TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CÂY CHỦNG LACTOBACILLUS PLANTARUM NT1.5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM

B TR NGă GIÁO D CăVẨă ẨOăT O IH CM TP H CHÍ MINH KHĨA LU N T T NGHI P Tên đ tài: T Iă UăHỐăMỌIăTR NG NI C Y CH NG Lactobacillus plantarum NT1.5 B NGăPH NGăPHÁPă QUY HO CH TH C NGHI M KHOA CÔNG NGH SINH H C CHUYÊN NGÀNH: VI SINH ậ SINH H C PHÂN T GVHD: ThS D NGăNH T LINH SVTH : TR N TH KI U MSSV : 1053012348 KHOÁ: 2010 ậ 2014 Tp.H Chí Minh, tháng 05 n m 2014 L I C Mă N Em xin chân thành g i l i c m n đ n: Cô D Sinh h c Tr ngăNh t Linh th y Nguy năV năMinh ậ gi ng viên khoa Công ngh ng i H c M Tp H chí Minh, th y lƠ ng i đư t n tình h ng d n, t o u ki n, truy n đ t ki n th c đ em có th hoàn thành t t đ tài Chân thành c m n th y, cô khoa Công ngh Sinh h c tr ng i H cM Tp H Chí Minh đư t n tình gi ng d y, truy n đ t cho em nh ng ki n th c c b n làm n n t ng đ em có th hoƠn thƠnh đ tài Th y ană Duyă Pháp, ch Võ Ng c Y n Nhi, ch Ph m Th Minh Trang, ch Nguy n Th M Linh, anh Nguy nă nghi m, đ ng viên giúp đ em v t Phi lƠ ng i đư truy n đ t nh ng kinh t qua nh ng khó kh n th i gian th c hi n đ tài Xin c m n đ n anh/ ch , b n em Phòng thí nghi m Cơng ngh Vi sinh đư giúp đ , đ ng viên em th i gian qua Cu i cùng, xin g i l i c m n đ n Ba, M , gia đình đư bên c nh ng h t o u ki n t t nh t cho hoàn thành t t vi c h c t p c a Chân thành c m n! Bình D ng, ngƠy tháng n m 2014 TR N TH KI U SVTH: TR N TH KI U i T NG QUAN TÀI LI U M CL C T V Nă CH NGă1:ăăT NG QUAN TÀI LI U 1.1 T NG QUAN V VI KHU N LACTIC 1.1.1 Gi i thi u 1.1.2 Conăđ 1.1.3 T ng quan v Lactobacillus plantarum 1.2 ng bi năd ng c a vi khu n lactic TÌNH HÌNH NGHIÊN C UăTRONGăVẨăNGOẨIăN CV LACTOBACILLUS 10 1.2.1 Các nghiên c u th gi i 10 1.2.2 Các nghiên c uătrongăn 1.3 c 11 QUY HO CH TH C NGHI M 12 1.3.1 Ph 1.3.2 Thí nghi m sàng l c 14 1.3.3 Thí nghi m t iă uăhóa 16 1.4 CH ngăphápăquyăho ch th c nghi m 12 PH N M M QUY HO CH TH C NGHI M MINITAB 16.2.0 20 NGă2:ăV T LI UăVẨăPH NGăPHÁPăNGHIểNăC U 23 2.1 TH IăGIANăVẨă Aă I M NGIÊN C U 24 2.2 V T LI U NGHIÊN C U 24 2.2.1 iăt 2.2.2 Môiătr 2.2.3 D ng c 24 2.2.4 Trang thi t b 24 2.3 PH ng nghiên c u 24 ng ậ hóa ch t 24 NGăPHÁPăNGHIểNăC U 25 2.3.1 Ho t hóa ch ng 25 2.3.3 Xây d ngăđ SVTH: TR N TH KI U ngăcongăt ngătr ng c a L plantarum NT 1.5 26 i T NG QUAN TÀI LI U 2.3.4 Kh o sát nhi tăđ , pH thích h p cho s t ngătr NT1.5 27 2.3.5 Sàng l c y u t dinhăd 2.3.6 Thi t k thí nghi m tìm y u t ng c a L plantarum ng 28 nhăh ngăđ năquáătrìnhălênămenăt ngă sinh kh i theo thi t k Plackett- Burman 30 2.3.7 Thí nghi m kh iăđ u 32 2.3.8 Tìm kho ng t iă uăc a y u t nhăh ng b ngăph ngă pháp leo d c 32 Thí nghi m b m t ch tiêuăxácăđ nh giá tr t iă uăc a y u t 2.3.9 h nh ng 33 2.3.10 môiătr CH 3.1 Xácăđ nh th iăgianăt ngătr ng c a ch ng L plantarum NT1.5 ng t iă u 33 NGă3:ăK T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N 34 K T QU XÂY D NGă NGăT NGăQUANăGI A M Tă T BÀO VI KHU N VÀ GIÁ TR OD610 35 3.2 K T QU XÂY D NGă NGăCONGăT NGăTR NG C A L PLANTARUM NT 1.5 36 3.3 K T QU KH O SÁT NHI Tă TR NG C A L PLANTARUM NT1.5 38 3.4 K T QU SÀNG L C Y U T , pH THÍCH H P CHO S DINHăD T NGă NG 39 3.4.1 Ngu nănit 39 3.4.2 Ngu n cacbon 41 3.4.3 Ngu n khoáng 42 3.5 K T QU XÁCă NH CÁC Y U T NHăH NG CHÍNH THEO THI T K THÍ NGHI M PLACKETT- BURMAN 44 3.6 K T QU THI T K THÍ NGHI M KH Iă SVTH: TR N TH KI U U 48 ii T NG QUAN TÀI LI U 3.7 K T QU THÍ NGHI M LEO D C 50 3.8 K T QU THÍ NGHI M BOX-BEHNKEN 52 3.9 K T QU KH O SÁT S TRểNăMỌIăTR T NGăTR NG C A L PLANTARUM NT1.5 NG T Iă U 57 4.1 K T LU N 61 4.2 KI N NGH 62 TÀI LI U THAM KH O 63 PH L C 68 SVTH: TR N TH KI U iii T NG QUAN TÀI LI U DANH M C CH VI T T T ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming unit Cs C ng s L plantarum Lactobacillus plantarum MRS Deman, Rogosa and Sharpe Nm nanomet OD Optical Density P-B Plackett-Burman WHO World Health Organization BSH Bile salt hydrolase SVTH: TR N TH KI U iv T NG QUAN TÀI LI U DANH M C HÌNH NH Hình 1.1 Streptococcus Hình 1.2 Lactobacillus Hình 1.3 Lactobacillus plantarum d i kính hi năviăđi n t (Reichelt J., 2013) Hình 1.6 H păđenătrongăh th ngăđi u n m t trình 13 Hình 1.8 Ma tr n b trí thí nghi m theo thi t k Box ậ Behnken (Box Behnken, 1960) 20 Hình 1.9 Giao di n ph n m m Minitab 16.2.0 22 SVTH: TR N TH KI U v T NG QUAN TÀI LI U DANH M C B NG B ng 2.1 Các ngu nănit ăkh o sát 28 B ng 2.2 Các ngu n cacbon kh o sát 29 B ng 2.3 Các ngu n khoáng kh o sát 30 B ng 3.1: Giá tr đoăOD610 m tăđ t bào (Log(N/mL) 35 B ng 3.2 Giá tr OD610 theo th i gian 36 B ng 3.3 M tăđ t bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) t i m i giá tr nhi tăđ vƠăđ pH kh o sát 38 B ng 3.4 Giá tr log (N/ mL) c a ngu nănit ăkh o sát 40 B ng 3.5 Giá tr log (N/ mL) c a ngu n cacbon kh o sát 41 B ng 3.6 Giá tr log (N/ mL) c a ngu n mu i khoáng kh o sát 43 B ng 3.7 M c nhăh ng c a t ng y u t 44 B ng 3.8: K t qu thí nghi m Plackett- Burman 45 B ng 3.10 B ngătínhătốnăb c chuy năđ ng c a y u t nhăh ng 50 B ng 3.11 K t qu thí nghi m leo d c 51 B ng 3.12 B ng giá tr bi n s thí nghi m Box-Behnken 53 B ng 3.13 B ng bi n s giá tr thí nghi m Box-Behnken 53 B ng 3.14 K t qu giá tr t iă uăc a y u t 56 B ng 3.15 Giá tr OD theo th i gian 57 SVTH: TR N TH KI U i T NG QUAN TÀI LI U DANH M Că TH th 3.4 K t qu kh o sát ngu nănit 40 th 3.5 K t qu kh o sát ngu n Cacbon 42 th 3.6 K t qu kh o sát ngu n mu i khoáng 43 th 3.7.ă th nhăh th 3.1ă th đ ng (Main Effects Plot) 47 ng m c bi u di n m i quan h gi a m tăđ t bào v i c p bi n khác 55 th 3.2ă th b m t bi u di n m i quan h gi a m tăđ t bào v i c p bi n khác 56 th 3.9ă trênămôiătr ngăcongăt ngătr ng c a L plantarum NT 1.5 theo th i gian ng t iă u 58 SVTH: TR N TH KI U ii T NG QUAN TÀI LI U T V Nă SVTH: TR N TH KI U TÀI LI U THAM KH O TÀI LI U THAM KH O Ti ng Vi t [1] Nguy n Tú Anh, Lê Th M Linh, Nguy n V n Thanh (2003), “Kh o sát u ki n ni c y thích h p cho vi khu n Lactobacillus casei”, T p chí Y h c TP HCM, Chuyên đ D [2] Nguy n c, 7(4), Tr 195-197 ng Di p, Bùi Hà Thanh, (1994-1996), "Nghiên c u thơng s thích h p qui trình cơng ngh lên men s n xu t ch ph m vi khu n lactic", Tuy n t p công tác nghiên c u Vi n Sinh H c Nhi t i, NXB Nông Nghi p [3] Nguy n Lân D ng (1983), Th c t p Vi sinh v t h c, NXB i h c & Trung h c chuyên nghi p, Hà N i [4] Nguy n V n D , Nguy n ng Bình (2011), ” Quy ho ch th c nghi m k thu t”, NhƠ xu t b n Khoa h c k thu t Hà N i, Tr.9-26, 138-216 [5] Nguy n ThƠnh t (2011), C s sinh h c vi sinh v t t p 1, NXB ih c S Ph m [6] Nguy n Th H ng Hà, Lê Thiên Minh, Nguy n Thùy Chơu (2003), “Nghiên c u công ngh s n xu t ch ph m vi khu n lactic probiotic”, Tuy n t p báo cáo t i H i ngh Công ngh Sinh h c toàn qu c n m 2003, Tr 251-255 [7] Giang Th Kim Liên (2009), Bài gi ng Qui ho ch th c nghi m (các ph pháp th ng kê x lý s li u th c nghi m), Tr [8] Mai Ơm Linh, Giang (2008), “ Minh Ph ng ng i H c Ơ N ng ng, Ph m Th Tuy t, Ki u H u nh, Nguy n Th c m sinh h c c a ch ng vi khu n lactic phân l p đ a bàn thành ph Hà N i”, T p chí Khoa h c HQGHN, Khoa h c T nhiên Công ngh , 24, Tr.221-226 [9] D ng Nh t Linh, Nguy n V n Minh, Lê Th Anh Thi n, Ph m Tr n Ph Dung, Ph m Th Minh Trang, Tr n Cát ng ông (2013), “Sàng l c vi khu n lactic có ho t tính gi m cholesterol”, H i ngh Cơng ngh sinh h c tồn qu c khu v c phía Nam l n III “Cơng ngh sinh h c cu c s ng”, Tr 151 SVTH: TR N TH KI U 63 TÀI LI U THAM KH O [10] Nguy n cL ng Cao C ng (2003), Thí nghi m cơng ngh sinh h c t p 1- thí nghi m hóa sinh h c, Nhà xu t b n i h c qu c gia TP H Chí Minh [11] Nguy n V n ThƠnh vƠ Nguy n Ng c Trai (2012), phân l p n ch n vi khu n Lactobacillus sp có kh n ng c ch vi khu n gây b nh gan th n m đ m đ cá tra”, T p chí Khoa h c, Pp 224-234 [12] Tr n Linh Th H ng T c, Nguy n c Hoàng, Phan Th Ph ng Trang, Ph m Th i (2001), Th c t p vi sinh v t, Nhà xu t b n i h c Qu c gia TP.HCM, Tr.15, 37, 39, 43 [13] Tr n Linh Th c, ng Th Ph ng Th o, Anh Tu n, Cao Th Ng c Ph Võ C m Quy (2011), Th c t p vi sinh v t, Nhà xu t b n ng, i h c Qu c gia H Chí Minh Ti ng Anh [14] Barthelmebs L., Divies C., and Cavin J F (2000), “Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from Lactobacillus plantarum reveals the existence of two othe inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism”, Appl Environ Microbiol, 66: Pp 3368-3375 [15] Barthelmebs, L., Divies, C and Cavin, J-F (2001), “Molecular characterization of the phenolic acid metabolism in the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum”, Lait, 81:Pp 161-171 [16] Bevilacqua A., Corbo M R., Mastromatteo M and Sinigaglia M (2008), “Combined effects of pH, yeast extract, carbohydrates and di-ammonium hydrogen citrate on the biomass production and acidifying ability of a probiotic Lactobacillus plantarum strain, isolated from table olives, in a batch system”, World J Microbiol Biotechnol, 24:Pp 1721ậ1729 [17] Daeschel M A and Nes I F (1995), Lactobacillus plantarum: physiology, genetics and applications in foods, in Food Biotechnology Microorganisms, New York, chap 21, Pp 721-743 SVTH: TR N TH KI U 64 TÀI LI U THAM KH O [18] David M I., Weinert E., Kim C.S., Joseph M M and Sherri A M (2013), “Natural Farming: Lactic Acid Bacteria”, College of Tropical Agriculture and Human Resources”, [19] David D., Tryon V V and Dennis J P (1989), “Metabolism of Mollicutes: the Embden-Meyerhof-Parnas Pathway and the Hexose Monophosphate Shunt”, Journal of General Microbiology, Vol 135, Pp.683-691 [20] FAO/WHO(2001), “Report of a joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria”, Co´rdoba, Argentina [21] Farooq U., Anjum F M., Zahoor T., Rahman S U., Randhawa A., Ahmed A and Akram K (2012), “Optimization of lactic acid production from cheap raw material: sugarcane molasses”, Pak J Bot., 44(1):Pp.333-338 [22] Han B., Yu Z., Liu B., Ma Q and Zhang R (2011), “Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus plantarum YJG, isolated from the mucosa of the gut of healthy chickens”, African Journal of Microbiology Research, Pp 1147-1155 [23] Karlsson C., Ahrne S and Molin G ( 2009), “Probiotic therapy to men with incipient arteriosclerosis initiates increased bacterial diversity in colon: a randomized controlled trial”, Atherosclerosis [24] Kleerebezem M., Boekhorst J., Kranenburg R V., Molenaar D., Kuipers O P., Leer R., Tarchini R., Peters S A., Sandbrink H M., Fiers M W E J., Stiekema W., Lankhorst R M K., Bron P A., Hoffer S M., Groot M N N., Kerkhoven R., Vries M., Ursing B., Vos W M and Siezen R J (2003), “Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1”, Proc Natl Acad Sci U.S.A, 100:Pp 1990-1995 [25] Lim H J., Kim S Y and Lee W K (2004), “Isolation of cholesterol-lowering lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use”, Veterinary Science SVTH: TR N TH KI U 65 TÀI LI U THAM KH O [26] Lonnermark E., Friman V and Lappas G (2009), “Intake of Lactobacillus plantarum reduces certain gastrointestinal symptoms during treatment with antibiotics”, J Clin Gastroenterol [27] Marcel D (2005), “Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, Third Edition (Food Science and Technology)”, Library of congress Cataloging-in- publication Data, ISBN 0-203- 02673 X Master e-book ISBN [28] Nagarjun P A., Rao R S., Rajesham S and Rao L V (2005), “Optimization of Lactic Acid Production in SSF by Lactobacillus amylovorus NRRL B-4542 Using Taguchi Methodology”, The Journal of icrobiology, Pp 38-43 [29] Muhamad Nor N., Mohamad R., Ling Foo H and Rahim R A (2010), Improvement of Folate Biosynthesis by Lactic Acid Bacteria Using Response Surface Methodology”, Food Technol Biotechnol, 48(2):Pp 243ậ250 [30] Nissen L., Chingwaru W and Sgorbati B (2009 ), “Gut health promoting activity of new putative probiotic/protective Lactobacillus spp Strains: a functional study in the small intestinal cell model”, Int J Food Microbiol, Pp 288-94 [31] Ooi L G and Liong M T (2010), “Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings”, International Journal of Molecular Sciences [32] Plackett R L and Burman J P (1946), “The Design of Optimum Multifactorial Experiments”, Biometrika, Pp 305-325 [33] Qin H., Zhang Z and Hang X (2009), “L.plantarum prevents enteroinvasive Escherichia coli-induced tight junction protein changes in intestinal epithelial cells”, BMC MicrobioJ, Pp 31;9;63 [34] Reichelt J L (2013), “The impact of Technical Exellence in Microbiology on the results obtained with Silage Inoculants and Bacterial Biopesticcides”, Bacterial Fermentation Pty Ltd [35] Shahravy A., Tababdeh F., Bambai B., Zamanizadeh H R and Mizani M (2012), “Optimization of probiotiic Lactobicillus casei ATCC 334 production using date SVTH: TR N TH KI U 66 TÀI LI U THAM KH O powder as cacbon source”, Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterl, Pp 273−282 [36] Tanaka H., Doesburg K., Iwasaki T and Mierau I (2006), “Bile salt hydrolase and cholesterol removal effect by Bifidobacterium bifidum NRRL 1976”, World Journal of Microbiology & Biotechnology [37] Vamanu E vƠ cs (2009), “Studies regarding the production of probiotic biomass from Lactobacillus plantarum strains”, Archiva Zootechnica, Pp 92-101 [38] Vaquero, I., Marcobal, A and Muñoz, R (2004), “Tannase activity by lactic acid bacteria isolated from grape must and wine”, International Journal of Food Microbiology , 96: Pp 199-204 [39] Waugh A W G., Foshaug R., Macfarlane S., Doyle J., Churchili T A., Sydora B C and Fedorakr R N (2009), “Effect of Lactobacillus plantarum 299v treatment in an animal model of irritable bowel syndrome”, Microbial Ecology in Health and Disease, Pp 33-37 [40] Ziarno M., Sekul E and Lafraya A A (2007), “Cholesterol assimilation by commercial yoghurt starter cultures”, Acta Sci Pol., Technol Aliment, Pp 83-94 Tài li u web [41] Learn about the Importance of Good Bacteria, Part II: Lactobacillus Plantarum (2010) http://www.naturalnews.com/027845_probiotics_health.html##ixzz32e0f5rNg [42].WHO(2013), http://www.who.int/gho/ncd/risk_factors/cholesterol_text/en/index.html SVTH: TR N TH KI U 67 PH L C PH L C PH L C 1: MỌIăTR  NG Thành ph n môi tr ng MRS: − Peptone 10 g − Cao th t 10 g − Cao n m men g − Glucose 20 g − K2HPO4 g − Natri acetate g − MgSO4.7H2O 0,2 g − MnSO4.4H2O 0,2 g − Tween 80 mL − (NH4)citrate g −N  c 1000 mL Thành ph n môi tr ng MRSA: gi ng thành ph n môi tr ng MRS nh ng b sung thêm 20g agar SVTH: TR N TH KI U 68 PH L C PH L C 2: B NG K T QU B ng 2.1 K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t kh o sát nhăh pH, nhi tăđ đ n kh n ngăt ngătr SVTH: TR N TH KI U ng c a ng c a L plantarum NT1.5 69 PH L C B ng 2.1 K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t c a ngu n Nit ă kh o sát SVTH: TR N TH KI U 70 PH L C B ng 2.2.Kk t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t c a ngu n Cacbon kh o sát SVTH: TR N TH KI U 71 PH L C B ng 2.3 K t qu x lí th ng kê ANOVA m t y u t c a ngu n mu i khoáng kh o sát SVTH: TR N TH KI U 72 PH L C th 2.1: SVTH: TR N TH KI U th nhăh ng chu n hóa 73 PH L C th 2.2 Pareto c a y u t SVTH: TR N TH KI U nhăh ng 74 PH L C B ng 2.4 K t qu phân tích h iăquyăph SVTH: TR N TH KI U ngăsai cho thí nghi m P-B 75 PH L C B ng 2.5 K t qu phân tích h i quyăph SVTH: TR N TH KI U ngăsaiăc a thí nghi m kh iăđ u 76 PH L C B ng 2.6 K t qu phân tích h iăquyăph SVTH: TR N TH KI U ngăsaiăc a thí nghi m Box-Behnken 77 ... so v i y u t chính, thi t k Plackett ậ Burman d a ma tr n hai c p cho m i y u t s a đ i đ gi m th t b i (Plackett Burman, 1946) Y u t tác đ ng thi t k Plackett - Burman thay th t t c t ng tác... ngh a lƠ thông tin v s t ng tác không th đ c xác đ nh t thi t k Plackett-Burman (Plackett Burman, 1946) V i m t thi t k Plackett - Burman g m n thí nghi m (v i n b i s c a 4, n ≤ 100, ngo i tr n... ậ gi ng viên khoa Công ngh ng i H c M Tp H chí Minh, th y lƠ ng i đư t n tình h ng d n, t o u ki n, truy n đ t ki n th c đ em có th hoàn thành t t đ tài Chân thành c m n th y, cô khoa Công ngh