Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

B GIÁO D IH CM O TP H CHÍ MINH KHÓA LU N T T NGHI P tài: T NG NUÔI C Y CH NG Lactobacillus plantarum NT1.5 B QUY HO CH TH C NGHI M KHOA CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGÀNH: VI SINH SINH H C PHÂN T GVHD: ThS T LINH SVTH : TR N TH KI U MSSV : 1053012348 KHỐ: 2010 Tp.H Chí Minh, tháng 05 2014 L IC Em xin chân thành g i l i c Cô t Linh th y Nguy Sinh h c T t n: gi ng viên khoa Cơng ngh i H c M Tp H chí Minh, cô th y u ki n, truy t ki n th Chân thành c em có th hồn thành t tài y, cô khoa Công ngh Sinh h Tp H n tình gi ng d y, truy n nt ng d n, em có th Th y i H cM t cho em nh ng ki n th n làm tài , ch Võ Ng c Y n Nhi, ch Ph m Th Minh Trang, ch Nguy n Th M Linh, anh Nguy nghi t Phi t nh ng kinh t qua nh i gian th c hi tài Xin c n anh/ ch , b n em Phịng thí nghi m Cơng ngh Vi ng viên em th i gian qua Cu i cùng, xin g i l i c t n Ba, M nh ng h u ki n t t nh t cho hoàn thành t t vi c h c t p c a Chân thành c tháng TR N TH KI U SVTH: TR N TH KI U i T NG QUAN TÀI LI U M CL C TV NG QUAN TÀI LI U 1.1 T NG QUAN V VI KHU N LACTIC 1.1.1 Gi i thi u 1.1.2 ng bi 1.1.3 1.2 ng c a vi khu n lactic T ng quan v Lactobacillus plantarum TÌNH HÌNH NGHIÊN C CV LACTOBACILLUS 10 1.2.1 Các nghiên c u th gi i 10 1.2.2 Các nghiên c 1.3 c 11 QUY HO CH TH C NGHI M 12 1.3.1 ch th c nghi m 12 1.3.2 Thí nghi m sàng l c 14 1.3.3 Thí nghi m t 1.4 16 PH N M M QUY HO CH TH C NGHI M MINITAB 16.2.0 20 T LI U 23 2.1 TH M NGIÊN C U 24 2.2 V T LI U NGHIÊN C U 24 2.2.1 ng nghiên c u 24 2.2.2 ng hóa ch t 24 2.2.3 D ng c 24 2.2.4 Trang thi t b 24 2.3 U 25 2.3.1 Ho t hóa ch ng 25 2.3.3 Xây d SVTH: TR N TH KI U ng c a L plantarum NT 1.5 26 i T NG QUAN TÀI LI U 2.3.4 Kh o sát nhi , pH thích h p cho s ng c a L plantarum NT1.5 27 2.3.5 Sàng l c y u t 2.3.6 Thi t k thí nghi m tìm y u t ng 28 sinh kh i theo thi t k Plackett- Burman 30 2.3.7 Thí nghi m kh 2.3.8 Tìm kho ng t u 32 a y u t ng b pháp leo d c 32 2.3.9 Thí nghi m b m t ch nh giá tr t a y u t nh ng 33 2.3.10 nh th ng t ng c a ch ng L plantarum NT1.5 33 T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 34 3.1 K T QU XÂY D AM T BÀO VI KHU N VÀ GIÁ TR OD610 35 3.2 K T QU XÂY D NG C A L PLANTARUM NT 1.5 36 3.3 K T QU KH O SÁT NHI , pH THÍCH H P CHO S NG C A L PLANTARUM NT1.5 38 3.4 K T QU SÀNG L C Y U T NG 39 3.4.1 Ngu 3.4.2 Ngu n cacbon 41 3.4.3 Ngu n khoáng 42 3.5 39 K T QU NH CÁC Y U T NG CHÍNH THEO THI T K THÍ NGHI M PLACKETT- BURMAN 44 3.6 K T QU THI T K THÍ NGHI M KH SVTH: TR N TH KI U U 48 ii T NG QUAN TÀI LI U 3.7 K T QU THÍ NGHI M LEO D C 50 3.8 K T QU THÍ NGHI M BOX-BEHNKEN 52 3.9 K T QU KH O SÁT S NG T NG C A L PLANTARUM NT1.5 57 4.1 K T LU N 61 4.2 KI N NGH 62 TÀI LI U THAM KH O 63 PH L C 68 SVTH: TR N TH KI U iii T NG QUAN TÀI LI U DANH M C CH VI T T T ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming unit Cs C ng s L plantarum Lactobacillus plantarum MRS Deman, Rogosa and Sharpe Nm nanomet OD Optical Density P-B Plackett-Burman WHO World Health Organization BSH Bile salt hydrolase SVTH: TR N TH KI U iv T NG QUAN TÀI LI U DANH M C HÌNH NH Hình 1.1 Streptococcus Hình 1.2 Lactobacillus Hình 1.3 Lactobacillus plantarum i kính hi n t (Reichelt J., 2013) Hình 1.6 H th u n m t trình 13 Hình 1.8 Ma tr n b trí thí nghi m theo thi t k Box Behnken (Box Behnken, 1960) 20 Hình 1.9 Giao di n ph n m m Minitab 16.2.0 22 SVTH: TR N TH KI U v T NG QUAN TÀI LI U DANH M C B NG B ng 2.1 Các ngu o sát 28 B ng 2.2 Các ngu n cacbon kh o sát 29 B ng 2.3 Các ngu n khoáng kh o sát 30 B ng 3.1: Giá tr 610 m t bào (Log(N/mL) 35 B ng 3.2 Giá tr OD610 theo th i gian 36 B ng 3.3 M t bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) t i m i giá tr nhi pH kh o sát 38 B ng 3.4 Giá tr log (N/ mL) c a ngu o sát 40 B ng 3.5 Giá tr log (N/ mL) c a ngu n cacbon kh o sát 41 B ng 3.6 Giá tr log (N/ mL) c a ngu n mu i khoáng kh o sát 43 B ng 3.7 M c ng c a t ng y u t 44 B ng 3.8: K t qu thí nghi m Plackett- Burman 45 B ng 3.10 B c chuy ng c a y u t ng 50 B ng 3.11 K t qu thí nghi m leo d c 51 B ng 3.12 B ng giá tr bi n s thí nghi m Box-Behnken 53 B ng 3.13 B ng bi n s giá tr thí nghi m Box-Behnken 53 B ng 3.14 K t qu giá tr t a y u t 56 B ng 3.15 Giá tr OD theo th i gian 57 SVTH: TR N TH KI U i T NG QUAN TÀI LI U DANH M th 3.4 K t qu kh o sát ngu TH 40 th 3.5 K t qu kh o sát ngu n Cacbon 42 th 3.6 K t qu kh o sát ngu n mu i khoáng 43 th th th th ng (Main Effects Plot) 47 ng m c bi u di n m i quan h gi a m t bào v i c p bi n khác 55 th th b m t bi u di n m i quan h gi a m t bào v i c p bi n khác 56 th ng c a L plantarum NT 1.5 theo th i gian ng t SVTH: TR N TH KI U 58 ii T NG QUAN TÀI LI U TV SVTH: TR N TH KI U TÀI LI U THAM KH O TÀI LI U THAM KH O Ti ng Vi t [1] Nguy n Tú Anh, Lê Th M Linh, Nguy u ki n ni c y thích h p cho vi khu n , T p chí Y h c TP HCM, c, 7(4), Tr 195-197 [2] Nguy p, Bùi Hà Thanh, (1994-1996), "Nghiên c u thơng s thích h p qui trình cơng ngh lên men s n xu t ch ph m vi khu n lactic", Tuy n t p công tác nghiên c u Vi n Sinh H c Nhi i, NXB Nông Nghi p [3] Nguy n Lân D ng (1983), Th c t p Vi sinh v t h c i h c & Trung h c chuyên nghi p, Hà N i [4] Nguy thu t [5] Nguy , Nguy Quy ho ch th c nghi m k t b n Khoa h c k thu t Hà N i, Tr.9-26, 138-216 t (2011), sinh h c vi sinh v t t p ih Ph m [6] Nguy n Th H ng Hà, Lê Thiên Minh, Nguy u công ngh s n xu t ch ph m vi khu Tuy n t p báo cáo t i H i ngh Cơng ngh Sinh h c tồn qu 2003, Tr 251-255 [7] Giang Th Kim Liên (2009), Bài gi ng Qui ho ch th c nghi pháp th ng kê x lý s li u th c nghi m) [8] Minh Giang iH ng , Ph m Th Tuy t, Ki u H u nh, Nguy n Th m sinh h c c a ch ng vi khu n lactic phân l p a bàn thành ph Hà N T p chí Khoa h c T nhiên Công ngh , 24, Tr.221-226 [9] t Linh, Nguy Anh Thi n, Ph m Tr Dung, Ph m Th Minh Trang, Tr Sàng l c vi khu n lactic có ho t tính gi H i ngh Cơng ngh sinh h c tồn qu c khu v c phía Nam l sinh h c cu c s SVTH: TR N TH KI U , Tr 151 63 TÀI LI U THAM KH O [10] Nguy cL ng ng (2003), Thí nghi m cơng ngh sinh h c t p 1- thí nghi m hóa sinh h c, Nhà xu t b [11] Nguy i h c qu c gia TP H Chí Minh n Ng c Trai (2012), phân l p n ch n vi khu n Lactobacillus sp có kh [12] Tr c ch vi khu n gây b nh gan th n m T p chí Khoa h c, Pp 224-234 c, Nguy H c Hoàng, Phan Th Th c t p vi sinh v t, Nhà xu t b m Th i h c Qu c gia TP.HCM, Tr.15, 37, 39, 43 [13] Tr ng Th o, Anh Tu n, Cao Th Ng Võ C m Quy (2011), Th c t p vi sinh v t, Nhà xu t b ng, i h c Qu c gia H Chí Minh Ti ng Anh [14] -coumarate decarboxylase gene from Lactobacillus plantarum reveals the existence of two othe Appl Environ Microbiol, 66: Pp 3368-3375 [15] Barthelmebs, L., Divies, C and Cavin, Jof the phenolic acid metabolism in the lactic acid bacteria Lactobacillus Lait, 81:Pp 161-171 [16] Bevilacqua A., Corbo M R., Mastromatteo M and Sinigaglia M (2008), -ammonium hydrogen citrate on the biomass production and acidifying ability of a probiotic Lactobacillus plantarum World J Microbiol Biotechnol, 24:Pp 1721 1729 [17] Daeschel M A and Nes I F (1995), Lactobacillus plantarum: physiology, genetics and applications in foods, in Food Biotechnology Microorganisms, New York, chap 21, Pp 721-743 SVTH: TR N TH KI U 64 TÀI LI U THAM KH O [18] David M I., Weinert E., Kim C.S., Joseph M M and Sherri A M (2013), College of Tropical Agriculture and , [19] David D., Tryon V V and Dennis J P Embden-Meyerhof-Parnas Pathway and the Hexo Journal of General Microbiology, Vol 135, Pp.683-691 [20] evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including Co´rdoba, Argentina [21] Farooq U., Anjum F M., Zahoor T., Rahman S U., Randhawa A., Ahmed A and Optimization of lactic acid production from cheap raw , Pak J Bot., 44(1):Pp.333-338 [22] Han B., Yu Z., Liu B., Ma Q and Zhang R cteriocin production by Lactobacillus plantarum YJG, isolated from the mucosa of the gut African Journal of Microbiology Research, Pp 1147-1155 [23] Karlsson C., Ahrne S and incipient arteriosclerosis initiates increased bacterial diversity in colon: a Atherosclerosis [24] Kleerebezem M., Boekhorst J., Kranenburg R V., Molenaar D., Kuipers O P., Leer R., Tarchini R., Peters S A., Sandbrink H M., Fiers M W E J., Stiekema W., Lankhorst R M K., Bron P A., Hoffer S M., Groot M N N., Kerkhoven Proc Natl Acad Sci U.S.A, 100:Pp 1990-1995 [25] Lim H J., Kim S Y and Lee W K (2004), Isolation of cholesterol-lowering Veterinary Science SVTH: TR N TH KI U 65 TÀI LI U THAM KH O [26] Lonnermark E., Friman V and Lactobacillus plantarum reduces certain gastrointestinal symptoms during treatment with J Clin Gastroenterol [27] Marcel D Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional , Library of congress Cataloging-in- publication Data, ISBN 0-203- 02673 X Master e-book ISBN [28] Nagarjun P A., Rao R S., Rajesham S and Rao L V Lactic Acid Production in SSF by Lactobacillus amylovorus NRRL B-4542 Using Taguchi Me The Journal of icrobiology, Pp 38-43 [29] Muhamad Nor N., Mohamad R., Ling Foo H and Rahim R A (2010), Improvement of Folate Biosynthesis by Lactic Acid Bacteria Using Response Food Technol Biotechnol, 48(2):Pp 243 250 [30] Nissen L., Chingwaru W and of new putative probiotic/protective Lactobacillus spp Strains: a functional study Int J Food Microbiol, Pp 288-94 [31] Ooi L G and Liong M T -Lowering Effects of Probiotics International Journal of Molecular Sciences [32] Plackett R L and actorial Biometrika, Pp 305-325 [33] Qin H., Zhang Z and L.plantarum prevents enteroinvasive Escherichia coli-induced tight junction protein changes in intestinal epithelial BMC MicrobioJ, Pp 31;9;63 [34] Reich Bacterial Fermentation Pty Ltd [35] Shahravy A., Tababdeh F., Bambai B., Zamanizadeh H R and Mizani M (2012), Optimization of probiotiic Lactobicillus casei ATCC 334 production using date SVTH: TR N TH KI U 66 TÀI LI U THAM KH O Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterl, Pp [36] Tanaka H., Doesburg K., Iwasaki T and Mierau I se World Journal of Microbiology & Biotechnology [37] from Lactobacillus plantarum Archiva Zootechnica, Pp 92-101 [38] International Journal of Food Microbiology , 96: Pp 199-204 [39] Waugh A W G., Foshaug R., Macfarlane S., Doyle J., Churchili T A., Sydora B Microbial Ecology in Health and Disease, Pp 33-37 [40] Ziarno M., Sekul E and Lafraya A A , Acta Sci Pol., Technol Aliment, Pp 83-94 Tài li u web [41] Learn about the Importance of Good Bacteria, Part II: Lactobacillus Plantarum (2010) http://www.naturalnews.com/027845_probiotics_health.html##ixzz32e0f5rNg [42].WHO(2013), http://www.who.int/gho/ncd/risk_factors/cholesterol_text/en/index.html SVTH: TR N TH KI U 67 PH L C PH L C PH L C 1: Thành ph NG ng MRS: Peptone 10 g Cao th t 10 g Cao n m men g Glucose 20 g K2HPO4 g Natri acetate g MgSO4.7H2O 0,2 g MnSO4.4H2O 0,2 g Tween 80 mL (NH4)citrate g c 1000 mL Thành ph ng MRSA: gi ng thành ph ng MRS sung thêm 20g agar SVTH: TR N TH KI U 68 PH L C PH L C 2: B NG K T QU B ng 2.1 K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t kh o sát pH, nhi n kh SVTH: TR N TH KI U ng c a ng c a L plantarum NT1.5 69 PH L C B ng 2.1 K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t c a ngu n kh o sát SVTH: TR N TH KI U 70 PH L C B ng 2.2.Kk t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t c a ngu n Cacbon kh o sát SVTH: TR N TH KI U 71 PH L C B ng 2.3 K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t c a ngu n mu i khoáng kh o sát SVTH: TR N TH KI U 72 PH L C th 2.1: SVTH: TR N TH KI U th ng chu n hóa 73 PH L C th 2.2 Pareto c a y u t SVTH: TR N TH KI U ng 74 PH L C B ng 2.4 K t qu phân tích h SVTH: TR N TH KI U cho thí nghi m P-B 75 PH L C B ng 2.5 K t qu phân tích h i SVTH: TR N TH KI U a thí nghi m kh u 76 PH L C B ng 2.6 K t qu phân tích h SVTH: TR N TH KI U a thí nghi m Box-Behnken 77 ... ng (Genus): Lactobacillus Loài: L Plantarum 1.1.3.2 m chung c a vi khu n Lactobaciillus plantarum Lactobacillus plantarum m t tro plantarum vi khu SVTH: TR N TH KI U Lactobacillus Lactobacillus... ch ng L plantarum NT1.5 gu n khoáng nh y u t n trình t Lactobacillus plantarum NT1.5 b ng thi t k Plackett nh giá tr t b nh th i a thành ph i c a Burman (P - B) u ki n nuôi c y -Behnken Nuôi c... A L PLANTARUM NT 1.5 D a vào k t qu xây d am t bào vi khu n giá tr OD610 ti n hành xây d ng c a ch ng Lactobacillus plantarum NT1.5 S plantarum NT1.5 c theo dõi t i th nh ng m c th i gian nuôi