượng nước đầy đủ Chất lượng nước dùng trong chuẩn bị môi trường rất quan trọng Nước cứng có hàm lượng ion canxi và magiê cao không được sử dụng Phosphate của canxi và magiê không hòa tan có thể kết tủa khi có mặt của

peptone và cao thịt bò Tốt nhất luôn sử dụng nước cất

Carbon: Vi sinh vật được chia làm 2 nhóm tuỳ theo nguồn carbon mà chúng sử dụng

Nhóm có thể sử dụng carbon dioxide để tổng hợp tất cả chất cho tế bào gọi là vi sinh vật tự dưỡng Nếu chúng có một hoặc nhiều hợp chất hữu cơ sử dụng làm nguồn carbon được gọi là

vi sinh vật dị dưỡng Ngoài nguồn carbon hữu cơ, vi sinh vật tự dưỡng cũng có thể sử dụng carbon dioxide Nếu khí này hoàn toàn loại trừ ra khỏi môi trường của chúng, sự phát triển của chúng bị chậm lại, đặc biệt trong giai đoạn sớm của bắt đầu một canh cấy

Carbon hữu cơ đặc trưng cần thay đổi theo tổ chức tế bào của vi sinh vật Một vi sinh vật có thể chỉ yêu cầu một hợp chất đơn đơn giản như acetic acid, nhóm khác có thể yêu cầu

12 hoặc nhiều loại dinh dưỡng hữu cơ với mức độ phức tạp

Nguồn năng lượng: Vi sinh vật có sắc tố cho phép chúng sử dụng nguồn năng lượng

mặt trời được gọi là vi sinh vật quang năng (photoautotrophs) Môi trường nuôi cấy nhóm vi

không sử dụng năng lượng mặt trời nhưng có thể oxi hóa hợp chất vô cơ đơn giản tạo năng lượng gọi là vi sinh vật hóa năng (chemoautotroph) Chất sinh năng lượng cần thiết cho các

vi sinh vật này có thể là các chất như nitrite, nitrate hoặc sulfide

Hầu hết các vi khuẩn thuộc vào nhóm dị dưỡng hóa năng cần nguồn năng lượng hữu

cơ như glucose hoặc amino acids Lượng chất sinh năng lượng trong môi trường nuôi cấy mang lại cho cả hai dạng hóa tổng hợp là 0,5%

Một lượng nhỏ vi khuẩn được phân loại là dị dưỡng quang năng Các vi sinh vật đó

có sắc tố quang hợp cho phép chúng sử dụng ánh sáng mặt trời cho năng lượng Nguồn năng lượng carbon cần là hợp chất hữu cơ như alcohol

Nitrogen: Mặc dù vi sinh vật tự dưỡng có thể sử dụng nguồn nitrogen vô cơ, vi sinh

vật dị dưỡng lấy nguồn nitrogen từ amino acid và hợp chất trung gian như peptid proteoses

và peptone Dịch chiết thịt bò và peptone sử dụng trong canh dinh dưỡng cung cấp nitrogen cần thiết cho vi sinh vật tự dưỡng phát triển trong môi trường

Khoáng: Tất cả các vi sinh vật yêu cầu một vài nguyên tố kim loại như sodium,

potassium, calcium, magnesium, sắt, kẽm, đồng phosphor và coban cho sự sinh trưởng bình thường Vi khuẩn không ngoại lệ hàm lượng yêu cầu khá nhỏ

Các yếu tố phát triển: bất cứ hợp chất cần thiết nào của vật chất tế bào mà một vi

sinh vật không thể tổng hợp từ nguồn carbon và nitrogen được phân loại là một yếu tố phát triển Yếu tố phát triển có thể bao gồm amino acid hoặc vitamin Nhiều vi sinh vật dị dưỡng thỏa mãn với yếu tố sinh trưởng hiện diện trong dịch chiết thịt bò của canh thang dinh dưỡng Hầu hết các vi khuẩn gây bệnh khó tính yêu cầu môi trường giàu dinh dưỡng như thạch máu giàu yếu tố phát triển

pH: Sự phát triển của vi sinh vật trong một môi trường cụ thể có thể hoàn toàn bị ức

chế nếu pH môi trường không nằm trong vùng giới hạn Các enzyme vi sinh vật bị ảnh hưởng lớn bởi yếu tố này Hầu hết các vi khuẩn phát triển tốt nhất xung quanh pH 7, pH của canh thang dinh dưỡng nên điều chỉnh đến pH 6,8 Mặt khác, vi khuẩn gây bệnh thường thích ứng

pH kiềm hơn Trypticase soy broth là một môi trường phù hợp cho nhiều vi khuẩn gây bệnh khó tính nên điều chỉnh đến pH 7,3

3 Môi trường có thành phần chính xác:

Các môi trường có thể được chuẩn bị chính xác đến chi tiết vì thế các thành phần chính xác phải được biết Các môi trường thông thường làm từ các chất hóa học có độ tinh sạch cao và thành phần chính xác Chúng được biết như môi trường tổng hợp Các môi trường như canh thang dinh dưỡng chứa các thành phần không chính xác được gọi là môi trường tự nhiên Cả hai loại dịch chiết thịt bò và peptone đều không chính xác trong thành phần trong canh dinh dưỡng

4 Môi trường đặc biệt:

Hai loại môi trường đặc biệt sẽ được mở rộng sử dụng trong chỉ dẫn thực hành là môi trường chọn lọc và phân biệt

Môi trường chọn lọc là môi trường mà theo đó chỉ các loại chính xác của vi sinh vật phát triển trên hoặc trong môi trường đó bởi vì (1) sự vắng mặt của một số chất dinh dưỡng quan trọng làm cho nó không thích hợp cho hầu hết các vi sinh vật nhưng không phải tất cả hoặc (2) sự hiện diện của chất ức chế ngăn cản sự phát triển của các vi sinh vật nhất định nào

đó Chất ức chế có thể là NaCl, acid, hóa chất gây độc (như Crystal violet), chất kháng khuẩn (như Streptomycin), hoặc vài hợp chất khác

Môi trường phân biệt là môi trường chứa các chất tạo ra một số vi khuẩn để có một dáng khác nhau từ các loài khác, cho phép phân biệt một trong những loài khác

Trong một số trường hợp môi trường đưa vào công thức cả hai chọn lọc và phân biệt

Ví dụ môi trường EMB agar, sử dụng để xác định coliforms trong phân tích nước

5 Chuẩn bị môi trường:

Bạn cần báo cáo số lượng của các môi trường cụ thể để có thể phân công nhiệm vụ cho bạn và người cùng làm việc

Vài cỡ ống nghiệm kiểm tra được sử dụng cho môi trường nhưng 2 cỡ thường được dùng là 16mm, 20mm dài 15cm

Ống lớn (20mm): dùng để rót các môi trường như: NA, SDA, EMB… Các ống rót được dùng cho việc đổ vào đĩa Petri

Ống nhỏ (16cm): dùng cho tất cả canh trường, môi trường đứng và môi trường thạch nghiêng

Nếu các ống nghiệm đã được làm sạch và bảo vệ tránh vết bẩn hoặc các chất gây nhiễm khác, chúng có thể sử dụng không cần làm sạch Nếu chúng cần làm sạch, dùng cây cọ ống nghiệm chùi rửa với nước nóng và chất tấy rửa Súc rửa hai lần, đầu tiên với nước vòi, cuối cùng với nước cất để giũ sạch các dấu vết của chất tẩy rửa Đặt dốc ngược chúng lên giá

để khô Không dùng khăn lau khô dụng cụ

Đo lường và hòa trộn:

Lượng môi trường bạn làm cho một lần nên xác định rõ, tránh dư thừa hoặc thời gian bảo quản dài

Ống canh trường lên men 5-7 ml

2/ Xem trên nhãn hộp môi trường để xác định lượng môi trường cần pha trong 1000ml, sau đó xác định lượng nước sử dụng cho phương pháp tương ứng sử dụng Cân môi trường và cho vào cốc đong nước Nếu môi trường không chứa agar, quá trình hòa trộn thường dùng nhiệt bên ngoài hòa tan

3/ Nếu môi trường chứa agar, nấu sôi trên bếp điện, để tránh mất nước, trước khi nấu tan đánh dấu mức trên của môi trường trên thành cốc đong bằng bút viết kính Chú ý, môi trường có thể sôi trào ra khỏi dụng cụ chứa đựng Cẩn thận dùng đũa thủy tinh khuấy tránh môi trường bị cháy dưới đáy cốc đong

4/ Kiểm tra mức nước với vạch đánh dấu để chú ý lượng nước bị mất đi Thêm nước cất đủ lượng yêu cầu Giữ nhiệt độ môi trường khoảng 600C để tránh bị đông đặc Môi trường sẽ đông đặc khoảng 400C

Điều chỉnh pH:

Mặc dù môi trường khô chứa tác nhân đệm giữ pH của môi trường ở khoảng mong muốn, pH môi trường có thể thay đổi so với trạng thái trên nhãn chai Trước khi được rót ống, nên kiểm tra pH môi trường và điều chỉnh pH nếu có

Nếu có sẵn dụng cụ đo pH và đã chuẩn, dùng nó để đo pH của môi trường Nếu cần điều chỉnh pH dùng HCl hoặc NaOH Nếu không có dụng cụ đo pH, có thể dùng giấy đo pH Cách điều chỉnh pH:

Vật liệu: cốc đong chứa môi trường, chai 1N và 0,1N của HCl và NaOH, que khuấy thủy tinh, giấy đo pH, dụng cụ đo pH (không bắt buộc)

1/ Xác định pH môi trường bằng giấy đo pH

2/ Nếu pH quá cao, thêm HCL để giảm pH Nếu lượng môi trường quá nhiều dùng 1N HCl Nếu pH sai khác ít, dùng 0,1HCl Khuấy trộn giọt thêm vào để hòa tan vào môi trường bằng que khuấy thủy tinh

3/ Nếu pH quá thấp, thêm NaOH từng giọt để tăng pH Nếu pH sai khác ít dùng 0,1NNaOH, sai khác nhiều dùng 1NNaOH Khuấy trộn đều giọt thêm vào bằng đũa thủy tinh

3/ Giữ cốc chứa môi trường nóng nếu chứa agar

4/ Nếu ống nghiệm được sử dụng trong lên men, thêm một vào mỗi ống ở thời điểm này, miệng ống quay xuống dưới

Đậy nắp ống nghiệm:

Bước cuối cùng trước khi thanh trùng là đậy nắp các ống nghiệm Nắp plastic thích hợp cho mọi trường hợp Tất cả các nắp đậy đầu ống nghiệm có rãnh nhỏ bên trong tạo khoảng trống cho phép hơi nước thoát ra trong quá trình thanh trùng Nếu dùng nắp vặn plastic, nắp không được vặn chặt, trước khi thanh trùng nới nắp vặn một phần vòng xoay

7 Thanh trùng:

Các ống nghiệm chuẩn bị xong cần thanh trùng ngay lập tức Vi sinh vật trên thành ống, trong nước cất, trong môi trường làm khô sẽ bắt đầu phát triển trong khoảng thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng, phá hủy môi trường

Trước khi thanh trùng, các ống nghiệm cần đặt trong dụng cụ chứa dạng lưới có ghi nhãn bên ngoài Nhãn cần thể hiện loại môi trường, ngày thanh trùng, người làm

Thanh trùng thực hiện trong nồi thanh trùng Hướng dẫn sử dụng nồi thanh trùng:

- Kiểm tra thực hành với dạng nồi thanh trùng cụ thể Hoàn thành quá trình thanh trùng ở 1210C Để đạt được nhiệt độ đúng cần chuẩn bị không gian cho sự thoát khí Một số thiết bị cũ cần cho hơi nước thoát ra cửa sổ

- Không để quá tải lỗ thoát khí Không nên thử nhìn môi trường nhồi nhét trong đó Cần giữ khoảng cách giữa các dụng cụ chứa đựng cho sự lưu thông hơi nóng

- Điều chỉnh thời gian thanh trùng với kích cỡ bình chứa Các bình chứa nhỏ có thể thanh trùng 10-15 phút Một nồi thanh trùng đầy có thể mất 30 phút hoàn tất

8 Sau khi thanh trùng:

Thạch nghiêng: Cần đặt gần như nằm ngang ngay khi lấy trong nồi thanh trùng ra

Quá trình đông đặc xảy ra trong vòng 30 -60 phút

Môi trường khác: Các dạng ống nghiệm lỏng, thạch đứng cần để nguội ở nhiệt độ

phòng sau khi lấy ra khỏi nồi thanh trùng Sau khi đông đặc, giữ trong tủ lạnh hoặc chỗ mát

Bảo quản: Nếu ống môi trường không dùng ngay, chúng cần được bảo quản chỗ mát

Khi bảo quản thời gian dài ở nhiệt độ phòng môi trường sẽ bị mất nước Môi trường có thể giữ ở nhiệt độ tủ lạnh hàng tháng

Bài 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY VI SINH VẬT

1 KỸ THUẬT VÔ TRÙNG:

Các thủ tục hướng dẫn chi tiết đảm bảo yêu cầu của việc duy trì một môi trường vô trùng khi thao tác cấy vi sinh vật Cấy chuyển vô trùng từ canh cấy này sang canh cấy khác thành công khi không lây nhiễm vi sinh vật trong quá trình Quá trình cấy chuyển có thể từ khuẩn lạc trên hộp lồng sang ống nghiệm chứa canh trường hoặc cấy chuyển từ canh trường nuôi cấy sang nhiều loại môi trường (rắn hoặc lỏng) cho nhiều loại xét nghiệm

Thao tác chung:

Khử trùng khu làm việc: Đầu tiên xử lý khu vực làm việc với một chất tẩy trùng để

diệt vi sinh vật hiện có Bước này phá hủy được tế bào sinh dưỡng và virus; tuy nhiên không phá hủy được bào tử

Que cấy vòng và que cấy thẳng: Việc cấy chuyển các vi sinh vật được thực hiện

bằng que cấy vòng hoặc thẳng Phải khử trùng chúng trước khi lấy vi sinh vật bằng cách nung nóng bằng đèn cồn đến nóng đỏ

Hơ nóng miệng ống nghiệm: Trước khi đưa que cấy đã làm nguội vào ống nghiệm

chứa môi trường, mở nắp ống nghiệm và hơ nóng miệng ống nghiệm Sau khi lấy vi sinh vật

ra khỏi ống nghiệm, phải hơ nóng miệng ống lần nữa

Cấy trên môi trường lỏng: Nếu cấy vi sinh vật vào ống môi trường lỏng, miệng ống

cần hơ nóng trước khi đưa que cấy vào trong ống Để cấy vi sinh vật vào môi trường, cần xoay que cấy vài vòng trong môi trường

Sau khi cấy xong, que cấy được rút ra khỏi ống nghiệm, khử trùng như lúc đầu Các

dụng cụ này không được đặt trên mép bàn Khử trùng miệng ống nghiệm trước khi đậy nắp

Cấy đĩa Petri: Để cấy trên đĩa, không dùng nhiệt tác dụng lên đĩa và dùng que cấy

vòng trong quá trình cấy chuyển Khi vạch trên bề mặt môi trường cần giữ nắp đậy che phía trên, tránh lây nhiễm vi sinh vật từ không khí

Khử trùng cuối cùng: Khi công việc kết thúc, vùng làm việc cần được xử lý với chất

khử trùng để chắc chắn vi sinh vật tích tụ trong quá trình làm việc đều bị loại bỏ

Để thực hành cấy chuyển canh cấy vi khuẩn, ba cách cấy chuyển đơn giản được đưa ra: (1) chuyển từ canh cấy sang canh cấy, (2) chuyển từ thạch nghiêng sang thạch nghiêng, (3) chuyển từ đĩa thạch sang đĩa thạch

Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác:

- Dán nhãn ghi: Tên giống vi sinh vật; ngày cấy vào thành ống nghiệm, dưới nút bông một chút

- Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống, 1 ống môi trường

- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ vòng cấy

- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống giống ra

- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng ống nghiệm

- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống giống

- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi trường để thực hiện các thao tác cấy truyền

- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông

- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong

Hình 13: Các bước thực hiện lấy vi sinh vật từ ống canh thang

Hình 14: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ đĩa thạch

Hình 15: Cấy vi sinh vật trên ống thạch nghiêng từ ống thạch nghiêng

2 CÁC PHƯƠNG PHÁP CẤY:

Phương pháp cấy trên thạch nghiêng:

Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí

- Sử dụng que cấy đầu tròn tiến hành các thao tác theo đúng trình tự nói trên

- Thực hiện việc cấy giống vào ống thạch nghiêng bằng các thao tác tiếp theo:

+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm

+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các cách khác nhau

Phương pháp cấy trên thạch đứng: Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí

- Sử dụng que cấy kim

- Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình trụ

- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát thành ống tuỳ yêu cầu

- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường

Phương pháp cấy trên đĩa pêtri:

Có thể cấy trên đĩa pêtri theo 1 trong 2 cách sau:

* Dùng que cấy đầu tròn và thực hiện theo trình tự sau:

- Để đĩa pêtri lên bàn

- Dùng que cấy lấy canh trường vi sinh vật theo thứ tự và yêu cầu ở phương pháp chung

- Tay trái hé mở nắp đĩa pêtri vừa đủ để cho que cấy vào

- Nhẹ nhàng và nhanh chóng lướt que cấy lên mặt thạch theo một trong các kiểu sau (xem hình 16)

+ Theo hình chữ chi trên toàn bộ mặt thạch

+ Theo những đường song song

+ Theo 4 hình chữ chi 4 góc

Hình 16: Các cách cấy phân lập khác nhau trên đĩa thạch

* Dùng pipet: Thường áp dụng để định lượng vi sinh vật và cấy một lượng khá nhiều giống Có 2 cách:

Cách 1:

+ Trộn dịch cấy vào thạch bằng cách hút 1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống nghiệm có môi trường thạch ở nhiệt độ 45-500C

+ Đậy nút bông lại, lắc nhẹ cho vi sinh vật phân phối đều trong môi trường

+ Đổ thạch này vào đĩa pêtri đã khử trùng

+ Xoay tròn đĩa pêtri cho thạch dàn đều ở đáy hộp

+ Để yên cho thạch đông đặc lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp

Cách 2: Phương pháp cấy trang

- Tiến hành pha loãng mẫu theo phương pháp đã nêu trên

- Ghi vào đáy đĩa Petri có môi trường thạch các thông tin :

Nồng độ pha loãng

Ngày cấy

- Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương đương với 2 giọt dịch) Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và không nên vượt quá 300

Lưu ý: có thể dùng thể tích mẫu cấy từ 0,05 - 0,5 ml Tuy nhiên, thể tích mẫu cấy càng nhỏ thì sai số có thể xảy ra càng lớn

Khi tất cả các thể tích 0,1 ml tế bào ở các độ pha loãng khác nhau đều đã được chuyển lên bề mặt thạch của đĩa Petri, sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên

bề mặt thạch Lưu ý rằng que cấy gạt thuỷ tinh phải được vô khuẩn trước khi được đưa vào đĩa Petri tiếp theo, bằng cách nhúng vào trong cồn, vẩy nhẹ để loại đi lượng cồn dư bám bằng que cấy, đốt cháy phần cồn còn lại trên que cấy trên ngọn lửa đèn cồn Làm nguội que cấy bằng cách nhẹ nó vào bề mặt thạch, rồi dàn đều lượng chất lỏng chứa tế bào trên đó Nếu thể tích chất lỏng đem cấy quá nhiều, các tế bào sẽ trôi dạt trong chất lỏng, và sau khi tế bào phân chia, hai khuẩn lạc xuất phát từ một tế bào có thể hình thành Các đĩa thạch được chuẩn

bị một ngày trước khi cấy thường hấp thu nhanh lượng chất lỏng đem cấy Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy ra càng nhanh