Bất lợi duy nhất của việc tối ưu hóa là nó không phản ánh những tác động tương tác giữa các biến được sử dụng và không biểu hiện chính xác hiệu quả của các biến khác nhau dựa vào hoạt độ
Trang 1Sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy để sản xuất enzyme Lypase với Canida sp 99- 125
Trang 2Tóm tắt lý thuyết
Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) được sử dụng để tối ưu hoá môi trường sản xuất Lypase với Canida sp 99- 125 Bước đầu, ma trận Plakett-Burmen đã được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của các thành phần khác nhau trong môi trường nuôi cấy Dầu đậu nành, bột đậu nành và K2HPO4 có ảnh hưởng đáng kể đến việc sản xuất lipase Nồng độ của ba yếu tố được lựa chọn ở mức phù hợp nhất sau đó tổng hợp lại và phân tích bề mặt phản ứng Điều kiện trên cho phép xuất lipase được tăng lên 5.000-6.230 IU / ml Trong
hệ thống bình lắc Sự lên men lipase trong 5L lên men đạt 9.600 IU / ml
© 2006 Nhà xuất bản Elsevier B.V
Từ khoá: Lipase, Lên men, tối ưu hoá môi trường, phương pháp đáp ứng bề mặt
Trang 31 Mở đầu:
Lipase (EC3.1.1.3) xúc tác cho quá trình thủy phân triglyceride các acid béo và glycerol, được sử dụng rộng rãi trong việc thay đổi thành phần chất béo và các loại dầu Trong những thập kỷ gần đây, lipase được chứng minh rằng có thể được sử dụng trong tổng hợp enzyme không chứa nước cho sản xuất hợp chất quang học tinh khiết Lipase có tiềm năng trong công nghiệp vì là chất xúc tác cho quá trình thủy phân, tổng hợp và chuyển vị este của tri-acyglycerols do có nhiều ưu điểm như được sản xuất nhiều và đa dạng Lipase từ Canida sp là lipase có tình thương mại hoá nhất Nó rất hữu ích trong các chuỗi chuyển hoá sinh học Tiêu biểu không chỉ để thuỷ phân ester, trans-esterify triglycerides, giải quyết các hỗn hợp racemic, mà còn có thể tổng hợp este và peptide
Hoạt động của lipase và việc sản xuất phụ thuộc vào thành phần của môi trường lên men Việc tối ưu hóa chung bằng cách thay đổi một tham số trong khi vẫn giữ các biến còn lại
ổn định ở mức độ liên tục Bất lợi duy nhất của việc tối ưu hóa là nó không phản ánh những tác động tương tác giữa các biến được sử dụng và không biểu hiện chính xác hiệu quả của các biến khác nhau dựa vào hoạt động của enzyme Để khắc phục những vấn đề lớn này, các nghiên cứu được thực hiện, nhờ vào việc sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM), áp dụng thuật toán và kỹ thuật thống kê diện rộng để xác định tầm ảnh hưởng của các biến, đồng thời tối ưu hóa các quy trình công nghệ sinh học khác nhau
Ma trận Plackett-Burmen (P-B) được thiết kế như một ma trận cấp 2, yêu cầu phải chạy ít nhất 1 phép so sánh, có thể được sử dụng để xác định các biến độc lập từ danh sách dài các yếu tố, sau đó chọn biến tối ưu nhất Đường kẻ biến thiên theo phương pháp gốc toạ
độ, dọc đường gốc mà đi lên, theo hướng tăng dần (giảm) tuỳ thuộc vào phản ứng Phương pháp đáp ứng bề mặt – Thiết kế cấu trúc có tâm có thể tìm ra các mối quan hệ giữa các biến và phản ứng, hơn nữa, sự tối ưu của mỗi biến có thể thu được bằng sự khác biệt xấp xỉ Kỹ thuật này được sử dụng để nghiên cứu tối ưu hóa các thông số hóa lý và các yếu tố của các quá trình lên men tầm trung với vi sinh vật khác nhau Có một số nghiên cứu dựa vào RSM để sản xuất lipase Nhưng các phương pháp được sử dụng trong thí nghiệm chỉ thay đổi nguồn cacbon
Tan et al đã thực hiện một nghiên cứu sơ bộ trong sản xuất lipase với Candida sp
99-125 Sản lượng lipase thu được tối đa đạt 8.300 IU / ml trong 30 l lên men Hiện nay, phương pháp bề mặt đáp ứng bao gồm ma trận Plackett-Burmen, con đường tối ưu hoá nhất và thiết kế tổng hợp tối ưu nhằm so sánh và tối ưu hóa tiên tiến của các thành phần môi trường bao gồm nguồn cacbon , nguồn nitơ và hợp chất vô cơ cho sản xuất lipase
Trang 42 Nguyên liệu và phương pháp
2.1 Vi sinh vật
Candida sp 99-125 được bảo quản trong môi trường thạch nghiêng ở nhiệt độ 4oC trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật tăng trưởng trong môi trường thạch chứa (W/v) 0,2% cao nấm men, 0,5% peptone, 1% glucose và 2% agar Môi trường nghiêng được ủ ở nhiệt độ
26oC trong 72 tiếng
2.2 Hóa chất
Dầu oliu được sử dụng như một loại hóa chất Tất cả các hóa chất khác được coi như chất phân tích Dầu đậu nành và bột đậu nành có thể mua được ở các chợ địa phương
2.3 Chất truyền nhiễm
Giống được cấy trong môi trường chứa dầu đậu nành (4%), bột đậu tương (4%), K2HPO4 (0,1%), KH2PO4 (0,1%) Sau khi cấy ở nhiệt độ 26oC trong 220 rpm 48 tiếng, 2ml huyền phù (3 × 108 tế bào / ml) như là chất truyền nhiễm cho bình lắc 250ml có 50ml môi trường sản xuất
2.4 Sản xuất enzyme Lipase
2.4.1 Hệ thống bình lắc
Môi trường được khử trùng ở 121oC trong 25 phút Thành phần trong môi trường và các cấu tử được sử dụng trong thành phần biến đổi theo sơ đồ ma trận pH ban đầu trong khoảng từ 6 đến 7 Mẻ cấy được ủ ở 26oC trong 120 tiếng trong vòng lắc duy trì ở 20 rpm
2.4.2 5 lít chấy lên men
5 lít chất lên men truyền trong môi trường thuận lợi được khử trùng ở 121oC trong 25 phút Sau khi làm lạnh ở nhiệt độ 26oC, quá trình lên men được khởi tạo bằng cách truyền 7% (v/v) Môi trường được ủ ở 26oC và 220 rpm
2.5 Khảo sát hoạt tính Lipase
Hoạt tính Lipase được xác định theo phương pháp nhũ hóa dầu oliu Axit béo tạo ra được xác định bằng cách chuẩn độ với 0.05 mol/L NaOH Một đơn vị tính của lipase định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng axit béo 1 mol trong một phút dưới nhiệt
độ 40 ◦C
Trang 52.6 Thiết kế thí nghiệm
Trong các thí nghiệm sơ bộ, chúng ta đánh giá nhiều loại carbon và nguồn nitơ, muối vô
cơ cho sự thích nghi của vi sinh vật để duy trì quá trình sản xuất Lipase do Candida sp 99-125 Sơ bộ dữ liệu chỉ ra rằng các yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất nuôi cấy mẻ Lipase là dầu đậu nành, bột đậu nành, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4 and Span 60 Vì thế, 7 thành phần được chọn để tối ưu hóa thông qua RSM
2.6.1 Thiết kế Plackett-Burmen
Các ảnh hưởng của bảy yếu tố về năng suất lipase đã được nghiên cứu sử dụng phương pháp luận của Plackett-Burmen Mỗi yếu tố độc lập đã được thử nghiệm ở hai cấp độ, mức cao (1) và (-1) ở mức độ thấp Hai mức của bảy yếu tố là dầu đậu tương (X1): 3% và 4%; (NH4) 2SO4 (X2): 0,1% và 0,125%; K2HPO4 (X3): 0,3% và 0,4%; KH2PO4 (X4): 0,1% và 0,125%; bột đậu tương (X5): 5,5% và 6,5%; MgSO 4 (X6): 0,05% và 0,06%; Span 60 (X7): 0,1% và 0,125% Mười hai thí nghiệm đã được thực hiện trong thí nghiệm này Ba yếu tố giả được sử dụng để ước tính các lỗi thử nghiệm và kiểm tra tính đầy đủ của các mô hình đầu tiên đặt ra Các phần mềm calculational SAS (phiên bản 8.0) được
sử dụng để phân tích hồi quy của các dữ liệu thực nghiệm thu được Chất lượng phù hợp của phương trình mô hình đầu tiên đặt ra được thể hiện bằng hệ số xác định R2, và ý nghĩa thống kê của nó được xác định bằng một chiếc F-test Ý nghĩa của các hệ số hồi quy đã được thử nghiệm bởi t-test
2.6.2 Đường lên xuống sự thấm
Dựa trên các kết quả thu được từ các thiết kế P-B, phương trình mô hình đầu tiên đặt ra là
Y được phản ứng dự đoán, β0, βi, là các hệ số không đổi, và xi là các biến độc lập hoặc các yếu tố Các hướng đi lên mạnh nhất (gốc) là hướng trong trong đó Y tăng (giảm) nhanh nhất Đường thường lấy là con đường nhanh nhất đi lên (gốc) dòng qua trung tâm của khu vực chủ yếu vs vùng xung quanh đến sát bề mặt Như vậy, bước dọc theo con đường là tỷ lệ thuận với hồi quy hệ số βi Con đường đi lên mạnh nhất (gốc) bắt đầu từ trung tâm của mô hình đầu tiên Để di chuyển xa
trung tâm mô hình đầu tiên trên con đường dốc đi lên (gốc), ta chuyển 1,0575, 0,6925, -0,037 trong dầu đậu nành, đậu tương bột, K2HPO4 trực tiếp, tương ứng Các đơn vị này
Trang 6mới được xác định theo phạm vi nồng độ của mức độ thống nhất từ mô hình đầu tiên và
tỷ lệ hệ số ước tính từ lần đầu tiên đặt ra mô hình phương trình (1)
2.6.3 Thiết kế phức hợp trung tâm (CCD) và phản ứng phân tích bề mặt
Một CCD với năm cấp độ mã hóa được sử dụng để khám phá tiểu vùng của bề mặt phản ứng trong khu vực xung quanh của việc tối ưu Trong ba yếu tố, việc xét này thực chất là đầy đủ 23 thiết kế thừa có sáu điểm dọc trục (hay gọi là điểm sao) và sáu nhân rộng các điểm trung tâm, kết quả là tổng số 20 thí nghiệm Các kết quả thực nghiệm của CCD là trùng với một bậc hai phương trình đa thức bởi một nhiều kỹ thuật hồi quy
Y là dự đoán phản ứng, β0, βi, βii, βij là các hệ số không đổi, và xi, xj là các biến mã hóa độc lập hoặc các yếu tố Hình dạng của phương trình mô hình thứ hai để được thể hiện bằng hệ số xác định R2, và ý nghĩa thống kê của nó được xác định bằng một chiếc F-test
Ý nghĩa của các hệ số hồi quy được kiểm tra bằng t-test
Trang 73 Kết quả và thảo luận
3.1 Thiết kế Plackett-Burmen
BẢNG 1
Các kết quả thử nghiệm của sản xuất lipase bởi một Plackett-Burmen thiết kế được thể hiện trong
bảng 1 Analysed bởi phần mềm SAS, một mô hình thứ tự đầu tiên được trang bị cho các
dữ liệu thu được từ cuộc thí nghiệm Những ảnh hưởng của bảy yếu tố: dầu đậu nành (X1), (NH4) 2SO4 (X2), K2HPO4 (X3), KH2PO4 (X4), bột đậu tương (X5), MgSO 4 (X6) và Span 60 (X7) được tính toán là 211,5,
-40,7, -74, 1, -138,5, 24, 42.7, tương ứng Chúng tôi thu được theo mô hình trong các biến mã hóa
Thứ tự đầu tiên phương trình mô hình :
Y1 (IU/ml) = 493.3 + 211.5X1 − 40.7X2 − 74X3 + X4 − 138.5X5 + 24X6 + 42.7X7
3.2 Đường dốc lên (xuống).
Dựa trên các phương trình mô hình đầu tiên để thu được và ba yếu tố ảnh hưởng quan trọng trên, con đường dốc đi lên (gốc) đã được xác định để tìm hướng thích hợp thay đổi biến tăng hoặc giảm nồng độ theo các dấu hiệu của tác động chính để cải thiện sản xuất lipase Con đường đi lên dốc bắt đầu từ trung tâm của thiết kế Plackett-Burmen và di chuyển dọc con đường, trong đó nồng độ của dầu đậu tương tăng, trong khi bột đậu tương và K2HPO4 giảm Thiết kế và kết quả của con đường đi lên của các thí nghiệm
mạnh nhất là thể hiện trong Bảng 3 Người ta thấy rằng các phản ứng cao nhất được 5980
IU / ml khi vừa là: (w / v) dầu đậu tương 4,56%, bột đậu tương 5,31% và K2HPO4
0,31% Nó gợi ý rằng điểm là gần khu vực sản xuất tối đa phản ứng
Trang 83.3 Thiết kế hợp chất trung tâm và nghiên cứu các phản ứng bề mặt
Thiết kế hợp chất trung tâm (CCD) được tiến hành trong vùng lân cận tối ưu để xác định
vị trí các nồng độ tối ưu thực sự của dầu đậu nành (U1), bột đậu tương (U2) và K2HPO4 (U3) cho sản xuất lipase Các cấp độ của các biến cho các thí nghiệm CCD được lựa chọn theo các kết quả trước đó
Ma trận thiết kế và thử nghiệm tương ứng dữ liệu được thể hiện trong Bảng 4
Thiết kế CCD được trang bị với đa thức bậc hai Sự phù hợp của mô hình đã được kiểm tra bởi hệ số xác định R2, mà đã được tính toán là 0,9108, chỉ ra rằng 91.08% của những biến đổi trong các phản ứng có thể được giải thích bằng mô hình Ý nghĩa thống kê của bậc hai mô hình phương trình được đánh giá bởi các phân tích F-test phương sai trong đó tiết lộ rằng hồi quy này có ý nghĩa thống kê (P <0,0004) ở mức 99% của mức độ tin cậy
Nó chỉ ra rằng bột dầu đậu tương và đậu tương có tầm quan trọng cao (P = 0,0094 và 0,0042, tương ứng) trên sản xuất lipase, vì dầu đậu tương là carbon và năng lượng nguồn lực cho sự căng thẳng và có hiệu lực quy nạp vào sản xuất lipase Mặt khác, bột đậu tương được cung cấp nitơ nguồn lực để hình thành các enzyme (lipase) trong sự căng thẳng Các tác động qua lại của mỗi yếu tố, tuy nhiên, không có ý nghĩa
Các lô đường viền được mô tả bởi phương trình mô hình (Y2) làđại diện trong hình 1-3
Nó chỉ ra rằng lipase tối đa năng suất đạt 6200 IU / ml khoảng Nồng độ tối ưu cho ba thành tố như thu được từ tối đa điểm của mô hình được tính bằng các phần mềm SAS được 4,187%, 5,840% và 0,284% đối với dầu đậu nành, bột đậu tương và K2HPO4, tương ứng Mô hình dự đoán tối đa phản ứng của 6218 IU / ml sản lượng lipase cho thời điểm này
Trang 93.4 Xác minh các điều kiện tối ưu
Để xác nhận các kết quả này, quá trình lên men lipase được thực hiện với một môi trường nuôi cấy đại diện cho điểm tối đa và năng suất lipase 6230 IU / ml (trung bình của ba lần lặp lại) Kết quả cải thiện khoảng 20% so với tối ưu hóa biến duy nhất của môi trường nuôi cấy, trong đó sản lượng lipase là 5000 IU / ml Các cũng tương quan giữa giá trị dự đoán và đo các thí nghiệm biện minh cho tính hợp lệ của các mô hình phản ứng và sự tồn tại của một điểm tối ưu So với kết quả báo cáo trên, sản lượng lipase đạt 9.600 IU / ml trong 5 l lên men (Thể hiện trong hình 4.) cao hơn so với kết quả trong 30 l lên men đề cập trong Ref 15 Thời gian lên men, tuy nhiên, kéo dài đến khoảng 168 h Người ta tin rằng sản lượng lipase trong thang điểm 30 l lên men trong điều kiện tối ưu này sẽ cao hơn
Trang 104 Kết luận:
Các phương pháp đáp ứng bề mặt cho phép sàng lọc nhanh những yếu tố ảnh hưởng quan trọng và phát triển của một mô hình đa thức để tối ưu hóa môi trường nuôi cấy trong việc sản xuất lipase từ Candida sp 99-125 Giá trị R2 là 0,91 cho thấy sự phù hợp của mô hình với các dữ liệu thực nghiệm Mô hình đã được dự đoán chính xác điểm sản xuất lipase tối
đa Các môi trường nuôi cấy tối ưu là (w/v) dầu đậu tương 4,187%, bột đậu nành 5,840%, K2HPO4 0,284%, KH2PO4 0,1%, (NH4) 2SO4 0,1%, MgSO4 0,05% và Span 60 0,1% Các mẻ lipase tăng lên đến 6230 và 9600 IU / ml trong hệ thống bình lắc và 5 l lên men tương ứng, thực tế là cao hơn so với kết quả báo cáo