tạo dòng ruồi giấm chuyển gen uch -l1 nhằm ứng dụng trong nghiên cứu và hướng tới sàng lọc thuốc chữa bệnh parkinson

C GIA TP. H CHÍ MINH Y BAN NHÂN DÂN TP.HCM C T NHIÊN S KHOA HC VÀ CÔNG NGH BÁO CÁO NGHIM THU C  tài: TO DÒNG RUI GIM CHUYN GENE uch-l1 NHM NG DNG TRONG NGHIÊN CU VÀ NG TI SÀNG LC THUC CHA BNH PARKINSON CH NHI TÀI NG TH O  C GIA TP. H CHÍ MINH Y BAN NHÂN DÂN TP.HCM C T NHIÊN S KHOA HC VÀ CÔNG NGH BÁO CÁO NGHIM THU C Tên  tài: TO DÒNG RUI GIM CHUYN GENE uch-l1 NHM NG DNG TRONG NGHIÊN CU VÀ NG TI SÀNG LC THUC CHA BNH PARKINSON CH NHI TÀI (Ký tên) NG TH O N LÝ  TRÌ u xác nhn) u xác nhn) THÀNH PH H CHÍ MINH THÁNG 11/ 2011 i TÓM T TÀI Bnh Parkinson gây ra do s thóai hóa ca các t bào thn kinh kim sóat s vp. Các t bào thn kinh này sn xut dopamin  mt cht có vai trò quan trng trong s truyn tín hiu gia các t ng dopamin trong não gia b thiu hi bnh s có các triu chng nh ng chm, tay chân ct b lit bnh khá ph bin vi t l mc bnh khang 100/100 ang 20/100 i mi mc bnh. Tuy tình hình bnh hin nay rt ph bin và nghiêm trng, ng nghiên cu v nguyên nhân gây bnh, liu pháp phòng bnh, các mô hình nghiên c mô phng và tr bnh vi nhi. Gc thit l ng vt có kiu hình bnh PD, các nghiên cc tip cn theo ng phát hin nht bin s di truyn ca mt s kiu bnh  góp phn hi  phân t ca bnh PD (Nature, 404, 394-398, 2000; Annu. Rev. Genet, 39, 153-171, 2005; J. Pharma. Exp. Therapeutic, 300, 91  96, 2002). Mng vt b bnh PD còn có th c dùng cho vic sàng lc các hp cht hóa hc có hat tính tr bnh PD (J. American Soci. Exp. NeuroTherapeut., 2, 3, 438-446, 2005). Mô hình chut chuyc s dng rng r nghiên cu các bng tn tin và cn nhiu thi gian. Mt khác, sau khi d án b c thc hin hoàn tt, vic so sánh d liu b gene ci và ca rui gim, Drosophila, cho thy có khang 70% gene bnh  ng và bo tn  rui gi  bu s dng mô hình rui gim chuyn gene trong nghiên cu bnh  i. Mô hình rui gim chuyn gene cho phép nghiên cu và mô phng mt cách rõ ràng mng  u hòa s biu hin ca gene gây bnh. Mô hình này m là r tin, thi gian thí nghim ngc ng dng khá r nghiên cu bi (Annu. Rev. Genet, 39, 153-171, 2005; J. ii Pharma. Exp. Therapeutic, 300, 91  96, 2002, J. American Soci. Exp. NeuroTherapeut., 2, 3, 438-446, 2005).  c thc hin và to các dòng rui gim mang các phc hp gene cho phép knock-down gene duch nhng ti vic nghiên c sinh hc phân t bng dng trong sàng lc thuc tr bnh Parkinson. Mt khác, mc dù Drosophila c bit mô hình nghiên cu di truyc bit là di truyn phân tc s dng làm mô hình nghiên cu di truyn phân t ti Vit Nam. Do vy, vic thc hi tài này ngoài ving kt qu nghiên cu khoa hc mi vi th gii còn góp phn xây dng mc nghiên cu mc quan tâm nghiên cu mnh trên th gi c thit lp ti Vit Nam. Nhm thc hin m   Phân tích in silico và thit k các h thng vector phc v cho vic to dsRNA: Trong nn và phân tích các d liu v gene, protein UCH-L1  ng vi protein UCH-L1  i (protein CG4265, ký hiu dUCH), protein này có s  ng (45.9%) và ging (75.7%) v cu trúc và cha protein UCH-L1  i và protein dUCH . Chúng t  ã phân tích và d     a n bnh Parkinson. Kt qu phân tích cho thy UCH-L1 có mi liên quan vi nhic công b là nguyên nhân gây bn bnh Parkinson. thu nhn gene mã hóa cho protein dUCH và to thành công 4 vector phc v cho vic knock-down gene duch  rui gim (vector pB/NdUCH; pB/CdUCH; pUAST/NdUCH; pUAST/CdUCH)   kim tra hiu qu knock- down ca các cu trúc ds RNA dUCH trong dòng t bào S2 ca rui gim. Kt qu kim tra cho tht k cho hiu qu knock down gene duch tt. iii  To dòng biu hin protein dUCH trong E. coli và to kháng th kháng dUCH: Nhm thu nhn kháng th kháng dUCH phc v cho mc tiêu phân tích kim tra s biu hin gene duch    o dòng và biu hin thành công protein dUCH trong E. coli. n và tinh ch thành công protein dUCH và s dng     này nh   ng min dch trên th. Chúng tôi thu nhn kháng th kháng dUCH và ki chuyên bi   nhy ca kháng th bng phn ng Wesern Blot và phn ng Elisa trên protein tái t hc và trên tng protein thu nhn t rui gim. Kt qu cho thy, kháng th c to thàn nhy,  chuyên bit cao.  To các dòng rui gim chuyn gene mang phc hp UAS-IR-dUCH và ng mô: Các vector mang và to dsRNA cho gene duch c chuyn vào rui gim bng c, thun chng các dòng rui này và tc 02 dòng rui chuyn gene mang phc hp UAS-IR.dUCH (ký hiu 24-8 và 26-9). S dng các phép lai v nh v phc hp UAS-IR.dUCH trên nhim sc th rui gim chuyn gene. Kt qu cho thy các phc hp UAS-IR-dUCH nm trên nhim sc th s 3 ca rui gim. Dòng 24-ng hp và dòng 26-9 là dòng d hp. Chúng tôi kho sát hiu qu knock dowm gene dUCH trong rui gim chuyn gene mang phc hp UAS-IR.dUCH kt hp vi Gal4. Kt qu kho sát cho thy các dòng rui chuyn gene có kh i vi dòng rui 24-i vi dòng rui 26-9. ng ti mô mt (và mô não) và kho sát ng biu hin trên kiu hình ca rui gim chuyn gene. Kt qu cho thy: iv a. Knock down dUCH gây bng trong quá trình phát trin mt rui, s bng ca t bào, bit hóa t bào và quá trình apoptosis. b. Knock down dUCH làm gim kh   ng ca rui gim chuyn gene. S gim kh          ng sinh tng hp dopamine ti các t bào thn kinh sn sinh dopamine.  Các công b khoa hc và sn pho Cùng vi các kt qu nghiên c o 04 c nhân sinh hc và CNSH và 01 Thc (02 Thn hành). Các kt qu nghiên c c tng hp và công b trong 01 bài báo khoa hc, 01 báo cáo ti hi nghn bin ti tp chí CNSH và 01 i tp chí quc t. v SUMMARY Parkinson disease (PD) is a kind of chronic nervous diseases, caused by the degeneration of brain cells responsible for motor skills. These brain cells produce dopamine  an important substance functioned as neurotransmitter. Whe level in the midbrain is insufficient, the patient will have symptoms such as difficulty in walking, slowness of movement, rigidity or stiffness in the limbs and jaw, tremor. This is a kind of common disease with the rate about 100/100 000, and there are 20/100 000 new patients annually. Although this is a common, wide spread and dangerous disease, studies on the  yet given the expected results. Many important questions about PD still do not have satisfied explanation. Recent studies start to move to find single mutations related to the hereditary of several PD, help us to have clearer understanding on the molecular mechanism of PD through the establishment of research models using genetically modified animals carried PD phenotype (Nature, 404, 394-398, 2000; Annu. Rev. Genet, 39, 153-171, 2005; J. Pharma. Exp. Therapeutic, 300, 91-96, 2002). This method, not only can satisfy the requirements of biology molecular researches for the causing mechanism of the disease, it can also help us to proceed to the screening for chemical substances which have curable activity (J. Americam Soci. Exp. NeuroTherapeut., 2, 3, 438-446, 2005). The genetically modified mouse model has been widely used to study human diseases. However, this model has high cost and time consuming. One of the biological models can be used as a model for human diseases is the genetically modified fruitfly model, Drosophila. This is an effective model for wide screening disease genes with low cost and time saving. In this model, we can study and mimic clearly the related genes, and modulate the disease gene. With these advantages, the genetically modified fruitfly model has been used in human diseases researches (Annu. Rev. Genet, 39, 153- vi 171, 2005; J. Pharma. Exp. Therapeutic, 300, 91-96, 2002; J. America Soci. Exp. NeuroTherapeut, 2, 3, 438-446, 2005). In this research, we purposed to establish some transgenic Drosophila lines carry cassettes gene which can be used for knocking down duch gene. The transgenic fly lines can be use for further research on Parminson disease molecular mechanism. In addition, the results from this project can also be seen as the premise for using fruitfly model to screen potential natural substances for treatment of PD. Moreover, Drosophila has been known by researchers all over the world as a hereditary research model, especially molecular hereditary. Many published papers based on Drosophila researches have been showed to have great contribution to human beings. However, the molecular hereditary models in Vietnam almost have not yet been developed. Therefore, besides taking the above research idea, we are carrying this project with the wish to start creating a new research field in Vietnam, which is essential research field had been established long time ago in many countries in the world. In this project, we:  In silico analyzing and constructing some vector which carry and produce dsRNA for duch gene We used bioinformatics to identify human UCH-L1 homologue in Drosophila (the CG4265 protein, named dUCH). The protein has 45.9% identity and 75.7% similarity to the UCH-L1 protein. Based on some previous scientific data we predict UCH-L1 protein interaction network in order to find out some candidates for our research in understanding Parkinson disease mechanism. After finding out UCH-L1 homologue in Drosophila we then constructing some vector which carry duch gene fragments and enable to produce dsRNA in vitro or in vivo vector pB/NdUCH; pB/CdUCH; pUAST/NdUCH; pUAST/CdUCH). vii Knocking-down ability of those designed dsRNA fragments were examined and verified by realtime PCR and Western Blot. Our experimental data revealed that the dsRNA duch strongly reduced mRNA duch level and gene expression.  Constructing of dUCH expressing vector and producing dUCh antibody We constructed a vector which carries duch cDNA gene and expresses the gene in E. coli. In the vector, duch cDNA was fused to 6xHis DNA fragment in order to produce fusion protein named 6xHis-dUCH. The 6xHis  dUCH fusion protein was collected and purified by NiTA column. We then used the above purified protein to immunize rabbit in order to produce dUCh antibody. After immunization, we collected serum from the immunized rabbits and check the dUCH antibody by western blot and Elisa. Our data clearly showed that the collected dUCH antibody is specific.  Establishment of transgenic Drosophila lines carry UAS-IR-dUCH cassette gene and tissue specific knock down duch gene Vectors carry the UAS-IR-dUCH cassette gene fragment was microinject into fertilized fly embryos in order to produce dsRNA duch in transgenic flies. We screened transgenic flies and made pure fly lines. We finally collected 02 transgenic fly lines named 24-8 and 26-9.We then crossed the lines with balancer to identify chromomal linkage. Our results showed the UAS-IR.dUCH cassette gene located on third chromosome. Line 24-8 is homogenous and line 26-9 is heterogeneous. We analyzed knock down dUCH effect in transgenic fly which carry both UAS- IR.dUCH and Gal4. Our data revealed that duch gene was knock down 36% in 24-8 line and 73% in 26-9 line. We specifically knock-down duch gene in Drosophila eye or brain by using GMR-Gal4 or Ddc-Gal4, respectively. We then analyzed transgenic knock down fly phenotype. Our results showed: viii a. Knock down dUCH caused rough eye phenotype. It resulted from an abnormal eye development which related to apoptosis, photo receptor cell differentiation and proliferation. b. Knock down dUCH reduced Drosophila mobility and the reduction involved to dopamine synthesis pathway through tyrosine hydroxylase.  Publications and Training Beside the above experimental results, this research project also contributed in training 04 Bachelor of Biology and Biotechnology; 03 Master of Biology (02 going on). We already published 01 paper, 01 conference publication, 02 revising papers in Journal of Biotechnology; 01 submitted in international journal. [...]... -Sử dụng các kỹ thuật vi - Các dòng ruồi chuyển tiêm để đưa gene mục tiêu gene mang gen mục vào trứng ruồi giấm tiêu 2 - Thuần chủng các dòng ruồi chuyển gene, định vị gene mục tiêu trong cơ thể ruồi giấm chuyển gene 02 dòng ruồi mang các phức hợp gene sinh UAS-dsRNA/duch và tạo dsRN trong cơ thể ruồi giấm (dòng dUCH IR 3 và dòng dUCH IR 3-TM3) Các dòng ruồi - 01 dòng ruồi đồng hợp mang chuyển gene... 79 Bảng 4.1 Danh sách các dòng ruồi mang phức hợp gene UAS-IR.Duch 83 Bảng 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của knock-down dUCH tại các mô khác nhau trên ruồi giấm chuyển gene bằng kỹ thuật biểu hiện gene định hướng mô sử dụng phức hợp Gal4-UAS 92 xvii PHẦN MỞ ĐẦU 1 Tên đề tài: Tạo dòng ruồi giấm chuyển gene uch- l1 nhằm ứng dụng trong nghiên cứu và hướng tới sàng lọc thuốc chữa bệnh Parkinson 2 Chủ nhiệm đề tài:... in vitro và in vivo và kiểm tra 3 Tạo kháng thể kháng dUCH sử dụng cho mục đ ch phân t ch sự biểu hiện gene duch 4 Tạo các dòng ruồi giấm chuyển genemang phức hợp gene cho phép knock-down gene duch 1 Sử dụng kỹ thuật vi tiêm để đưa gene mục tiêu vào trứng ruồi giấm 2 Thuần chủng các dòng ruồi chuyển gene, định vị gene mục tiêu trong cơ thể ruồi chuyển gene 3 Kiểm tra hiệu quả knock-down gene duch 5 Knock-down... protein UCH- L1 của người ở ruồi giấm 48 NỘI DUNG 2: Sử dụng các kỹ thuật thao tác trên gene để dòng hóa gene mục tiêu vào các vector 50 2.1 .Tạo dòng gen Nduch và CdUCH vào plasmid pBluescript II KS (+) 50 2.2 .Tạo dòng gen Nduch và Cduch vào plasmid pUAST 59 2.3 Knockdown dUCH ở tế bào S2 64 NỘI DUNG 3: Tạo kháng thể kháng dUCH 67 3.1 .Tạo dòng tế bào E.coli tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein dUCH 67... hợp gene UAS-dsRNA/duch chủng - 01 dòng ruồi dị hợp mang phức - Bảng tổng hợp các dữ hợp gene UAS-dsRNS/duch với liệu về vị trí gene mục balancer TM3 tiêu trên các dòng ruồi - Bảng tổng hợp dữ liệu về vị trí chuyển gene phức hợp gene chèn trên bộ gene ruồi giấm chuyển gene và kiểu gene của các dòng ruồi chuyển gene được tạo thành 3 - Knock-down gene mục tiêu - Bảng tổng hợp các dữ trong ruồi giấm chuyển. .. hợp UAS- R.dUCH và định vị phức hợp gene này trên nhiễm sắc thể ruồi giấm chuyển gene x 83 4.2.Kiểm tra hiệu quả knock-down gene dUCH trong ruồi chuyển gene mang phức hợp UAS-IR.dUCH 84 NỘI DUNG 5: Knock down gene mục tiêu trong ruồi giấm chuyển gene bằng kỹ thuật RNAi 86 5.1.Knock-down dUCH định hướng tại mô mắt với dòng ruồi GMR_GAL4 86 2.Knock-down dUCH định hướng tại mô não với dòng ruồi Ddc-GAL4... knock-down gene duch 5 Knock-down gene mục tiêu trong ruồi giấm chuyển gene 6 Kiểm tra và phân tích kiểu hình của dòng ruồi đã knock-down gene mục tiêu -1- 2 Sản phẩm của đề tài - 02 dòng ruồi chuyển gene mang cấu trúc gene để knock-down gene duch - Kháng thể kháng dUCH - Các dòng ruồi thử nghiệm knock down gene duch - Các dữ liệu phân tích kết quả knock-down gene duch trong ruồi giấm - 05 công bố khoa học... TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 1 Bệnh Parkinson và tình hình nghiên cứu 6 2 Mối quan hệ giữa protein dUCH-L1 và bệnh Parkinson 7 3 Bệnh Parkinson và con đường sinh tổng hợp dopamine 12 4 Nghiên cứu cơ chế bệnh trên mô hình ruồi giấm 16 5 RNAi ( RNA interference) – kỹ thuật knock down gen 20 6 Các phương pháp khảo sát và đánh giá mô hình bệnh Parkinson 23 7 Kỹ thuật chuyển gene ở ruồi giấm 24 PHẦN II VẬT LIỆU... tiền và cần nhiều thời gian Mặt khác, sau khi dự án bộ gen người đã được thực hiện hoàn tất, việc so sánh dữ liệu bộ gene của người và của ruồi giấm, Drosophila, cho thấy có khỏang 70% gene bệnh ở người có gene tương đồng và bảo tồn ở ruồi giấm [26] Trên cơ sở đó, các nhà khoa học đã bắt đầu sử dụng mô hình ruồi giấm chuyển gene trong nghiên cứu bệnh ở người Mô hình ruồi giấm chuyển gene cho phép nghiên. .. - Tạo kháng thể kháng UCH- L1 của ruồi giấm - Dòng vector biểu hiện - Dòng vector biểu hiện gene mã gene mã hóa cho protein hóa cho protein tương đồng với tương đồng với UCH- L1 UCH- L1 của người ở ruồi giấm của người ở ruồi giấm 1 -Tìm ra protein tương đồng của UCH- L1 của người ở ruồi giấm - Mức độ tương đồng của các - Mức độ tương đồng của protein các protein - Trình tự gene dùng để knock- Trình tự gene . ng vi protein UCH- L1 ci  rui gim 48 NI DUNG 2: S dng các k thu dòng hóa gene mc tiêu vào các vector 50 2.1.To dòng gen Nduch và CdUCH vào plasmid pBluescript. dòng gen Nduch và Cduch vào plasmid pUAST 59 2.3. Knockdown dUCH  t bào S2 64 NI DUNG 3: To kháng th kháng dUCH 67 3.1.To dòng t bào E.coli tái t hp mang gen mã hóa cho protein dUCH. KHOA HC VÀ CÔNG NGH BÁO CÁO NGHIM THU C  tài: TO DÒNG RUI GIM CHUYN GENE uch- l1 NHM NG DNG TRONG NGHIÊN CU VÀ NG TI SÀNG LC THUC CHA BNH PARKINSON