cong, có khả năng di động hầu hết có cực mao khi sinh trưởng trên môi trường lỏng. Hầu hết chúng đều tạo oxydase và catalase, lên men glucose nhưng không sinh hơi. Các loài Vibrio
chiếm tỷ lệ lớn trong việc gây nhiễm bệnh cho người qua đường tiêu hóa từ các nhuyễn thể có vỏ còn sống hoặc chưa chín kỹ.
Phương pháp phân lập:
Các loài Vibrio sinh trưởng trên môi trường có nồng độ muối khá cao. Chúng là loài kị khí tùy ý và sinh trưởng tốt nhất trong điều kiện kiềm. Sử dụng môi trường kiềm sẽ dễ phân lập vi khuẩn này hơn. Nước pepton kiềm (APW) được dùng phổ biến để phân lập vài loài liên quan.
Môi trường kiểm tra phản ứng sinh hóa của V. parahaemolyticus nên chứa 2 – 3% NaCl. Dung dịch cấy chuyển huyền dịch tế bào hoặc pha loãng thường là đệm phosphate PSB. Thạch TCBS là môi trường để phân lập V. cholerae, V. parahaemolyticus và các loài
khác từ hải sản. Môi trường này hỗ trợ tốt cho sự phát triển của Vibrio trong khi đó lại ức chế hiệu quả các vi khuẩn khác không phải Vibrio.
Bảo quản mẫu:
Sau khi thu thập mẫu cần được bảo quản ở 7–100C, sau đó đem phân tích càng nhanh càng tốt. Nên tránh tiếp xúc trực tiếp với đá để khả năng sống sót và phục hồi của Vibrio là cao nhất. Vibrio có thể bị tổn thương do làm lạnh nhanh nhưng lại sinh trưởng nhanh ở nhiệt độ phòng, chúng sống sót tốt hơn khi làm lạnh vừa phải. Khi bảo quản lạnh đông mẫu, nhiệt
Ủ ở 30 – 350C/ 24 giờ Chuẩn bị mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml dung dịch BPW
Đồng nhất mẫu
Cấy 0,1 ml dịch tăng sinh sang ống 10ml môi trường RV. Ủ 420C/ 24 giờ
Cấy ria trên ít nhất 2 môi trường chọn lọc (XLD, HE, SS, BS). Ủ ở 350C / 24 – 48 giờ
Test sinh hóa
Chọn khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường chọn lọc cấy sang BHI Ủ ở 350C / 24 giờ
độ cần đạt đến – 800C. Các động vật 2 mảnh vỏ nên được xử lý theo hướng dẫn của OAOC. Khoảng 10-12 con được lột vỏ vô trùng rồi làm nhỏ tốc độ cao trong vòng 90 giây. Hỗn hợp này được chuẩn bị pha loãng với PSB.
PHƯƠNG PHÁP THƯỜNG SỬ DỤNG TRONG KIỂM TRA VIBRIO
Phương pháp xác định số lượng Vibrio:
1. Chuẩn bị mẫu:
- Cân 50 g mẫu hải sản. Đối với mẫu cá lấy mô bề mặt, mang và ruột cá. Đối với thủy sản có vỏ, phải lấy cả phần dịch và thịt (thường dùng 12 con cho một mẫu). Đối với tôm sử dụng nguyên con, nếu quá lớn kiểm tra phần ruột và mang.
- Thêm 450ml PBS và đồng nhất trong 1 phút ở tốc độ cao.
2. Làm giàu và cấy:
- Chọn 3 nồng độ pha loãng liên tiếp
- Cấy 1ml của từng nồng độ pha loãng vào các ống nghiệm có 10ml APW, mỗi nồng độ 3 ống. Ủ ở 350C trong 18 - 24 giờ.
- Dùng que cấy vòng cấy chuyển dịch nuôi cấy bề mặt APW ria sang TCBS và ủ ở 350C trong 18 - 24 giờ. Nhận diện các khuẩn lạc Vibrio đặc trưng.
- Xác định số các ống dương tính ban đầu và tra bảng cho trường hợp 3 ống nghiệm để có kết quả.
1. Nhận dạng các chủng nghi ngờ dựa vào đặc điểm sinh hóa các chủng phân lập:
Một số đặc trưng tối thiểu để định danh các chủng V. cholerae, V. parahaemolyticus
Phản ứng dương tính Phần trăm Gram âm, hình que, không
sinh bào tử + 100 Oxydase + 100 Kéo sợi ± 100 L – lysine decarboxylase + 100 L – arginine dihydrolase - 0 L – ornithine decarboxylase + 98,9
Phát triển trong canh thang
tryptone 1% a + 99,1
b/ 0c
a
Quy trình tóm tắt kiểm tra V. cholerae/ V. parahaemolitycus
Chuẩn bị mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml dung dịch APW. Đồng nhất mẫu
Phân lập trên TCBS Ủ ở 350C/ 24 giờ
Test sinh hóa khẳng định
Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy ria sang TSA – 2% NaCl. Ủ ở 350C / 24 giờ
Kết luận: Vibrio cholerae/ V. parahaemolitycus
Quy trình tóm tắt xác định số lượng Vibrio
Chuẩn bị mẫu: Cân 50g mẫu + 450ml dung dịch PBS Đồng nhất mẫu
Cấy 1ml mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng vào 10 ml APW. Mỗi nồng độ cấy 3 ống nghiệm. Ủ ở 350C/ 24 giờ
Nhận diện và đếm số ống APW dương tính (đục)
Nhận diện Vibrio đặc trưng và làm test sinh hóa khẳng định Cấy ria các ống dương tính trên môi trường chọn lọc TCBS.
Ủ ở 350C / 24 giờ
Xác định số ống dương tính và tra bảng Mac Crandy. Pha loãng mẫu 10-1, 10-2, 10-3
Bài 13: STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Staphylococcus aureus là vi sinh vật nhạy cảm cao với sự xử lý nhiệt và hầu hết các
chất làm vệ sinh và diệt khuẩn. Vì vậy sự có mặt của vi khuẩn này hoặc độc tố ruột của nó trong thực phẩm thể hiện quá trình vệ sinh kém.
Phương pháp đếm khuẩn lạc:
Một số thử nghiệm:
Các đặc điểm đặc trưng của S. aureus và S. epidermidis
Đặc điểm S. aureus S. epidermidis
Hoạt tính Catalase + +
Sản xuất Coagulase + -
Sản xuất Thermonuclease + -
Nhạy cảm với Lysostaphin + +
Sử dụng kỵ khí: Glucose Mannitol + + + -
Quy trình tóm tắt kiểm tra S. aureus
BACILLUS CEREUS
Chuẩn bị mẫu: Cân 25g mẫu + 225ml dung dịch đệm phosphate Đồng nhất mẫu
Cấy 1ml mẫu ở mỗi nồng độ pha loãng cấy vào 3 đĩa BP. Trang đều dịch mẫu trên bề mặt thạch. Ủ ở 350C/ 24 giờ
Chọn đĩa có chứa 20 – 200 khuẩn lạc đặc trưng và đếm số lượng khuẩn lạc
Test sinh hóa khẳng định. Xác định tỷ lệ S. aureus. Cấy ria 5 khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường TSA.
Ủ ở 350C / 24 giờ
Tính toán mật độ S. aureus (CFU/g-ml) Pha loãng mẫu 10-1, 10-2, 10-3…
TÀI LIỆU THAM KHẢO