Sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy để sản xuất enzyme lypase với canida sp 99 125

Sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt để tối ưu hoá môi trường nuôi cấy để sản xuất enzyme Lypase với Canida sp 99- 125 Tóm tắt lý thuyết Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) sử dụng để tối ưu hoá môi trường sản xuất Lypase với Canida sp 99- 125 Bước đầu, ma trận Plakett-Burmen sử dụng để đánh giá ảnh hưởng thành phần khác môi trường nuôi cấy Dầu đậu nành, bột đậu nành K2HPO4 có ảnh hưởng đáng kể đến việc sản xuất lipase Nồng độ ba yếu tố lựa chọn mức phù hợp sau tổng hợp lại phân tích bề mặt phản ứng Điều kiện cho phép xuất lipase tăng lên 5.000-6.230 IU / ml Trong hệ thống bình lắc Sự lên men lipase 5L lên men đạt 9.600 IU / ml © 2006 Nhà xuất Elsevier B.V Từ khoá: Lipase, Lên men, tối ưu hoá môi trường, phương pháp đáp ứng bề mặt 1 Mở đầu: Lipase (EC3.1.1.3) xúc tác cho trình thủy phân triglyceride acid béo glycerol, sử dụng rộng rãi việc thay đổi thành phần chất béo loại dầu Trong thập kỷ gần đây, lipase chứng minh sử dụng tổng hợp enzyme không chứa nước cho sản xuất hợp chất quang học tinh khiết Lipase có tiềm công nghiệp chất xúc tác cho trình thủy phân, tổng hợp chuyển vị este tri-acyglycerols có nhiều ưu điểm sản xuất nhiều đa dạng Lipase từ Canida sp lipase có tình thương mại hoá Nó hữu ích chuỗi chuyển hoá sinh học Tiêu biểu không để thuỷ phân ester, trans-esterify triglycerides, giải hỗn hợp racemic, mà tổng hợp este peptide Hoạt động lipase việc sản xuất phụ thuộc vào thành phần môi trường lên men Việc tối ưu hóa chung cách thay đổi tham số giữ biến lại ổn định mức độ liên tục Bất lợi việc tối ưu hóa không phản ánh tác động tương tác biến sử dụng không biểu xác hiệu biến khác dựa vào hoạt động enzyme Để khắc phục vấn đề lớn này, nghiên cứu thực hiện, nhờ vào việc sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM), áp dụng thuật toán kỹ thuật thống kê diện rộng để xác định tầm ảnh hưởng biến, đồng thời tối ưu hóa quy trình công nghệ sinh học khác Ma trận Plackett-Burmen (P-B) thiết kế ma trận cấp 2, yêu cầu phải chạy phép so sánh, sử dụng để xác định biến độc lập từ danh sách dài yếu tố, sau chọn biến tối ưu Đường kẻ biến thiên theo phương pháp gốc toạ độ, dọc đường gốc mà lên, theo hướng tăng dần (giảm) tuỳ thuộc vào phản ứng Phương pháp đáp ứng bề mặt – Thiết kế cấu trúc có tâm tìm mối quan hệ biến phản ứng, nữa, tối ưu biến thu khác biệt xấp xỉ Kỹ thuật sử dụng để nghiên cứu tối ưu hóa thông số hóa lý yếu tố trình lên men tầm trung với vi sinh vật khác Có số nghiên cứu dựa vào RSM để sản xuất lipase Nhưng phương pháp sử dụng thí nghiệm thay đổi nguồn cacbon Tan et al thực nghiên cứu sơ sản xuất lipase với Candida sp 99125 Sản lượng lipase thu tối đa đạt 8.300 IU / ml 30 l lên men Hiện nay, phương pháp bề mặt đáp ứng bao gồm ma trận Plackett-Burmen, đường tối ưu hoá thiết kế tổng hợp tối ưu nhằm so sánh tối ưu hóa tiên tiến thành phần môi trường bao gồm nguồn cacbon , nguồn nitơ hợp chất vô cho sản xuất lipase 2 Nguyên liệu phương pháp 2.1 Vi sinh vật Candida sp 99-125 bảo quản môi trường thạch nghiêng nhiệt độ oC phòng thí nghiệm Vi sinh vật tăng trưởng môi trường thạch chứa (W/v) 0,2% cao nấm men, 0,5% peptone, 1% glucose 2% agar Môi trường nghiêng ủ nhiệt độ 26oC 72 tiếng 2.2 Hóa chất Dầu oliu sử dụng loại hóa chất Tất hóa chất khác coi chất phân tích Dầu đậu nành bột đậu nành mua chợ địa phương 2.3 Chất truyền nhiễm Giống cấy môi trường chứa dầu đậu nành (4%), bột đậu tương (4%), K2HPO4 (0,1%), KH2PO4 (0,1%) Sau cấy nhiệt độ 26 oC 220 rpm 48 tiếng, 2ml huyền phù (3 × 108 tế bào / ml) chất truyền nhiễm cho bình lắc 250ml có 50ml môi trường sản xuất 2.4 Sản xuất enzyme Lipase 2.4.1 Hệ thống bình lắc Môi trường khử trùng 121oC 25 phút Thành phần môi trường cấu tử sử dụng thành phần biến đổi theo sơ đồ ma trận pH ban đầu khoảng từ đến Mẻ cấy ủ 26 oC 120 tiếng vòng lắc trì 20 rpm 2.4.2 lít chấy lên men lít chất lên men truyền môi trường thuận lợi khử trùng 121 oC 25 phút Sau làm lạnh nhiệt độ 26 oC, trình lên men khởi tạo cách truyền 7% (v/v) Môi trường ủ 26oC 220 rpm 2.5 Khảo sát hoạt tính Lipase Hoạt tính Lipase xác định theo phương pháp nhũ hóa dầu oliu Axit béo tạo xác định cách chuẩn độ với 0.05 mol/L NaOH Một đơn vị tính lipase định nghĩa lượng enzyme cần thiết để giải phóng axit béo mol phút nhiệt độ 40 ◦C 2.6 Thiết kế thí nghiệm Trong thí nghiệm sơ bộ, đánh giá nhiều loại carbon nguồn nitơ, muối vô cho thích nghi vi sinh vật để trì trình sản xuất Lipase Candida sp 99-125 Sơ liệu yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất nuôi cấy mẻ Lipase dầu đậu nành, bột đậu nành, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4 and Span 60 Vì thế, thành phần chọn để tối ưu hóa thông qua RSM 2.6.1 Thiết kế Plackett-Burmen Các ảnh hưởng bảy yếu tố suất lipase nghiên cứu sử dụng phương pháp luận Plackett-Burmen Mỗi yếu tố độc lập thử nghiệm hai cấp độ, mức cao (1) (-1) mức độ thấp Hai mức bảy yếu tố dầu đậu tương (X1): 3% 4%; (NH4) 2SO4 (X2): 0,1% 0,125%; K2HPO4 (X3): 0,3% 0,4%; KH2PO4 (X4): 0,1% 0,125%; bột đậu tương (X5): 5,5% 6,5%; MgSO (X6): 0,05% 0,06%; Span 60 (X7): 0,1% 0,125% Mười hai thí nghiệm thực thí nghiệm Ba yếu tố giả sử dụng để ước tính lỗi thử nghiệm kiểm tra tính đầy đủ mô hình đặt Các phần mềm calculational SAS (phiên 8.0) sử dụng để phân tích hồi quy liệu thực nghiệm thu Chất lượng phù hợp phương trình mô hình đặt thể hệ số xác định R2, ý nghĩa thống kê xác định F-test Ý nghĩa hệ số hồi quy thử nghiệm t-test 2.6.2 Đường lên xuống thấm Dựa kết thu từ thiết kế P-B, phương trình mô hình đặt Y phản ứng dự đoán, β0, βi, hệ số không đổi, xi biến độc lập yếu tố Các hướng lên mạnh (gốc) hướng trong Y tăng (giảm) nhanh Đường thường lấy đường nhanh lên (gốc) dòng qua trung tâm khu vực chủ yếu vs vùng xung quanh đến sát bề mặt Như vậy, bước dọc theo đường tỷ lệ thuận với hồi quy hệ số βi Con đường lên mạnh (gốc) trung tâm mô hình Để di chuyển xa trung tâm mô hình đường dốc lên (gốc), ta chuyển 1,0575, -0,6925, -0,037 dầu đậu nành, đậu tương bột, K2HPO4 trực tiếp, tương ứng Các đơn vị xác định theo phạm vi nồng độ mức độ thống từ mô hình tỷ lệ hệ số ước tính từ lần đặt mô hình phương trình (1) 2.6.3 Thiết kế phức hợp trung tâm (CCD) phản ứng phân tích bề mặt Một CCD với năm cấp độ mã hóa sử dụng để khám phá tiểu vùng bề mặt phản ứng khu vực xung quanh việc tối ưu Trong ba yếu tố, việc xét thực chất đầy đủ 23 thiết kế thừa có sáu điểm dọc trục (hay gọi điểm sao) sáu nhân rộng điểm trung tâm, kết tổng số 20 thí nghiệm Các kết thực nghiệm CCD trùng với bậc hai phương trình đa thức nhiều kỹ thuật hồi quy Y dự đoán phản ứng, β0, βi, βii, βij hệ số không đổi, xi, xj biến mã hóa độc lập yếu tố Hình dạng phương trình mô hình thứ hai để thể hệ số xác định R2, ý nghĩa thống kê xác định F-test Ý nghĩa hệ số hồi quy kiểm tra t-test 3 Kết thảo luận 3.1 Thiết kế Plackett-Burmen BẢNG Các kết thử nghiệm sản xuất lipase Plackett-Burmen thiết kế thể bảng Analysed phần mềm SAS, mô hình thứ tự trang bị cho liệu thu từ thí nghiệm Những ảnh hưởng bảy yếu tố: dầu đậu nành (X1), (NH4) 2SO4 (X2), K2HPO4 (X3), KH2PO4 (X4), bột đậu tương (X5), MgSO (X6) Span 60 (X7) tính toán 211,5, -40,7, -74, 1, -138,5, 24, 42.7, tương ứng Chúng thu theo mô hình biến mã hóa Thứ tự phương trình mô hình : Y1 (IU/ml) = 493.3 + 211.5X1 − 40.7X2 − 74X3 + X4 − 138.5X5 + 24X6 + 42.7X7 3.2 Đường dốc lên (xuống) Dựa phương trình mô hình để thu ba yếu tố ảnh hưởng quan trọng trên, đường dốc lên (gốc) xác định để tìm hướng thích hợp thay đổi biến tăng giảm nồng độ theo dấu hiệu tác động để cải thiện sản xuất lipase Con đường lên dốc trung tâm thiết kế Plackett-Burmen di chuyển dọc đường, nồng độ dầu đậu tương tăng, bột đậu tương K2HPO4 giảm Thiết kế kết đường lên thí nghiệm mạnh thể Bảng Người ta thấy phản ứng cao 5980 IU / ml vừa là: (w / v) dầu đậu tương 4,56%, bột đậu tương 5,31% K2HPO4 0,31% Nó gợi ý điểm gần khu vực sản xuất tối đa phản ứng 3.3 Thiết kế hợp chất trung tâm nghiên cứu phản ứng bề mặt Thiết kế hợp chất trung tâm (CCD) tiến hành vùng lân cận tối ưu để xác định vị trí nồng độ tối ưu thực dầu đậu nành (U1), bột đậu tương (U2) K2HPO4 (U3) cho sản xuất lipase Các cấp độ biến cho thí nghiệm CCD lựa chọn theo kết trước Ma trận thiết kế thử nghiệm tương ứng liệu thể Bảng Thiết kế CCD trang bị với đa thức bậc hai Sự phù hợp mô hình kiểm tra hệ số xác định R2, mà tính toán 0,9108, 91.08% biến đổi phản ứng giải thích mô hình Ý nghĩa thống kê bậc hai mô hình phương trình đánh giá phân tích F-test phương sai tiết lộ hồi quy có ý nghĩa thống kê (P