nghiên cứu tác dụng của cao linh chi ( ganoderma lucidum) trong việc phục hồi tình trạng suy giảm bạch cầu gây bởi các thuốc kháng ung thư

Thử nghiệm thăm dò tác động gây suy giảm tổng lượng bạch cầu của các thuốc hóa trị ung thư để xây dựng mô hình suy giảm bạch cầu được thực hiện trên buồng đếm Neubauer.. Trên mô hình gây

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM

SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

BÁO CÁO NGHIỆM THU

(Đã chỉnh sửa theo góp ý của Hội đồng nghiệm thu)

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA CAO LINH CHI (Ganoderma lucidum) trong việc phụ hồi tình trạng suy giảm bạch cầu gây bởi

các thuốc kháng ung thư

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

(Ký tên)

PGS.TS Trần Mạnh Hùng

CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ

(Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận)

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2013

TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Đặt vấn đề

Các thuốc hóa trị liệu ung thư gây tác dụng phụ lên nhiều hệ cơ quan, trong đó suy giảm bạch cầu do hóa trị đôi khi buộc phải ngưng điều trị Đề tài này được tiến hành với mục tiêu “xây dựng các mô hình suy giảm bạch cầu trên chuột nhắt và ứng dụng để đánh giá tác động phòng ngừa suy giảm bạch cầu của cao linh chi và viên nang linh chi OPC”

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, 6-8 tuần tuổi, phái đực, đạt tiêu

chuẩn thử nghiệm Các thuốc hóa trị ung thư như oxaliplatin, 5-FU, paclitaxel, carboplatin, doxorubicin và cyclophosphamid là những dược phẩm đang được sử dụng trên lâm sàng Thử nghiệm thăm dò tác động gây suy giảm tổng lượng bạch cầu của các thuốc hóa trị ung thư để xây dựng mô hình suy giảm bạch cầu được thực hiện trên buồng đếm Neubauer Thử nghiệm xây dựng mô hình suy giảm bạch cầu và đánh giá tác động của linh chi được thực hiện bằng phương pháp xác định các chỉ số bạch cầu trên máy xét nghiệm CELL-DYN 3700 Hàm lượng đường hòa tan trong polysaccharid của cao linh chi được xác định bằng phương pháp phenol-acid sulfuric và hàm lượng đường khử trong polysaccharid của cao linh chi được xác định bằng phương pháp acid 3,5-dinitro salicylic

Kết quả

Polysaccharid của cao linh chi OPC chứa 25,07% đường hòa tan và 9,06% đường khử

Chúng tôi đã xây dựng được 3 mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng phối hợp oxaliplatin (5mg/kg, ip, ngày 0) + 5-FU (50 mg/kg, ip, ngày 0, 1) + leucovorin (50 mg/kg, ip, ngày 0, 1) hoặc bằng phối hợp paclitaxel (20 mg/kg, ip, ngày 0) + carboplatin (75 mg/kg, ip, ngày 0) hoặc bằng phối hợp cyclophosphamid (150 mg, ip, ngày 0) + doxorubicin (5 mg/kg, ip, ngày 0) với chỉ tiêu làm giảm trên 50% tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính và bạch cầu lympho Mô hình cho đáp ứng với thuốc đối chứng là filgrastim ở liều 50 g/kg

Trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng oxaliplatin phối hợp với 5-FU và leucovorin, cao linh chi ở nồng độ 12,5% hay 25% hoặc viên nang linh chi ở liều tương ứng thể hiện tác động

dự phòng và điều trị một phần suy giảm bạch cầu Tuy nhiên, so với filgrastim (50 g/kg), tác động của linh chi thể hiện kém hơn trên các chỉ số tổng lượng bạch cầu và bạch cầu lympho Ngoài ra, linh chi cũng thể hiện tác động dự phòng suy giảm tiểu cầu

Trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid phối hợp với doxorubicin, linh chi và viên nang linh chi thể hiện tác động dự phòng và điều trị suy giảm bạch cầu tùy thuộc liều lượng, trong đó ở nồng độ 25% linh chi thể hiện tác động tốt hơn filgrastim trên các chỉ số tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính và bạch cầu lympho

Chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự về tác động dự phòng và điều trị suy giảm bạch cầu

của linh chi trên mô hình paclitaxel phối hợp với carboplatin

Kết luận

Các mô hình suy giảm bạch cầu đã xây dựng có ý nghĩa về mặt bệnh lý và có tính ứng dụng trong dược lý thực nghiệm để sàng lọc các thuốc dự phòng và điều trị suy giảm bạch cầu do thuốc hóa trị

Linh chi OPC có tác dụng dự phòng và hồi phục một phần tình trạng suy giảm bạch cầu do các thuốc hóa trị gây ra

SUMMARY OF RESEARCH CONTENT

Introduction

Chemotherapeutic agents cause many adverse reactions, of those leukocytopenia is one of the most serious side effects that may delay or postpone chemotherapy In this study, we developed mice models of chemotherapy-induced leukocytopenia and investigated the preventive effects of lingzhi extract and lingzhi preparation manufactured by OPC

Materials and methods

Study was conducted in Swiss albino male mice, 6-8 weeks old and meeting criteria for

experiment Chemotherapeutic agents such as oxaliplatin, 5-FU, paclitaxel, carboplatin, cyclophosphamide and doxorubicin were from pharmaceutical formulations being used clinically

For developing leukocytopenia model, the determination of total white blood cell count was done by Neubauer hemocytometer For investigating the effect of lingzhi in prevention and treatment of leukocytopenia, the determination of white blood cell indices was conducted in hematological analyzer CELL-DYN 3700 We applied phenol-sulfuric acid method for determination of soluble sugars and 3,5-dinitro salicylic reagent for determination of reducing sugars in polysaccharide content of lingzhi extracts

g/kg), a granulocyte-colony stimulating factor, exerted leukocyte-enhancing response

In mouse model of leukocytopenia induced by oxaliplatin plus 5-FU and leucovorin, lingzhi extracts at concentration of 12.5% or 25% or lingzhi capsule at equivalent doses showed partial prevention and treatment effects However, these responses were weaker on total white blood cell- and lymphocyte count as compared with filgrastim (50 g/kg) In addition, lingzhi also exerted preventive effect on suppression of platelet count

In mouse model of leukocytopenia induced by cyclophosphamide plus doxorubicin, lingzhi extract and lingzhi capsule showed a dose-dependent response on prevention and treatment of leukocytopenia, of those, the concentration 25% showed better response toward filgrastim

We also obtained similar result of the effect of lingzhi in prevention and treatment of leukocytopenia in paclitaxel plus carboplatin model

Conclusions

Leukocytopenia models mentioned above represented a significance in term of pathology and application in pharmacological experiment for screening drug candidates in prevention or treatment of chemotherapy-induced leukocytopenia

Lingzhi extract and preparation manufactured by OPC exerted partly preventive and recovering effects in leukocytopenia mice caused by chemotherapy

Key words: Lingzhi OPC, oxaliplatin, 5-FU, carboplatin, paclitaxel, cyclophosphamide,

doxorubicin, leukocytopenia

1.1.1 1.1.1 Đặc điểm chủng loại và mô tả cây 4

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu về linh chi (G lucidum) thuộc lĩnh vực đề tài 7

1.5 Các mô hình gây suy giảm bạch cầu thực nghiệm 17

1.5.1 Phối hợp oxaliplatin với 5-FU và leucovorin 18

1.5.2 Phối hợp paclitaxel và carboplatin 23

1.5.3 Phối hợp cyclophosphamid và doxorubicin 25 1.6 Cơ sở nghiên cứu tác dụng phục hồi tình trạng suy giảm bạch cầu của linh chi

trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng thuốc hóa trị ung thư

28

2.1 Nội dung 1: xác định hàm lượng đường hòa tan và đường khử trong

polysaccharid của cao khô linh chi OPC

30

2.2 Nội dung 2: Khảo sát mức độ gây suy giảm bạch cầu của 3 phối hợp oxaliplatin/5-FU/leucovorin, paclitaxel/carboplatin và cyclophosphamid/doxorubicin

33

2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mức độ gây suy giảm bạch cầu của oxaliplatin phối hợp 5-FU và leucovorin trên chuột nhắt

33

2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát mức độ gây suy giảm bạch cầu của carboplatin

và paclitaxel trên chuột nhắt

35

2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát mức độ gây suy giảm bạch cầu của

cyclophosphamid và doxorubicin trên chuột nhắt

36

2.3 Nội dung 3: Xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng 5-FU, oxaliplatin và leucovorin trên chuột nhắt

38

2.4 Nội dung 4: Khảo sát tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng oxaliplatin phối hợp 5-FU và leucovorin

39

2.5 Nội dung 5: Xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng carboplatin

và paclitaxel

40

2.6 Nội dung 6: Khảo sát tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng carboplatin + paclitaxel

41

2.7 Nội dung 7: Xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid và doxorubicin

42

2.8 Nội dung 8: Khảo sát tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid và doxorubicin

43

CHƯƠNG III: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 Nội dung 1: Xác định hàm lượng polysaccharid, đường khử và đường hòa tan 44

3.1.1 Kết quả xác định hàm lượng polysaccharid 44

3.1.2 Kết quả xác định hàm lượng đường hòa tan trong polysaccharid 44

3.1.3 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trong polysaccharid 45 3.2 Nội dung 2: Khảo sát mức độ gây suy giảm bạch cầu của 5-FU, oxaliplatin,

carboplatin, paclitaxel, cyclophosphamid và doxorubicin

46

3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát mức độ gây suy giảm bạch cầu của 5-FU và

oxaliplatin trên chuột nhắt

46

3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát mức độ gây suy giảm bạch cầu của carboplatin

và paclitaxel trên chuột nhắt

49

3.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát mức độ gây suy giảm bạch cầu của

cyclophosphamid và doxorubicin trên chuột nhắt

51

3.3 Nội dung 3: Xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng 5-FU, oxaliplatin

và leucovorin trên chuột nhắt

52

3.4 Nội dung 4: Khảo sát tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi trên

mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng 5-FU + oxaliplatin + leucovorin

55

3.5 Nội dung 5: Xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng carboplatin và paclitaxel

61

3.6 Nội dung 6: Khảo sát tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi trên

mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng paclitaxel và carboplatin

63

3.7 Nội dung 7: Xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid

và doxorubicin

69

3.8 Nội dung 8: Khảo sát tác dụng phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi trên

mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid và doxorubicin

DNA Desoxynucleotide acid (acid deoxynucleotid)

DANH SÁCH BẢNG

1.1 Các hoạt chất chính của linh chi và tác dụng dược lý thực nghiệm 6 1.2 Các giá trị bình thường của bạch cầu ở người 9

1.4 Thời điểm tác động của các thuốc hóa trị trong chu kỳ tế bào 14 1.5 Phân độ suy giảm bạch cầu theo Viện Ung thư Quốc gia Mỹ

(NCI)

14

3.1 Kết quả định lượng polysaccharide trong cao khô linh chi OPC 44 3.2 Kết quả xác định hàm lượng đường hòa tan trong mẫu thử 45 3.3 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trong mẫu thử 46 3.4 Tổng lượng bạch cầu và các loại bạch cầu ở các lô thử nghiệm

xây dựng mô hình oxaliplatin + 5-FU + leucovorin

53

3.5 Tổng lượng bạch cầu và các loại bạch cầu ở các lô thử nghiệm tác

động dự phòng và điều trị của cao linh chi, viên nang linh chi trên mô

hình gây suy giảm bạch cầu bằng oxaliplatin + 5-FU + leucovorin

57

3.6 Tác động của linh chi đến số lượng hồng cầu và tiểu cầu trên mô

hình gây suy giảm bạch cầu bằng oxaliplatin + 5-FU +

leucovorin

59

3.7 Tổng lượng bạch cầu và các loại bạch cầu ở các lô thử nghiệm

xây dựng mô hình carboplatin + paclitaxel

61

3.8 Tổng lượng bạch cầu và các loại bạch cầu ở các lô thử nghiệm

tác động dự phòng và điều trị của cao linh chi, viên nang linh chi

trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng paclitaxel +

carboplatin

65

3.9 Tác động của linh chi lên số lượng hồng cầu và tiểu cầu trên mô

hình gây suy giảm bạch cầu bằng paclitaxel + carboplatin

68

3.10 Tổng lượng bạch cầu và các loại bạch cầu ở các lô thử nghiệm

xây dựng mô hình cyclophosphamid + doxorubicin

69

3.11 Tổng lượng bạch cầu và các loại bạch cầu ở các lô thử nghiệm

tác động dự phòng và điều trị của cao linh chi, viên nang linh chi

trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid +

74

DANH SÁCH HÌNH - BIỂU ĐỒ

1.1 Các loại bạch cầu: bạch cầu lympho, bạch cầu ưa kiềm, bạch

cầu ưa acid, bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân

12

3.1 Đường tuyến tính glucose chuẩn trong định lượng đường hòa tan 45 3.2 Đường tuyến tính glucose chuẩn trong định lượng đường khử 46 3.3 Tổng lượng bạch cầu xác định bằng buồng đếm Neubauer của

các lô thử nghiệm sơ khởi trên mô hình oxaliplatin + 5-FU

47

3.4 Tác động gây suy giảm bạch cầu của oxaliplatin, 5-FU và

leucovorin trong thử nghiệm sơ khởi

3.8 Tác động của linh chi lên số lượng tiểu cầu trên mô hình gây

suy giảm bạch cầu bằng oxaliplatin kết hợp với 5-FU và

3.13 Tác động của linh chi lên số lượng hồng cầu trên mô hình

gây suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid + doxorubicin

76

3.14 Tác động của linh chi lên số lượng tiểu cầu trên mô hình gây

suy giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid + doxorubicin

76

PHẦN MỞ ĐẦU

Tên đề tài: Nghiên cứu tác dụng của cao linh chi (Ganoderma Lucidum) trong việc

phục hồi tình trạng suy giảm bạch cầu gây bởi các thuốc kháng ung thư

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Trần Mạnh Hùng

Cơ quan chủ trì: Trung tâm Khoa học công nghệ Dược Sài Gòn (SAPHARCEN)

Thời gian thực hiện đề tài: 20 tháng (từ 04/2012 đến 11/2013

Kinh phí đã cấp: 180.000.000 đồng (Một trăm tám mươi triệu đồng)

theo TB số : 24/TB-SKHCN ngày 13/04/2012

Mục tiêu: (Theo đề cương đã duyệt)

1 Mô phỏng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng các thuốc hóa trị ung thư trên chuột nhắt

2 Khảo sát tác dụng của Linh chi (Ganoderma lucidum) trong việc phục hồi tình

trạng suy giảm bạch cầu gây bởi các thuốc kháng ung thư

Nội dung: (Theo đề cương đã duyệt)

1 Xác định hàm lượng polysaccharid toàn phần trong cao khô linh chi nhằm qui ước liều lượng linh chi sử dụng trong các thử nghiệm dược lý

2 Thiết lập 3 mô hình gây suy giảm bạch cầu thực nghiệm bằng sự phối hợp các thuốc 5-fuorouracil, oxaliplatin, carboplatin, paclitaxel, doxorubicin, và cyclophosphamid trên chuột nhắt dựa trên các phác đồ hóa trị thường sử dụng trong ung thư đại tràng, ung thư phổi và ung thư vú

3 Áp dụng qui trình để đánh giá tác dụng của Linh chi trên từng loại thuốc gây suy giảm bạch cầu nhằm chứng minh tác dụng của Linh chi trên từng thông số: tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính, tiểu cầu và hồng cầu

Những nội dung đã thực hiện ở giai đoạn 1 (đối chiếu với hợp đồng đã ký):

1 Xác định hàm lượng polysaccharid

toàn phần trong cao khô Linh chi

(do Công ty cổ phần Dược phẩm

OPC cung cấp)

Đã xác định được hàm lượng đường hòa tan

và hàm lượng đường khử của polysaccharid làm cơ sở tiêu chuẩn cho thí nghiệm dược lý

2 Khảo sát mức độ gây suy giảm

bạch cầu của 5-FU, oxaliplatin,

carboplatin, doxorubicin,

paclitaxel, cyclophosphamid

Đã xác định được liều lượng, thời gian phù hợp cho việc xây dựng mô hình

3 Xây dựng mô hình gây suy giảm

bạch cầu bằng 5-FU + oxaliplatin

Đã xây dựng được mô hình: giảm >50% tổng lượng bạch cầu; giảm có ý nghĩa bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho

4 Khảo sát tác dụng phòng ngừa suy

giảm bạch cầu của linh chi trên mô

hình gây suy giảm bạch cầu bằng

6 Khảo sát tác dụng phòng ngừa suy

giảm bạch cầu của linh chi trên mô

hình gây suy giảm bạch cầu bằng

carboplatin + paclitaxel

Đã xác định tác dụng dự phòng và điều trị

của cao linh chi và chế phẩm linh chi

7 Giám định đề tài Hội đồng giám định thông qua

Những nội dung đã thực hiện ở giai đoạn 2 (đối chiếu với hợp đồng đã ký):

1 Xây dựng mô hình gây suy giảm bạch

cầu bằng Doxorubicin kết hợp

Cyclophosphamid

Đã xây dựng được mô hình gây suy giảm > 50% tổng lượng bạch cầu; giảm có ý nghĩa bạch cầu trung tính, bạch cầu lympho

2 Khảo sát tác dụng phòng ngừa suy giảm

bạch cầu của linh chi trên mô hình gây

suy giảm bạch cầu bằng doxorubicin

kết hợp cyclophosphamid

Đã xác định được tác dụng dự phòng

và điều trị suy giảm bạch cầu của

cao linh chi và chế phẩm linh chi

3 Tổng kết số liệu, viết báo cáo Báo cáo tổng kết

4 Nghiệm thu đề tài cấp cơ sở Báo cáo được Hội đồng nghiệm thu

cấp cơ sở thông qua

5 Nghiệm thu đề tài cấp thành phố Báo cáo được Hội đồng nghiệm thu

cấp thành phố thông qua

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu nấm linh chi

Từ hơn 4000 năm trước nấm linh chi đã được coi như một loại thần dược, chỉ dành riêng cho các bậc vua chúa "Thần nông bản thảo" xếp linh chi vào loại siêu thượng phẩm hơn cả nhân sâm; "Bản thảo cương mục" coi linh chi là loại thuốc quý, có tác dụng bảo can (bảo vệ gan), giải độc, cường tâm, kiện não, tiêu đờm, lợi niệu, ích vị Lý Thời Trân đã viết: “linh chi làm thân thể nhẹ nhõm và gia tăng tuổi thọ,…” Tác dụng của linh chi được cho là tùy vào màu sắc của nấm, loại tốt nhất là loại màu đỏ, hay còn gọi là xích chi (Qi-zhi) với những đặc tính đại bổ và tăng thọ Theo truyền thuyết dân gian Trung Hoa và Nhật, một số người dân đã phải đi vào rừng sâu để tìm cho được linh chi về chữa những bệnh nan y như ung thư Tuy công dụng của linh chi đã được ghi chép trong sổ sách nhưng ít người được thấy, được sử dụng nên linh chi từ lâu vẫn thuộc loại thuốc quý hiếm, chỉ có vua chúa, người giàu mới có thể sử dụng Chỉ trong vòng 20 năm gần đây, có sự hợp tác giữa các nhà khoa học hiện đại với các lương y có kinh nghiệm, tác dụng dược lý của linh chi mới dần dần được sáng tỏ, nhưng vẫn còn nhiều vấn đề chưa thể kết luận chính xác, nên cần phải sử dụng và tiếp tục nghiên cứu tìm hiểu kinh nghiệm của người xưa[2]

1.1.1 Đặc điểm chủng loại và mô tả cây

Tên khoa học: Ganoderma lucidum

Tên đồng nghĩa: Boletus lucidus, Polyporum lucidus

Tên Việt Nam: linh chi, nấm lim, nấm thần tiên, nấm trường thọ

Tên Trung Quốc: ling-zhi

Tên Nhật Bản: reishi

Họ: nấm lim (Ganodermataceae)

Về thực vật, linh chi là nấm hóa gỗ, sống một hoặc lâu năm, có cuống dài hoặc ngắn,

mũ nấm có dạng hình thận, hình tròn hay hình quạt, dày 0,8-1,2 cm, đường kính 3-10

cm Cuống thường không cắm ở giữa mũ nấm mà cắm lệch sang một phía mũ, hình trụ tròn hay dẹt, đường kính 0,5-3 cm, có thể phân nhánh cuống và cuống có thể phân nhánh khác nhau tùy theo loài, loài đỏ thay đổi từ nâu đến đỏ vàng, đỏ cam, mặt trên bóng loáng như đánh vecni, trên mặt mũ có những vân đồng tâm Bào tử nấm hình trứng hay hình bầu dục, cụt đầu, màu gỉ sắt, có một mấu lồi và nhiều gai nhọn Cấu tạo của vỏ ngoài bào tử gồm hai lớp, có thể quan sát được dưới kính hiển vi Lớp ngoài nhẵn, lớp trong có nhiều gai nhỏ, kích thước trung bình của bào tử là 5-6 µm x 8,5-12

µm[2]

1.1.2 Thành phần hóa học

Theo nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới, trong thành phần hóa học của nấm linh chi có gần 100 chất Các nhóm chất và các chất có hoạt tính sinh học là protein, triterpenoi, steroid, alcaloid, nucleotid, axit béo, enzym và các nguyên tố vi lượng Đặc biệt trong linh chi có các hoạt chất quý như acid ganoderic, germanium (lớn gấp 20 lần

so với ở nhân sâm) Ngoài ra còn có các nguyên tố vô cơ như Ca, Mg, Na, Mn, Fe, Zn

và Cu

Trong nấm linh chi có một thành phần quan trọng là polysaccharid, một nhánh của arabinoxyloglucan tan trong nước (polysaccharid GL-1), một chất chiết bằng kiềm, các heteroglycan tan trong nước, nhiều heteroglucan không tan trong nước, các ganoderan

A và B, và các glycan A, B, C Nhóm hoạt chất và tác dụng dược lý tương ứng của linh chi được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các hoạt chất chính của linh chi và tác dụng dược lý thực nghiệm

Cyclooctasulfur Ức chế giải phóng histamin[53]

Dẫn xuất adenosin Nucleotid Ức chế kết dính tiểu cầu, giãn cơ[53]

Lingzhi-8 Protein Điều hoà miễn dịch[39,41,43,47,53]

Alcaloid Alcaloid Trợ tim[53]

Ganodosteron Steroid Kháng viêm, giải độc gan[44,76,81]

Acid lanosporeric Steroid Ức chế tổng hợp cholesterol[14,21,34]

Lanosterol Steroid Ức chế tổng hợp cholesterol[14,21,34]

Ganoderans A, B, C Polysaccharid Làm giảm đường huyết[64,72,82]

β-D-Glucan Polysaccharid Chống ung thư, tăng tính miễn

dịch[15,20,23,37,51,77,83]

Polysaccharid Hạ lipid huyết, chống oxy hóa[21,22,78]

Acid ganoderic R, S Triterpenoid Ức chế giải phóng histamin[37]

Acid ganoderic B, D,

F, H, K, Y

Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế men chuyển[53]

Acid ganoderic Triterpenoid Chống khối u, chống di căn [19,40,50,79]

Ganodermadiol Triterpenoid Hạ huyết áp, ức chế men chuyển[53]

Acid ganoderic M, F Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol[14]

Acid ganoderic T, O Triterpenoid Ức chế sinh tổng hợp cholesterol[14]

Lucidone A Triterpenoid Bảo vệ gan[51,76]

Lucidenol Triterpenoid Bảo vệ gan[51,76]

Ganosporelacton A Triterpenoid Chống khối u[40]

Ganosporelacton B Triterpenoid Chống khối u[40]

Dẫn xuất acid oleic Acid béo Ức chế giải phóng histamin[53]

1.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu về linh chi (G lucidum) thuộc lĩnh vực đề tài

1.2.1 Các nghiên cứu ngoài nước

Cho đến nay, trên thế giới có khoảng trên 500 công trình nghiên cứu về Linh chi, tập trung chủ yếu trên 4 lĩnh vực sau: tác dụng điều hòa miễn dịch, tác dụng kháng ung thư, tác dụng trên chuyển hóa (làm giảm glucose huyết, làm giảm cholesterol) và tác dụng chống oxy hóa (giải độc gan, bảo vệ gan, kháng viêm)

Trên miễn dịch: dịch chiết nước của linh chi, đặc biệt là các polysaccharid làm

tăng khả năng thực bào của các đại thực bào in vitro và in vivo[41,53], làm tăng hoạt tính của diệt bào tự nhiên (Natural Killer Cell) và tăng họat tính của diệt bào trên cơ chế gây độc tính tế bào[23,53] Polysaccharid cũng làm tăng sự tổng hợp các cytokin có tác dụng miễn dịch như interleukin-1, yếu tố gây hoại tử khối u (TNF-)[15,51] Khi sử dụng linh chi trên ngựa, linh chi cũng làm tăng số lượng các tế bào lympho T như CD5+, CD4+, và CD8+, cũng như làm tăng các kháng thể đặc hiệu[47] Trên lympho B, thành phần polysaccharid của linh chi có tác dụng làm tăng sản xuất, hoạt hóa và biệt hóa lympho B

Trên ung thư: hầu hết các nghiên cứu về khả năng chống khối u của linh chi tập

trung trên thành phần triterpenoid, đặc biệt là các dẫn xuất của acid ganoderic Chen và cộng sự (2008) đã chứng minh rằng acid ganoderic Me có khả năng ức chế sự xâm lấn của dòng tế ung thư phổi[19] Acid ganoderic T cũng gây apoptosis trên dòng tế bào ung thư phổi[79] Phân đoạn chứa acid ganoderic có khả năng ức chế sự phát triển và xâm lấn của dòng tế bào ung thư vú[40] Acid ganoderic X có tác dụng ức chế topoisomerase

và gây apoptosis trên các dòng tế bào ung thư[50] Linh chi cũng có tác dụng ức chế sự tạo mạch máu trong khối u và ức chế sự tiết các yếu tố kích thích sự tạo mạch[77]

Trên chuyển hóa: dịch chiết nước của linh chi có tác dụng làm giảm glucose huyết

ở chuột bị tiểu đường týp 2 và chuột được gây béo phì, tuy nhiên lại không có tác dụng trên nồng độ insulin[72] Ở mô hình gây tăng đường huyết bằng streptozocin trên chuột cống[64], hay bằng alloxan trên chuột nhắt[82], thành phần polysaccharid của linh chi đều

có tác dụng làm giảm glucose huyết Ling Zhi-8 (LZ-8), một protein có hoạt tính tăng

cường miễn dịch trong linh chi cũng có tác dụng ngăn ngừa viêm tụy và phục hồi số lượng tế bào tiết insulin trên mô hình đái tháo đường týp 1 (lệ thuộc insulin) trên chuột nhắt[43] Trên mô hình chuột cống gây tăng lipid huyết, polysaccharid của linh chi có tác dụng làm giảm hàm lượng cholesterol toàn phần, triglycerid, làm tăng HDL và ức chế quá trình peroxide hóa lipid[21] Ganoderol A, ganoderol B, và acid ganoderic Y có

tác dụng ức chế sự sinh tổng hợp cholesterol vitro, ex vivo và cả in vivo[14,34]

Trên tác động chống oxy hóa và kháng viêm: thành phần polysaccharid từ linh chi

có tác dụng làm tăng hoạt tính các hệ enzym chống oxy hóa như GSH-Px và SOD trên chuột nhắt[21] Dịch chiết cồn của linh chi có tác dụng làm tăng hoạt tính của các hệ enzym chống oxy hóa như manganese-superoxide dismutase (Mn SOD), glutathione peroxidase (GPx), glutathione-S-transferase (GST) và catalase (CAT) trong ti thể của

tế bào tim và não chuột cống[78], làm giảm nồng độ các gốc tự do (qua các phương pháp định lượng MDA, DPPH và FRAP) và làm tăng hàm lượng GSH trong tế bào gan chuột[22] Thành phần triterpenoid và steroid của linh chi có tác dụng ức chế sự phóng thích các chất trung gian hóa học gây viêm từ tế bào mast, bạch cầu trung tính và đại thực bào[44] Trên gan chuột, dịch chiết linh chi có tác dụng bảo vệ, phòng ngừa xơ gan

do CCl4 và thioacetamid gây ra[81], bảo vệ tổn thương gan gây bởi D-galactosamin[76] Ngoài ra acid ganoderic trong linh chi cũng có tác dụng chống viêm gan gây bởi CCl4, BCG và cả siêu vi B trên chuột[52]

1.2.2 Các nghiên cứu trong nước

Ở Việt nam, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về linh chi, ở đây chúng tôi chỉ đề cập đến một số nghiên cứu gần đây nhất Trong linh chi Việt nam, quả thể và nấm thể đều chứa các enzym chống oxy hóa như catalase, superoxid dismutase và NADH oxidase[7] Dịch chiết nước của linh chi có tác dụng làm hạ lipid huyết[6] Thành phần polysaccharid chiết xuất từ linh chi đỏ có tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan trên mô hình gây stress oxy hóa bằng CCl4 trên chuột nhắt[3] Trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid, dịch chiết nước, dịch chiết cồn từ nấm linh chi và thành phần polysaccharid của nấm này cũng có khả năng tăng cường lại hệ miễn

dịch đã bị suy giảm[4] Cao nước linh chi có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây tổn thương gan bằng rifampicin và isoniazid trên chuột nhắt[8] Linh chi cũng có tác dụng bảo vệ gan trên mô hình gây nhiễm độc gan cấp tính bằng CCl4 và cả trên mô hình gây loạn sản tế bào gan trên chuột nhắt[9,10] Trên tủy xương, cao chiết nước của linh chi có tác dụng phục hồi tình trạng suy tủy gây bởi methotrexat[12]

1.3 Các dòng bạch cầu

Bạch cầu là những tế bào có nhân được tạo thành trong tủy xương Sau khi được tạo thành, bạch cầu lưu thông trong máu tuần hoàn chung để tham gia bảo vệ cơ thể Bạch cầu có ba đặc tính cơ bản là khả năng xuyên mạch, chuyển động bằng chân giả và tính hóa hướng động Những nơi viêm thường tập trung nhiều bạch cầu, tại đó bạch cầu dùng chân giả bắt giữ các vi khuẩn và mảnh tế bào chết Khi các vật lạ lọt vào bào tương của bạch cầu, như một túi thực bào, các enzym của bạch cầu (oxidase, peroxidase, catalase, lipase, amylase) sẽ tiêu hóa chúng Thực bào là chức năng quan trọng nhất của bạch cầu đa nhân trung tính và đại thực bào.[5]

Số lượng bạch cầu ở người trưởng thành bình thường dao động từ 4x109/L - 11x109/L

Ở trẻ em và phụ nữ có thai, lượng bạch cầu có thể cao hơn Số lượng bạch cầu tăng trong các bệnh nhiễm khuẩn cấp tính, đặc biệt tăng cao trong các bệnh bạch huyết cấp hoặc mạn tính và giảm trong trường hợp bị nhiễm độc, nhiễm xạ, suy tủy. [5]

Có nhiều cách phân loại bạch cầu, thông dụng nhất là chia thành ba nhóm: bạch cầu hạt (bạch cầu trung tính, ưa acid và ưa kiềm), bạch cầu lympho và bạch cầu đơn nhân

Bảng 1.2 Các giá trị bình thường của bạch cầu ở người[5]

Các loại bạch cầu Giá trị tuyệt đối (trong 1 mm3) Tỷ lệ phần trăm (%) Bạch cầu trung tính 1700 – 7000 60 – 66

Ở chuột, cũng tìm thấy những loại bạch cầu giống ở người Tuy nhiên, tỷ lệ bạch cầu lympho ở chuột cao hơn ở người và bạch cầu ưa kiềm ít khi được tìm thấy trong máu chuột trưởng thành.[38]

Số lượng bạch cầu rất khác nhau tùy thuộc vào gen, giới tính, môi trường và phương pháp lấy máu Ở chuột cái, bạch cầu hạt cao hơn chuột đực Theo nghiên cứu của các nhà khoa học Đại học Michigan, số lượng bạch cầu khi lấy máu ở đuôi chuột thường cao hơn khi lấy máu ở tim Việc lấy máu đuôi nhiều lần cũng có thể làm tăng bạch cầu

từ 50 – 120%.[38]

Bảng 1.3 Công thức bạch cầu ở chuột nhắt[38]

Tổng lượng bạch cầu (trong 1 mm3 máu) 6000 – 15000

1.3.1 Bạch cầu hạt

Bạch cầu hạt (granulocyte) trước đây được gọi là “bạch cầu đa nhân” do nhân tế bào

thắt lại, chia nhiều thùy Bạch cầu hạt gồm ba loại, phân biệt nhờ tính bắt màu phẩm nhuộm khác nhau của các tiểu hạt trong tế bào chất

Bạch cầu trung tính

Là những tế bào trưởng thành trong máu tuần hoàn, chức năng quan trọng là vận động

và thực bào các vật lạ bên ngoài, đặc biệt là vi khuẩn, virus ngay sau khi chúng xâm nhập vào cơ thể Vì vậy, bạch cầu trung tính tăng trong các trường hợp nhiễm trùng cấp như viêm ruột thừa, viêm phổi… Số lượng bạch cầu trung tính cũng có thể tăng gấp 3 - 4 lần so với bình thường sau khi chơi thể thao, vận động nhiều, làm việc nặng Khoảng 60 phút sau, sự tăng bạch cầu sinh lý này sẽ trở lại bình thường

Bạch cầu trung tính giảm trong các trường hợp nhiễm độc kim loại nặng (Pb, As), suy tủy, nhiễm siêu vi, nội độc tố, do thuốc,…[5]

Bạch cầu ưa kiềm

Bạch cầu ưa kiềm không có khả năng vận động và thực bào, nhưng có vai trò quan trọng trong phản ứng quá mẫn do IgE - một globulin miễn dịch gây ra phản ứng dị ứng

có khuynh hướng gắn trên màng bạch cầu ưa kiềm Khi màng bạch cầu vỡ ra, histamin, bradykinin, serotonin được phóng thích vào máu gây ra các triệu chứng phù, ngứa, mẫn đỏ, đau,… Ngoài ra, bạch cầu ưa kiềm còn phóng thích heparin vào máu để phòng ngừa đông máu lòng mạch. [5]

Bạch cầu ưa acid

Bạch cầu ưa acid có vai trò chính là khử độc các protein lạ trước khi chúng xâm nhập vào cơ thể, do đó, thường tăng trong các phản ứng dị ứng, ký sinh trùng Ngoài ra, bạch cầu ưa acid giải phóng plasminogen, chất này được hoạt hóa thành plasmin, làm tan cục máu đông Bạch cầu ưa acid có khả năng thực bào kém hơn bạch cầu trung tính, chủ yếu là thực bào và tiêu hóa các phức hợp kháng nguyên - kháng thể, sau khi quá trình miễn dịch hoàn thành, vì vậy không giữ vai trò quan trọng chống lại sự nhiễm khuẩn. [5]

1.3.2 Bạch cầu lympho

Lympho bào là những tế bào có khả năng miễn dịch, được chia thành hai dòng:

- Dòng lympho bào cảm ứng (lympho T) phân bố ở tuyến ức, có chức năng miễn dịch

tế bào, tiêu diệt các tác nhân xâm lấn

- Dòng lympho bào có chức năng miễn dịch thể dịch (lympho B), phân bố ở gan, lách, các tổ chức bạch huyết ở ống tiêu hóa, chúng có khả năng tạo kháng thể, làm mất hiệu lực của kháng nguyên

1.3.3 Bạch cầu đơn nhân

Bạch cầu đơn nhân là bạch cầu có kích thước lớn nhất trong các tế bào máu tuần hoàn, đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đầu của đáp ứng miễn dịch Bạch cầu đơn nhân trong máu cũng như các bản sao của chúng ở các mô thực bào rồi đưa kháng nguyên

của tác nhân gây bệnh tới trình diện cho tế bào T Bạch cầu đơn nhân trưởng thành có thể biệt hóa thành đại thực bào tại các mô khác nhau của cơ thể

Quá ít hay quá nhiều bạch cầu trong máu đều cho thấy sự rối loạn trong cơ thể

Leukopenia là sự giảm sút số lượng bạch cầu xuống dưới 4000/mm3, làm cho cơ thể

nhạy cảm hơn với các bệnh truyền nhiễm Leukocytosis là sự gia tăng số lượng bạch

cầu lên đến hơn 11000/mm3 máu, đây có thể là sự đáp ứng bình thường của cơ thể để chống lại bệnh truyền nhiễm Tuy nhiên, sự tăng bạch cầu cũng có thể là kết quả của sự điều chỉnh những bạch cầu bị phá hủy, còn non hay không bình thường được phóng thích ra máu. [5]

Hình 1.1 Các loại bạch cầu: a bạch cầu lympho, b bạch cầu ưa kiềm, c bạch cầu ưa

acid, d bạch cầu trung tính, e bạch cầu đơn nhân[5]

1.4 Suy giảm bạch cầu do thuốc

1.4.1 Các thuốc hóa trị ung thư

Các thuốc hóa trị gây độc tế bào là nguyên nhân phổ biến nhất dẫn đến tình trạng suy tủy cấp tính, thường được biểu hiện trên lâm sàng qua sự suy giảm lượng bạch cầu trung tính Mức độ tổn hại tủy xương cũng như sự hồi phục của tủy xương sau đó phụ thuộc vào cơ chế tác động dược lý của các thuốc hóa trị được sử dụng và tỷ lệ hồi phục

của từng dòng tế bào là khác nhau Về mặt lý thuyết, các thuốc gây giảm bạch cầu trung tính có thể ảnh hưởng đến các tế bào gốc đa năng, làm tổn hại các nguyên bào đơn dòng hay đa dòng, sự biệt hóa tế bào và hoặc tác động lên môi trường xung quanh các tế bào khác như màng trong tủy hay chất nền liên kết mô.[73]

Bảng 1.4 liệt kê những thuốc hóa trị thường được sử dụng trong thực hành lâm sàng và thời điểm tác động của nó trong chu kỳ tế bào Hầu hết các thuốc điều trị ung thư đều làm giảm bạch cầu ở những mức độ khác nhau, ngoại trừ steroid - mặc dù nó cũng có thể gây giảm bạch cầu Nhìn chung, những tác nhân này với thời điểm tác động trong suốt những pha chuyên biệt của thời kỳ gián phân gây suy giảm tế bào máu tương đối nhanh (đặc biệt là giảm bạch cầu hạt và sau đó là tiểu cầu) Tuy nhiên, sự hồi phục cũng nhanh chóng, đặc biệt là với những tác nhân tác động trên pha S và pha M như: cytarabin, vinblastin, và methotrexat Tuy nhiên, sự tiêm truyền kéo dài các thuốc hóa trị tác động trên các pha chuyên biệt cũng có thể dẫn đến tình trạng suy tủy xương mạn tính, chứng tỏ rằng thời gian dùng thuốc và đường dùng thuốc có ảnh hưởng đến kiểu tổn hại của tủy xương Những yếu tố tác động lên tình trạng tế bào tủy xương như: tuổi tác của bệnh nhân, mức độ thâm nhiễm tủy xương của tế bào u, các hóa trị và xạ trị đã nhận trước đó, tình trạng dinh dưỡng cũng như các yếu tố ảnh hưởng đến sự chuyển hóa và thải trừ các thuốc hóa trị ung thư sẽ ảnh hưởng đến mức độ suy giảm tế bào liên quan đến thuốc hóa trị

Những tác nhân tác động không chuyên biệt trên bất kỳ pha nào như anthracyclin và dactinomycin gây ra tình trạng suy tủy ngay tức thì, với sự khởi đầu của tình trạng suy giảm bạch cầu trung tính tương tự như các tác nhân trên các pha chuyên biệt gây ra nhưng tình trạng suy giảm này kéo dài hơn Những thuốc không tác động trên chu kỳ tế bào hay chỉ tác động ở pha G0 (ví dụ như nitrosourea hay busulfan) gây ra một tình trạng suy giảm bạch cầu và hồi phục trễ hơn Sử dụng lặp lại các thuốc như BCNU (carmustin) có thể gây ra tình trạng suy giảm bạch cầu mạn tính Những loại thuốc này thể hiện độc tính đối với cả các tế bào sơ khai cũng như cả với các tế bào gốc của hệ tạo máu. [73]

Bảng 1.4 Thời điểm tác động của các thuốc hóa trị trong chu kỳ tế bào[73]

CÁC THUỐC TÁC ĐỘNG TRÊN PHA CHUYÊN BIỆT

L-Asparaginase

Steroid

Methotrexat Cytarabin Fluorouracil Mercaptopurin Thioguanin Hydroxyurea Procarbazin Cyclophosphamid Steroid

Bleomycin Vincristin

Vinblastin Etoposid Teniposid Paclitaxel

Busulfan Mechlotheramin Melphalan

CÁC THUỐC TÁC ĐỘNG TRÊN PHA KHÔNG CHUYÊN BIỆT

Nhóm ALKYL Nhóm kháng sinh Nhóm nitrosourea Nhóm khác

Carmustin Lomustin Semustin

Carboplatin Cisplatin Chlorozotocin Streptozocin Dacarbazin

Bảng 1.5 Phân độ suy giảm bạch cầu theo Viện Ung thư Quốc gia Mỹ (NCI)[24]

Phân độ theo NCI Độ 1

(Nhẹ)

Độ 2 (Trung bình)

Độ 3 (Nặng)

Độ 4 (Rất nặng)

Tổng lượng bạch cầu 3000/mm3 2000-3000/mm3 1000-2000/m3 <1000/mm3Bạch cầu trung tính 1500/mm3 1000-1500/mm3 500-1000/mm3 <500/mm3

1.4.2 Các thuốc kháng giáp tổng hợp

Các thuốc kháng giáp trạng tổng hợp như methimazol, carbimazol hoặc propylthiouracil được dùng rất phổ biến trong điều trị các bệnh lý có cường giáp như basedow, nhân tuyến giáp Mặc dù có hiệu quả cao trong điều trị nhưng các thuốc này

có thể gây khá nhiều phản ứng phụ ở các mức độ khác nhau Một trong những phản ứng phụ gây nguy hiểm cho người bệnh là giảm bạch cầu hạt Tuy ít gặp (khoảng 4/1000 người sử dụng), nhưng tỉ lệ tử vong cao: 6 – 20% Hầu hết các trường hợp mất bạch cầu hạt do thuốc kháng giáp tổng hợp thường xảy ra trong vòng 90 ngày sau khi

sử dụng Một số ít trường hợp lại xảy ra sau 1 năm hoặc hơn Một số nghiên cứu thấy rằng, tác dụng phụ này xảy ra ở người cao tuổi nhiều hơn so với ở người trẻ và tỉ lệ tử vong cũng cao hơn Tác dụng làm giảm bạch cầu hạt của các loại thuốc này ít khi xảy

ra ở đợt điều trị đầu mà thường chỉ xảy ra ở những đợt điều trị tiếp theo.[36]

Mất bạch cầu hạt của thuốc kháng giáp tổng hợp là một phản ứng miễn dịch, gây ra do

sự thành lập các kháng thể đặc hiệu với thuốc, hoặc với các chất chuyển hóa của chúng Các kháng thể này được gắn trên bề mặt của các bạch cầu hạt Ở lần điều trị tiếp theo, thuốc hoặc chất chuyển hóa của chúng sẽ gắn với các kháng thể này, gây ra các phản ứng miễn dịch và phá vỡ các bạch cầu hạt này Ngoài ra, theo các nghiên cứu gần đây, sự giảm bạch cầu hạt của các thuốc này còn thông qua nhiều cơ chế khác nữa

Vì phản ứng phụ này là một phản ứng miễn dịch, nên có sự phản ứng chéo giữa các loại thuốc kháng giáp với nhau.[36]

1.4.3 Các loại thuốc khác

Các Penicillin: được chiết xuất từ nấm Penicillium notatum hoặc Penicillinum

chrysogenum Do có chung cấu trúc là beta-lactam, nên các kháng sinh thuộc nhóm

này đều có thể có tác dụng phụ là gây giảm bạch cầu.[36]

Ngoài ra, các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin (phân lập từ nấm

Cephalosporium) như: cefaclor, cefadroxil, cephalexin, cephaloridin, cephalothin,

cephradin, cefazolin, cefotaxim, cefamandol cũng có thể gây giảm bạch cầu.[32]

Kháng sinh nhóm Phenicol: các kháng sinh nhóm này thường gây suy giảm bạch cầu

không hồi phục, có thể phụ thuộc hoặc không phụ thuộc liều, có tần suất khoảng 1/10.000 ca điều trị và thường là tử vong.[36]

Kháng sinh nhóm Cyclin: như tetracyclin, oxycyclin, doxycyclin cũng có thể làm giảm

bạch cầu, tuy nhiên ít gặp và cũng ít gây nguy hiểm.[36]

Kháng sinh nhóm Sulfamid: có thể gây ức chế tủy, kết hợp trimethoprim và

sulfamethoxazol có nguy cơ cao làm giảm bạch cầu, bạch cầu trung tính nhất là trên tủy nhạy cảm (ghép tủy).[36]

Phenothiazin: thường làm giảm bạch cầu sau 2 – 8 tuần điều trị, hoặc khi tổng liều

vượt quá 5 gam Có thể thay đổi theo cá nhân và tùy theo khả năng bù trừ sự ức chế của phenothiazin lên tổng lượng ADN.[36]

1.4.4 Yếu tố kích thích tạo bạch cầu

Bạch cầu trong hệ thống miễn dịch có thể giúp chống nhiễm trùng Khi lượng bạch cầu xuống thấp trong máu, cơ thể sẽ giảm khả năng chống nhiễm trùng Trong liệu pháp hóa trị ung thư, bạch cầu thường hạ thấp nhất vào khoảng giữa thời gian của mỗi chu

kỳ hóa trị ung thư Thí dụ, cứ 3 tuần lễ hóa trị thì khoảng 10 ngày sau đó bạch cầu hạ thấp nhất Khi bạch cầu xuống thấp nhất là lúc bệnh nhân cảm thấy mệt mỏi nhiều nhất

và nguy cơ nhiễm trùng cao nhất Sau giai đoạn giảm tối đa, bạch cầu dần dần trở lại bình thường Sau đó, bệnh nhân có thể được hóa trị chu kỳ tiếp theo

Ngày nay, việc sử dụng các yếu tố kích thích tạo bạch cầu để phục hồi lượng bạch cầu trong máu càng được chú trọng Một số thuốc thường được sử dụng như GM-CSF (Granulocyte Macrophage – Colony Stimulating Factor: yếu tố kích thích dòng bạch cầu-đại thực bào) và G-CSF (Granulocyte - Colony Stimulating Factor: yếu tố kích thích dòng bạch cầu).[45]

Đặc tính và tác dụng của filgrastim

Filgrastim là một yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt của người, được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp ADN và có hoạt tính giống hệt yếu tố nội sinh kích thích dòng bạch cầu hạt ở người Filgrastim là một protein không gắn đường, có độ tinh khiết cao, chứa 175 acid amin Filgrastim được sản xuất trong phòng thí nghiệm từ chủng vi

khuẩn Escherichia coli mà hệ gen của chúng đã được biến đổi do gắn thêm vào một

gen sản xuất ra yếu tố kích thích tạo bạch cầu hạt Thuốc điều hoà việc sản xuất và huy động các tế bào hạt trung tính từ tuỷ xương Thuốc kích thích sự hoạt hoá, tăng sinh và biệt hoá các tế bào tiền thân bạch cầu trung tính Trong một số trường hợp giảm bạch

cầu trung tính mạn tính, điều trị cũng làm tăng sản xuất bạch cầu hạt ưa acid và ưa bazơ Tăng bạch cầu hạt trung tính phụ thuộc trực tiếp vào liều Khi ngừng điều trị, bạch cầu hạt trung tính lưu hành giảm 50% trong vòng 1-2 ngày và trở lại mức bình thường trong vòng 1-7 ngày.[45]

Theo một nghiên cứu của Kuderer cùng các đồng nghiệp thuộc Đại Học Y Khoa Duke trên 3000 bệnh nhân ung thư đang được hóa trị, kết quả cho thấy bệnh nhân ung thư được truyền bạch cầu trễ thường biểu hiện triệu chứng sốt do giảm bạch cầu và có nguy cơ tử vong là 44% Trong khi nhóm bệnh nhân ung thư vừa được hóa trị, vừa được chỉ định dùng filgrastim (biệt dược: Neulasta, Neupogen), giảm nguy cơ tử vong xuống thấp hơn (22%) Filgrastim có tác dụng phục hồi lượng bạch cầu trong máu Vì thế, nhiều tác giả khuyến cáo nên dùng filgrastim trước hay ngay sau khi hóa trị cho bệnh nhân vì sẽ giảm nguy cơ tử vong cho bệnh nhân hơn là để quá trễ.[45]

1.5 Các mô hình gây suy giảm bạch cầu thực nghiệm

Những mô hình gây suy giảm bạch cầu thực nghiệm được thiết kế nhiều nhất trong giai đoạn 1980-1990 khi hàng loạt thuốc trị ung thư ra đời Các mô hình này giúp tiên đoán độc tính gây suy tủy của các thuốc hóa trị ung thư Schurig và cộng sự (1985, 1986) đã

mô phỏng hàng loạt các mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng cisplatin, carboplatin, doxorubicin, mitomycin C, BCNU và bleomycin trên chuột nhắt chỉ bằng 1 liều duy nhất thuốc hóa trị[70,71] Sau đó, khi yếu tố kích thích dòng bạch cầu hạt (G-CSF: granulocyte-colony stimulating factor) ra đời, nhiều mô hình gây suy giảm bạch cầu đã được thiết kế để đánh giá tác dụng phục hồi dòng bạch cầu hạt của G-CSF Matsumoto

và cộng sự (1987, 1990) đã gây mô hình giảm bạch cầu bằng cyclophosphamid để nghiên cứu khả năng phòng ngừa suy giảm bạch cầu và tình trạng nhiễm khuẩn của G-CSF[57,58] Năm 1995, Kabaya và cộng sự tiếp tục xây dựng một loạt các mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng các thuốc hóa trị ung thư như cyclophosphamid, mitomycin C, adriamycin, vincristin, mitomycin C kết hợp với vincristin, hoặc cyclophosphamid

G-CSF[42] Hiện nay, rất nhiều mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng các thuốc hóa trị ung thư đã được thực hiện trên thế giới để ứng dụng như những công cụ nghiên cứu, sàng lọc các thuốc có khả năng phòng ngừa suy giảm bạch cầu (doxorubicin: Sheng và cộng sự 2000[75], carboplatin, paclitaxel: Morstyn và cộng sự 2001[63], 5-FU: Bitmansour và cộng sự 2005[16], methotrexat: Barrios và Poletti 2005[13])

1.5.1 Phối hợp oxaliplatin với 5-FU và leucovorin

Oxaliplatin: dẫn chất của platin đã trở thành một trong những yếu tố then chốt trong

điều trị ung thư kể từ khi phát hiện ra khả năng chống ung thư của cisplatin trong những năm 1960 [69]

Mặc dù nhiều hợp chất kim loại đã được tổng hợp nhưng chỉ một số ít thành công trong thử nghiệm lâm sàng Trong các thuốc chống ung thư dựa trên platin, chỉ cisplatin, oxaliplatin [(1R, 2R)-cyclohexanediamin] và carboplatin [cis-diammine (1,1-cyclobudandicarboxylato) platin (II)] được sử dụng nhiều trong lâm sàng [25,74]

Các phức platin có khả năng chống ung thư rộng và đã trở thành nền tảng cho việc điều trị ung thư buồng trứng, đầu, cổ, bàng quang, thực quản, phổi, và ung thư đại tràng Trong 30 năm qua, một số lượng lớn các chất tương tự platin đã được tổng hợp nhằm

mở rộng phổ hoạt động, khắc phục tính đề kháng của tế bào hoặc làm giảm độc tính của thế hệ thứ nhất (cisplatin) và thế hệ thứ hai (carboplatin) Các thuốc dựa trên platin có chứa một phối tử 1, 2- diaminocyclohexane (DACH) như oxaliplatin đã liên tục chứng tỏ tác động kháng khối u trên các dòng tế bào có khả năng đề kháng cisplatin [26,54]

Hình 1.2 Cơ chế tác động của oxaliplatin

Giống như tất cả các hợp chất platin, oxaliplatin phải được chuyển đổi thành dạng có hoạt tính bởi các phản ứng trao đổi, hydrat hóa trong máu và trong môi trường trong tế bào Đầu tiên, oxaliplatin được hoạt hóa thành dạng có hoạt tính bằng cách thay thế nhóm oxalat bởi bicarbonat trong máu hoặc dihydrogen phosphat trong tế bào dẫn đến

sự hình thành các chất trung gian không ổn định (monochloro, dichloro) và dễ dàng bị thủy phân thành diaqua-1,2-DACH platin Các monochloro, dichloro, diaqua trung gian có hoạt tính cao, phản ứng với nhóm sulfur và nhóm amin trong protein, RNA, DNA Tác dụng chống khối u của oxaliplatin được cho là do thay đổi cấu trúc DNA bằng cách ức chế quá trình tổng hợp và sửa chữa DNA So với các phối tử amin của cisplatin và carboplatin, phối tử DACH của oxaliplatin cồng kềnh, kỵ nước hơn do đó dẫn chất DACH-Pt hiệu quả hơn trong ức chế tổng hợp DNA, có khả năng gây độc tế bào cao hơn cisplatin, carboplatin Phối tử DACH gây cản trở về không gian, làm cho phức bắt cặp sửa sai (mismatch repair complex) không thể gắn vào dẫn chất DACH-Pt

để sửa chữa Oxaliplatin có thể tạo liên kết hóa trị với các enzym sửa chữa (chứa nhiều nhóm amino và sulfur), làm suy yếu chức năng của enzym Để sửa chữa DNA, quá

DNA hiện có Nếu DNA bị phá hủy đáng kể có thể dẫn đến việc kích hoạt các con đường tự hủy hoại và chết tế bào.[46,49,66]

5-Fluorouracil (5-FU): 5-FU là một loại thuốc hóa trị sử dụng rộng rãi nhất trên thế

giới được FDA phê chuẩn trong điều trị nhiều loại ung thư như ung thư đại tràng, trực tràng, vú, dạ dày, tuyến tụy 5-FU là thuốc kháng chuyển hóa loại pyrimidin có chứa fluor, có khả năng cản trở sự phát triển và lây lan của các tế bào ung thư trong cơ thể 5-FU cần enzym để chuyển hóa thành dạng có hoạt tính gây độc tế bào 5-FU có thể được chuyển đổi thành fluorouridin bởi uridin phosphorylase và sau đó thành fluorouridin monophosphat (FUMP) bởi uridin kinase, hoặc nó có thể phản ứng trực tiếp với 5 phosphoribosyl-1-pyrophosphat (PRPP) để tạo thành FUMP FUMP qua các con đường chuyển hóa sẽ tạo thành fluorouridin triphosphat (FUTP) gắn kết với RNA.[48] Fluorouridin diphosphat (FUDP) có thể được khử bởi ribonucleotid reductase (RNR) tạo thành fluorodeoxyuridin monophosphat (FdUMP)

Hình 1.3 Cơ chế tác động của 5-FU

5-FU cũng có thể được chuyển đổi thành deoxyribosid fluorodeoxyuridin (FUdR) bởi thymidin phosphorylase và sau đó dưới tác dụng của thymidine kinase tạo thành FdUMP - ức chế thymidylat synthase (TS) và chặn quá trình tổng hợp thymidin triphosphat (TTP), một thành phần cần thiết của DNA.[48]

Các đồng yếu tố folat (5,10-methylenetetrahydrofolat) và FdUMP tạo thành một phức

ba yếu tố liên kết hóa trị với TS Bình thường, phức TS-folat-dUMP tham gia tổng hợp thymidylat bằng cách chuyển nhóm methylen và hai nguyên tử hydro từ folat đến dUMP Khi sử dụng 5-FU, phản ứng này bị chặn bởi sự hình thành phức TS-FdUMP-folat, ức chế TS gây cản trở tổng hợp DNA Trong tế bào được điều trị bằng 5-FU, cả fluorodeoxyuridin triphosphat (FdUTP) và deoxyuridin triphosphat (dUTP) (cơ chất tích lũy sau khi TS bị ức chế) gắn vào DNA tại vị trí gắn kết của TTP, dẫn đến vỡ sợi DNA.[48]

Một số tế bào ác tính thiếu 5,10-methylenetetrahydrofolat, do đó không thể hình thành mức tối đa của phức ba yếu tố Bổ sung folat ngoại sinh ở dạng N5-formyl-FH4 (leucovorin) tăng hình thành phức và tăng cường phản ứng với 5-FU trong thử nghiệm lâm sàng.[24]

5-FU thường dùng tiêm tĩnh mạch và có thời gian bán thải ngắn Thuốc vẫn có hoạt tính khi uống, nhưng sinh khả dụng không ổn định 7- 20% thuốc thải trừ ở dạng không biến đổi qua nước tiểu sau 6 giờ Thuốc có tác dụng mạnh đến các tế bào đang tăng sinh nhanh.[1] 5-Fluorouracil là thuốc có độc tính cao với máu, gây chảy máu đường tiêu hóa, thậm chí tử vong Thuốc chỉ được dùng dưới sự theo dõi chặt chẽ của thầy thuốc có kinh nghiệm sử dụng hóa trị liệu và các chất chống chuyển hóa.[1]

Leucovorin: acid folic là một yếu tố dinh dưỡng cần thiết được chuyển đổi bởi enzym

để tạo các đồng yếu tố tetrahydrofolat (FH4), cung cấp nhóm methyl cho sự tổng hợp các tiền chất của DNA (thymidylat và purin), RNA (purin) nhằm sản xuất, duy trì các

tế bào mới và cũng có thể giúp ngăn ngừa những thay đổi DNA có thể dẫn đến ung thư

Folinat calci (hay leucovorin calci) là dẫn chất của acid tetrahydrofolic - dạng khử của acid folic - tham gia như một đồng yếu tố cho phản ứng chuyển vận một carbon trong sinh tổng hợp purin và pyrimidin của acid nucleic Ức chế chuyển hóa FH4 làm giảm khả năng vận chuyển một carbon và các phản ứng methyl hóa cần thiết trong quá trình tổng hợp ribonucleotid purin, thymidin monophosphat (TMP), do đó ức chế sao chép

DNA Sự suy giảm tổng hợp thymidylat ở người thiếu hụt acid folic gây tổng hợp DNA khiếm khuyết và gây thiếu máu nguyên hồng cầu khổng lồ.[1]

Do có thể dễ dàng biến đổi thành các dẫn chất khác của acid tetrahydrofolic nên acid folinic là chất giải độc mạnh cho tác dụng độc của các chất đối kháng acid folic (như methotrexat, pyrimethamin, trimethoprim) cả lên quá trình tạo máu lẫn trên lưới nội

mô Trong một số bệnh ung thư, acid folinic thâm nhập vào các tế bào và giải cứu các

tế bào bình thường khỏi tác dụng độc của các chất đối kháng acid folic tốt hơn là các tế bào u, do có sự khác nhau trong cơ chế chuyển vận qua màng.[1]

Phối hợp của oxaliplatin với 5-FU và leucovorin (phác đồ FOLFOX)

Nghiên cứu đánh giá những lợi ích của việc bổ sung oxaliplatin với 5-FU cộng với leucovorin được bắt đầu sau khi quan sát thấy rằng sự kết hợp này đóng vai trò hiệp

lực in vitro cũng như trong các mô hình trên chuột Những nghiên cứu từ bệnh nhân

hóa trị sử dụng FU được so sánh về hiệu quả và độ dung nạp của sự kết hợp FU/leucovorin với oxaliplatin Tỷ lệ đáp ứng, khả năng giảm tiến triển bệnh, khả năng sống sót thường ổn định và cao hơn đáng kể so với việc chỉ sử dụng 5-FU/leucovorin Những dữ liệu này dẫn đến việc đề nghị sử dụng kết hợp oxaliplatin với 5-FU/leucovorin (phác đồ FOLFOX) như điều trị đầu tay hoặc bước hai đối với ung thư đại-trực tràng tiến xa với tỷ lệ đáp ứng lên đến 51-67%, gia tăng tỷ lệ sống sót của bệnh nhân, đặc biệt cho kết quả tốt trên những bệnh nhân ung thư đại-trực tràng di căn kháng trị trước đây.[48]

5-Trên lâm sàng phác đồ FOLFOX-4 thường được dùng hóa trị ở giai đoạn 3 Oxaliplatin (85 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 2 giờ (ngày 1), leucovorin (200 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 2 giờ (ngày 1, 2) Sau đó, 5-FU (400 mg/m2) tiêm bolus tĩnh mạch rồi 5-FU (600 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 22 giờ (ngày 1, 2) Liều trên lặp lại mỗi 2 tuần.[31]Phác đồ FOLFOX-6 thường được dùng hóa trị ở những bệnh nhân đã chuyển sang giai đoạn 4 Oxaliplatin (85-100 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 2 giờ (ngày 1), leucovorin (400 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 2 giờ (ngày 1, 2) Sau đó, 5-FU (400 mg/m2) tiêm

bolus tĩnh mạch rồi 5-FU (2400-3000 mg/m2) truyền tĩnh mạch trong 46 giờ (ngày 1, 2) Liều trên lặp lại mỗi 2 tuần.[31]

Một nghiên cứu ngẫu nhiên cho thấy, phối hợp 5-FU và leucovorin gây ra những độc tính nghiêm trọng: tiêu chảy, viêm cơ, giảm bạch cầu xảy ra ở 15-20% bệnh nhân Ngoài ra, phối hợp còn gây nôn mửa, gây độc trên hệ tạo máu và thần kinh,… là nguyên nhân phải giảm liều, trì hoãn hoặc ngưng điều trị Do đó, việc cải thiện tác dụng phụ đặc biệt là trên bạch cầu là rất quan trọng.[32]

Căn cứ trên phác đồ FOLFOX, chúng tôi đã đưa ra mục tiêu xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng phối hợp oxaliplatin/5-FU/leucovorin trên thực nghiệm để đánh giá tác động phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi

1.5.2 Phối hợp paclitaxel và carboplatin

Carboplatin: carboplatin thuộc nhóm các dẫn xuất chứa platin Đây là một nhóm thuốc

đặc biệt trong các nhóm thuốc trị ung thư vì nó chứa kim loại, trong khi hầu hết các thuốc trị ung thư khác là chất hữu cơ Thuốc này được tìm ra bởi nhà lý sinh Barneet Rosenberg khi nghiên cứu tác động của điện trường trên sự phát triển của vi khuẩn với điện cực bằng platin Ở trạng thái trung tính [PtCl4(NH3)2], phân tử platin (IV) có tác động ức chế vi khuẩn phân chia.[17]

Cơ chế tác động: Tương tự như cisplatin, là tác nhân alkyl hóa, gắn vào DNA bằng nối cộng hóa trị, tạo thành các liên kết chéo bên trong và giữa các chuỗi DNA nên làm thay đổi cấu trúc của DNA và ức chế tổng hợp DNA So với cisplatin thì carboplatin ít tác dụng phụ hơn nhưng carboplatin lại gây suy tủy phụ thuộc liều và nặng hơn cisplatin Trên lâm sàng, carboplatin được sử dụng trong các phác đồ trị ung thư buồng trứng, ung thư phổi tế bào nhỏ và là thuốc thay thế cho cisplatin trong các u rắn khác

Trong một nghiên cứu, Boughattas và cộng sự (1990) đã xây dựng mô hình gây suy tủy bằng cisplatin và carboplatin trên chuột nhắt bằng cách tiêm tĩnh mạch hàng tuần carboplatin liều 50 mg/kg trong vòng hơn 2 tháng Kết quả thí nghiệm cho thấy carboplatin gây giảm tiểu cầu, giảm bạch cầu và tổn thương tủy xương. [17]

Paclitaxel: paclitaxel là hoạt chất có trong vỏ cây thông đỏ Taxux brevifolia Paclitaxel

thuộc nhóm trị ung thư nguồn gốc thiên nhiên và có cơ chế tác động duy nhất không giống các thuốc trị ung thư khác Paclitaxel làm tăng quá trình trùng hợp các dime tubulin tạo thành các vi quản và làm ổn định các vi quản do ức chế quá trình giải trùng hợp Sự ổn định này ức chế sự tổ chức lại bình thường của mạng vi quản rất quan trọng

ở gian kỳ của quá trình phân bào giảm nhiễm, và cả với hoạt động của ty lạp thể Paclitaxel cũng tạo thành các cấu trúc bất thường trong các vi quản trong quá trình phân bào.[1]

Paclitaxel được chỉ định trong ung thư buồng trứng di căn khi các biện pháp điều trị thông thường bằng các anthracyclin, và dẫn chất platin đã thất bại hay bị chống chỉ định; hoặc chỉ định trong ung thư vú di căn khi liệu pháp thông thường với các anthracyclin đã thất bại hoặc không thích hợp Ngoài ra, paclitaxel còn có tác động kháng khối u với nhiều loại u khác nhau đã đề kháng với các phương pháp trị liệu thông thường như ung thư phổi tế bào nhỏ và không tế bào nhỏ, ung thư đầu, cổ, thực quản, bàng quang, tế bào mầm, u lympho và sarcoma Kaposi.[1]

Độc tính thường gặp của paclitaxel là gây suy tủy, đặc biệt là giảm bạch cầu trung tính, gây giới hạn liều dùng của paclitaxel Bạch cầu giảm thấp nhất sau 11 ngày và phục hồi 15-21 ngày sau mỗi liều

Trong nghiên cứu tác động phục hồi suy giảm bạch cầu của sâm Ấn Độ Withania

somnifera, Gupta và cộng sự (2001) đã sử dụng paclitaxel để gây giảm bạch cầu trung

tính trên chuột nhắt Sau khi tiêm tĩnh mạch paclitaxel với liều 1 mg/kg vào ngày 0, tổng lượng bạch cầu cũng như bạch cầu trung tính giảm thấp nhất vào ngày thứ 3 đến ngày thứ 5 của thử nghiệm.[33] Trong một nghiên cứu khác, Liu và cộng sự (2008) đã

sử dụng paclitaxel với liều 17 mg/kg tiêm phúc mạc Ở liều lượng này, paclitaxel gây

suy giảm bạch cầu rõ rệt, đạt ý nghĩa bệnh lý

Khi xây dựng mô hình đánh giá suy kiệt do ung thư trên chuột nhắt, Maria và cộng sự (2011) đã so sánh độc tính của của paclitaxel với thuốc paclitaxel sản xuất bằng công nghệ nano (nab-paclitaxel) Chuột được tiêm tĩnh mạch paclitaxel liều 10 mg/kg mỗi ngày trong 5 ngày liên tiếp và được theo dõi 1 tuần trước khi được điều trị trong 4 tuần

Kết quả thu được là chuột được tiêm paclitaxel dạng thông thường gây giảm bạch cầu trung tính nhiều hơn so với nab-paclitaxel.[55]

Phác đồ phối hợp paclitaxel với carboplatin trong hóa trị ung thư

Hóa trị liệu phối hợp paclitaxel và carboplatin thường được sử dụng trong điều trị ung thư buồng trứng và ung thư phổi không tế bào nhỏ Paclitaxel còn được biết dưới tên biệt dược là Taxol, do đó sự kết hợp giữa hai thuốc này còn gọi là phác đồ Carbo/Taxol

Trong phác đồ này thì hai thuốc hóa trị được truyền riêng rẽ: paclitaxel truyền nhỏ giọt trong 3 giờ, carboplatin cũng được truyền nhỏ giọt trong vòng 1 giờ và cả hai thuốc đều được chỉ định trong ngày hóa trị đầu tiên Sau đó bệnh nhân sẽ được ngưng hóa trị trong ba tuần kế tiếp Toàn bộ thời gian này được gọi là một chu kỳ điều trị Việc điều trị được lặp lại như trên sau giai đoạn nghỉ ngơi để bắt đầu chu kỳ điều trị sau Thường dùng từ 6-8 chu kỳ điều trị rải đều trong khoảng thời gian 5-6 tháng

Phác đồ Carbo/Taxol được chỉ định bước đầu hoặc điều trị tái phát cho các trường hợp ung thư cổ tử cung, âm đạo, buồng trứng, ung thư nội mạc tử cung tái phát, ung thư phúc mạc, ung thư phổi không tế bào nhỏ…[31] Trong ung thư đầu và cổ, phác đồ Carbo/Taxol được sử dụng đồng thời với xạ trị Conley và cộng sự báo cáo thử nghiệm thí điểm paclitaxel 40 mg/m2/tuần và carboplatin 100 mg/m2/tuần, kết hợp xạ trị 6-7 tuần ghi nhận 71% tỷ lệ đáp ứng hoàn toàn.[31]

Tuy sự phối hợp này đem lại hiệu quả cao hơn trong điều trị nhưng cũng đồng thời làm

tăng độc tính của cả hai, nhất là độc tính trên tủy xương

Căn cứ trên phác đồ Carbo/Taxol, chúng tôi đã đưa ra mục tiêu xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng phối hợp carboplatin và paclitaxel trên thực nghiệm để đánh giá tác động phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi

1.5.3 Phối hợp cyclophosphamid và doxorubicin

Cyclophosphamid: cyclophosphamid là một tác nhân alkyl hóa kìm tế bào, thuộc

nhóm oxazaphosphorin Bản thân cyclophosphamid không có hoạt tính, vì vậy không

chuyển hóa thành ion aziridinium có hoạt tính alkyl hóa Chúng phản ứng và liên kết đồng hóa trị với những gốc guanin trên DNA tạo thành liên kết chéo giữa hai chuổi DNA Nhờ alkyl hóa DNA, thuốc có tác dụng ngăn chặn sự sao chép và phiên mã DNA Tác dụng mạnh nhất của cyclophosphamid là tác dụng ức chế chu kỳ tế bào trong các giai đoạn G2 và S Cyclophosphamid ức chế chung sự phân chia của tất cả các tế bào đang tăng sinh, vì vậy gây ra những tác dụng không mong muốn trên nhiều cơ quan và

mô Có thể sử dụng kết hợp cyclophosphamid với xạ trị và các thuốc hóa trị liệu chống ung thư khác.[1]

Cyclophosphamid được chỉ định rộng rãi và thường phối hợp với nhiều thuốc khác để điều trị nhiều bệnh ác tính khác nhau gồm u lympho ác tính: u lympho Hodgkin và không Hodgkin, u lympho Burkitt, u lympho lymphocyt, u lympho tế bào hỗn hợp và u lympho mô bào; đa u tủy; các bệnh bạch cầu thể lympho mạn tính, thể hạt mạn tính (thường không có hiệu quả trong các đợt cấp), bệnh bạch cầu cấp thể tủy và thể monocyt, thể nguyên bào lympho, bệnh bạch cầu ở trẻ em (cyclophosphamid, dùng trong thời gian thuyên giảm, có kết quả do kéo dài giai đoạn này); u sùi dạng nấm Cyclophosphamid cũng được dùng để điều trị tạm thời nhiều khối u đặc và khối u di căn như carcinom vú, cổ tử cung, nội mạc tử cung, phổi, tuyến tiền liệt và buồng trứng;

u ác tính ở trẻ em như u nguyên bào thần kinh, u nguyên bào võng mạc, u Wilm và sarcom Cyclophosphamid cũng được dùng làm thuốc phòng ngừa trong phẫu thuật đối với những khối u ác tính nhạy cảm với hóa trị.[1]]

Cyclophosphamid có tác dụng ức chế mọi tế bào tăng sinh trong cơ thể, đặc biệt là các

tế bào tuỷ xương Phần lớn các tác dụng không mong muốn đều liên quan tới liều sử dụng Ức chế tuỷ xương là tác dụng không mong muốn thường gặp khi dùng liều cao, nên cần phải giảm liều hoặc kéo dài khoảng cách giữa các lần sử dụng Cyclophosphamid có thể gây giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu, thiếu máu.[1]

Doxorubicin: doxorubicin là một kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin gây độc tế bào

được phân lập từ môi trường nuôi cấy Streptomyces peucetius var caecius Hiện nay

doxorubicin được tổng hợp từ daunorubicin Doxorubicin kích ứng mạnh các mô và có thể gây hoại tử mô, ví dụ trong trường hợp tiêm ra ngoài mạch máu.[1]

Hoạt tính sinh học của doxorubicin là do doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế các enzym cần thiết để sao chép và phiên mã DNA Doxorubicin gây gián đoạn mạnh chu

kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân, nhưng thuốc cũng tác dụng trên các giai đoạn khác của chu kỳ phát triển tế bào Doxorubicin có thể dùng đơn độc hoặc phối hợp với thuốc chống ung thư khác Sự kháng thuốc chéo xảy ra khi khối u kháng cả doxorubicin và daunorubicin.[1,28]

Doxorubicin được chỉ định chính trong ung thư vú, u xương ác tính và u xương Ewing,

u mô mềm, u khí phế quản, u lympho ác tính cả 2 dạng: Hodgkin và không Hodgkin, ung thư biểu mô tuyến giáp; ung thư đường tiết niệu và sinh dục: ung thư tử cung, ung thư bàng quang, ung thư tinh hoàn Khối u đặc ở trẻ em: sarcom cơ vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh bạch cầu cấp.[1,28]

Doxorubicin có nhiều tác dụng không mong muốn, thường phụ thuộc vào đường dùng

và liều dùng, tốc độ dùng, tần số dùng, trong đó, suy giảm chức năng tủy xương là phản ứng có hại rất nhạy với liều dùng, nhưng có thể hồi phục được.[1,28]

Phác đồ phối hợp cyclophosphamid và doxorubicin

Cyclophosphamid, doxorubicin là thuốc kháng u mạnh được sử dụng trên thế giới để trị nhiều loại ung thư Từ những năm 70, cyclophosphamid và doxorubicin đã được sử dụng rộng rãi trong phác đồ CHOP (cyclophosphamid, doxorubicin, vincristin, prednison) để trị u lympho Hodgkin và không Hodgkin, giúp ức chế và làm chậm sự phát triển khối u với tỉ lệ khỏi bệnh 40%.[61,62] Cyclophosphamid phối hợp với doxorubicin (phác đồ AC hay TAC) là phác đồ đầu tay để trị ung thư vú.[30] Phác đồ VAC (vincristin, doxorubicin, cyclophosphamid) dùng để điều trị ung thư tế bào biểu

mô.[68] Tuy nhiên, phác đồ hoá trị đưa đến những độc tính như da khô, rụng tóc, độc gan, tăng huyết áp, giảm ham muốn tình dục, trong đó, độc tính được quan tâm nhất

là suy tủy, giảm sản tủy, giảm các dòng bạch cầu

Căn cứ trên phác đồ A/C, chúng tôi đã đưa ra mục tiêu xây dựng mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng phối hợp cyclophosphamid và doxorubicin trên thực nghiệm để đánh giá tác động phòng ngừa suy giảm bạch cầu của linh chi

1.6 Cơ sở nghiên cứu tác dụng phục hồi tình trạng suy giảm bạch cầu của linh chi trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng thuốc hóa trị ung thư

Tác dụng phòng ngừa độc tính gây suy tủy của linh chi được nghiên cứu lần đầu tiên trên mô hình chuột gây suy giảm bạch cầu lympho bằng tia gamma[20] Trong thực nghiệm này, lô chuột nhắt được cho sử dụng linh chi có khả năng phục hồi lại số lượng bạch cầu lympho sau khi đã bị suy giảm do tia gamma Sau đó, nhiều công trình nghiên cứu chứng minh thành phần polysaccharid của linh chi có tác dụng làm tăng số lượng bạch cầu lympho T (CD4, CD8), đại thực bào, diệt bào trên các mô hình gây suy giảm

số lượng các loại tế bào này[4,37,47] Trên mô hình gây suy giảm miễn dịch bằng cyclophosphamid, Zhu và cộng sự (2007) đã chứng minh rằng thành phần

polysaccharid của linh chi (G lucidum) có tác dụng phục hồi tủy xương, phục hồi số

lượng hồng cầu, và cả bạch cầu[83] Proteoglycan chiết xuất từ linh chi có tác dụng kích thích sản xuất các đại thực bào từ tủy xương[39] Trên mô hình gây suy giảm bạch cầu bằng methotrexat, cao linh chi cũng có tác dụng phục hồi sự suy giảm các loại bạch cầu hạt trên máu ngoại vi của chuột nhắt[12]

Từ những kết quả nghiên cứu này, chúng tôi cho rằng, linh chi có khả năng kích thích sản xuất các loại bạch cầu và có thể còn có tác dụng ngăn ngừa độc tính gây suy tủy của các thuốc hóa trị ung thư

1.7 Tính cấp thiết của đề tài

Suy giảm bạch cầu là một trong những tác dụng phụ nghiêm trọng do các thuốc kháng ung thư gây ra Vì thế, trong hóa trị liệu ung thư, một mục tiêu trị liệu quan trọng khác

là phải khôi phục được tình trạng suy giảm bạch cầu do tác dụng có hại của thuốc Bên cạnh các biện pháp như truyền máu, truyền tiểu cầu, một số thuốc khác cũng được sử dụng, chủ yếu là các thuốc kích thích hệ tạo hồng cầu (như erythropoietin) hay thuốc kích thích hệ tạo bạch cầu hạt –đại thực bào (G-CSF: Granulocyte - Colony Stimulating Factor), GM-CSF (Granulocyte macrophage – Conoly Stimulating Factor) được sản xuất bằng công nghệ sinh học và có giá thành tương đối cao Gần đây, một số

thuốc y học cổ truyền cũng được cho là có thể ngăn ngừa và khôi phục lại tình trạng suy tủy Đây là vấn đề đáng quan tâm, vì nếu việc sử dụng thuốc có nguồn gốc tự nhiên

có hiệu quả thì sẽ giúp giảm chi phí điều trị cho bệnh nhân và đặc biệt là có thể phục hồi trình trạng suy tủy một cách an toàn

Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về linh chi, kể cả việc sử dụng linh chi trong điều trị ung thư, nhưng cho đến nay hầu như chưa có nghiên cứu về việc sử dụng linh chi trong mục đích phòng ngừa suy giảm bạch cầu do các thuốc kháng virus và thuốc hóa trị ung thư gây ra Vì thế chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của linh chi

(Ganoderma lucidum) trong việc phục hồi tình trạng suy giảm bạch cầu gây bởi các

thuốc kháng ung thư”, nhằm có thể đưa các chế phẩm của linh chi vào ứng dụng trên lâm sàng trong khía cạnh này

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Nội dung 1

Xác định hàm lượng polysaccharid, đường hòa tan và đường khử trong cao khô linh chi OPC

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cao khô linh chi toàn phần do công ty cổ phần dược phẩm OPC sản xuất, đạt tiêu chuẩn kiểm nghiệm cấp cơ sở (phụ lục 1)

Công thức bào chế cao linh chi toàn phần

Linh chi 10kg

Natri benzoat 5g

Nước uống được vừa đủ

OPC từ cao linh chi toàn phần, dạng bào chế viên nang mềm Số đăng ký:

VD-3429-07, số lô: 12001, hạn dùng: 03-2015

2.1.2 Mô tả nội dung

Polysaccharid trong cao khô linh chi được chiết xuất bằng nước nóng, sau đó kết tủa bằng ethanol Ly tâm lấy tủa và định lượng hàm lượng polysaccharid toàn phần bằng phương pháp cân; Sau đó, hàm lượng đường hòa tan và đường khử trong polysaccharid được định lượng bằng phương pháp phenol-sulfuric acid và bằng thuốc thử DNS

2.1.3 Phương pháp nghiên cứu

2.1.3.1 Xác định hàm lượng polysaccharid bằng phương pháp cân

Cân chính xác khoảng 10 gam cao khô linh chi sau khi đã sấy đến khối lượng không đổi Chiết xuất polysaccharid bằng nước nóng 80-100OC trong 30 phút, sau đó kết tủa polysaccharid bằng ethanol 95% Ly tâm lấy tủa, sấy đến khối lượng không đổi và cân

2.1.3.2 Xác định hàm lượng đường hòa tan bằng phenol-acid sulfuric [65]

Nguyên tắc:

Sự tương tác giữa phenol và carbohydrat sẽ tạo ra một phức hợp thơm có màu, phức này hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 490 nm Hàm lượng đường hòa tan trong mẫu được xác định bằng phương pháp so màu sử dụng quang phổ kế Hitachi U-1900

Tiến hành:

- Xây dựng đường chuẩn glucose: cân 0,1g glucose chuẩn, hòa tan trong 100ml nước cất, được dung dịch glucose chuẩn 0,1% Glucose chuẩn được pha thành dãy nồng

độ 20- 30-40-50-60-70-80-90 (µg/ml)

- Mẫu thử: Mẫu thử polysaccharid được pha với nồng độ 100-150-200 µg/ml

- Với mỗi nồng độ mẫu chuẩn và mẫu thử ở trên, hút 0,5ml cho vào ống nghiệm, thêm 0,5 ml phenol 5%, rồi thêm từ từ 2,5ml H2SO4 đđ 96% Để yên 10 phút rồi lắc

và giữ ở nhiệt độ phòng trong 10-20 phút để xuất hiện màu Màu bền vững trong vài giờ, xác định cường độ màu trong quang phổ kế ở bước sóng 490 nm

- Mẫu trắng làm như trên với 0,5 ml nước cất thay cho dung dịch đường

Mỗi nồng độ được thực hiện 3 lần, lấy trung bình

Cách tính toán:

Dựng đường tuyến tính glucose chuẩn và dựa vào phương trình tuyến tính để suy ra hàm lượng đường hòa tan trong mẫu thử

Hàm lượng đường hòa tan được tính theo công thức:

Hàm lượng đường hòa tan (%) =