Khóa luận tốt nghiệp: Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: TỐI ƯU HỐ MƠI TRƯỜNG NI CẤY CHỦNG Lactobacillus plantarum NT1.5 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: ThS DƯƠNG NHẬT LINH SVTH : TRẦN THỊ KIỀU MSSV : 1053012348 KHOÁ: 2010 – 2014 Tp.Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Cô Dương Nhật Linh thầy Nguyễn Văn Minh – giảng viên khoa Công nghệ Sinh học Trường Đại Học Mở Tp Hồ chí Minh, thầy người tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện, truyền đạt kiến thức để em hồn thành tốt đề tài Chân thành cảm ơn thầy, cô khoa Công nghệ Sinh học trường Đại Học Mở Tp Hồ Chí Minh tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em kiến thức làm tảng để em hoàn thành đề tài Thầy Đan Duy Pháp, chị Võ Ngọc Yến Nhi, chị Phạm Thị Minh Trang, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh Nguyễn Đạt Phi người truyền đạt kinh nghiệm, động viên giúp đỡ em vượt qua khó khăn thời gian thực đề tài Xin cảm ơn đến anh/ chị, bạn em Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Vi sinh giúp đỡ, động viên em thời gian qua Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến Ba, Mẹ, gia đình ln bên cạnh ủng hộ tạo điều kiện tốt cho hoàn thành tốt việc học tập Chân thành cảm ơn! Bình Dương, ngày tháng năm 2014 TRẦN THỊ KIỀU SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN LACTIC 1.1.1 Giới thiệu 1.1.2 Con đường biến dưỡng vi khuẩn lactic 1.1.3 Tổng quan Lactobacillus plantarum 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ LACTOBACILLUS 10 1.2.1 Các nghiên cứu giới 10 1.2.2 Các nghiên cứu nước 11 1.3 QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 12 1.3.1 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 12 1.3.2 Thí nghiệm sàng lọc 14 1.3.3 Thí nghiệm tối ưu hóa 16 1.4 PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM MINITAB 16.2.0 20 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGIÊN CỨU 24 2.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 24 2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 24 2.2.2 Mơi trường – hóa chất 24 2.2.3 Dụng cụ 24 2.2.4 Trang thiết bị 24 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Hoạt hóa chủng 25 2.3.3 Xây dựng đường cong tăng trưởng L plantarum NT 1.5 26 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3.4 Khảo sát nhiệt độ, pH thích hợp cho tăng trưởng L plantarum NT1.5 27 2.3.5 Sàng lọc yếu tố dinh dưỡng 28 2.3.6 Thiết kế thí nghiệm tìm yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men tăng sinh khối theo thiết kế Plackett- Burman 30 2.3.7 Thí nghiệm khởi đầu 32 2.3.8 Tìm khoảng tối ưu yếu tố ảnh hưởng phương pháp leo dốc 32 Thí nghiệm bề mặt tiêu xác định giá trị tối ưu yếu tố ảnh 2.3.9 hưởng 33 2.3.10 Xác định thời gian tăng trưởng chủng L plantarum NT1.5 môi trường tối ưu 33 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG TƯƠNG QUAN GIỮA MẬT ĐỘ TẾ BÀO VI KHUẨN VÀ GIÁ TRỊ OD610 35 3.2 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT 1.5 36 3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ, pH THÍCH HỢP CHO SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT1.5 38 3.4 KẾT QUẢ SÀNG LỌC YẾU TỐ DINH DƯỠNG 39 3.4.1 Nguồn nitơ 39 3.4.2 Nguồn cacbon 41 3.4.3 Nguồn khoáng 42 3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG CHÍNH THEO THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM PLACKETT- BURMAN 44 3.6 KẾT QUẢ THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM KHỞI ĐẦU 48 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU ii TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3.7 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM LEO DỐC 50 3.8 KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM BOX-BEHNKEN 52 3.9 KẾT QUẢ KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA L PLANTARUM NT1.5 TRÊN MÔI TRƯỜNG TỐI ƯU 57 4.1 KẾT LUẬN 61 4.2 KIẾN NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 68 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU iii TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA One-way analysis of variance CFU Colony forming unit Cs Cộng L plantarum Lactobacillus plantarum MRS Deman, Rogosa and Sharpe Nm nanomet OD Optical Density P-B Plackett-Burman WHO World Health Organization BSH Bile salt hydrolase SVTH: TRẦN THỊ KIỀU iv TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Streptococcus Hình 1.2 Lactobacillus Hình 1.3 Lactobacillus plantarum kính hiển vi điện tử (Reichelt J., 2013) Hình 1.6 Hộp đen hệ thống điều khiển trình 13 Hình 1.8 Ma trận bố trí thí nghiệm theo thiết kế Box – Behnken (Box Behnken, 1960) 20 Hình 1.9 Giao diện phần mềm Minitab 16.2.0 22 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU v TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các nguồn nitơ khảo sát 28 Bảng 2.2 Các nguồn cacbon khảo sát 29 Bảng 2.3 Các nguồn khoáng khảo sát 30 Bảng 3.1: Giá trị đo OD610 mật độ tế bào (Log(N/mL) 35 Bảng 3.2 Giá trị OD610 theo thời gian 36 Bảng 3.3 Mật độ tế bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) giá trị nhiệt độ độ pH khảo sát 38 Bảng 3.4 Giá trị log (N/ mL) nguồn nitơ khảo sát 40 Bảng 3.5 Giá trị log (N/ mL) nguồn cacbon khảo sát 41 Bảng 3.6 Giá trị log (N/ mL) nguồn muối khoáng khảo sát 43 Bảng 3.7 Mức ảnh hưởng yếu tố 44 Bảng 3.8: Kết thí nghiệm Plackett- Burman 45 Bảng 3.10 Bảng tính toán bước chuyển động yếu tố ảnh hưởng 50 Bảng 3.11 Kết thí nghiệm leo dốc 51 Bảng 3.12 Bảng giá trị biến số thí nghiệm Box-Behnken 53 Bảng 3.13 Bảng biến số giá trị thí nghiệm Box-Behnken 53 Bảng 3.14 Kết giá trị tối ưu yếu tố 56 Bảng 3.15 Giá trị OD theo thời gian 57 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU i TỔNG QUAN TÀI LIỆU DANH MỤC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.4 Kết khảo sát nguồn nitơ 40 Đồ thị 3.5 Kết khảo sát nguồn Cacbon 42 Đồ thị 3.6 Kết khảo sát nguồn muối khoáng 43 Đồ thị 3.7 Đồ thị ảnh hưởng (Main Effects Plot) 47 Đồ thị 3.1 Đồ thị đường mức biểu diễn mối quan hệ mật độ tế bào với cặp biến khác 55 Đồ thị 3.2 Đồ thị bề mặt biểu diễn mối quan hệ mật độ tế bào với cặp biến khác 56 Đồ thị 3.9 Đường cong tăng trưởng L plantarum NT 1.5 theo thời gian môi trường tối ưu 58 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU ii TỔNG QUAN TÀI LIỆU ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: TRẦN THỊ KIỀU TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Nguyễn Tú Anh, Lê Thị Mỹ Linh, Nguyễn Văn Thanh (2003), “Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho vi khuẩn Lactobacillus casei”, Tạp chí Y học TP HCM, Chuyên đề Dược, 7(4), Tr 195-197 [2] Nguyễn Đăng Diệp, Bùi Hà Thanh, (1994-1996), "Nghiên cứu thông số thích hợp qui trình cơng nghệ lên men sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic", Tuyển tập công tác nghiên cứu Viện Sinh Học Nhiệt Đới, NXB Nông Nghiệp [3] Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập Vi sinh vật học, NXB Đại học & Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội [4] Nguyễn Văn Dự, Nguyễn Đăng Bình (2011), ” Quy hoạch thực nghiệm kỹ thuật”, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật Hà Nội, Tr.9-26, 138-216 [5] Nguyễn Thành Đạt (2011), Cơ sở sinh học vi sinh vật tập 1, NXB Đại học Sư Phạm [6] Nguyễn Thị Hồng Hà, Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu (2003), “Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic probiotic”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc năm 2003, Tr 251-255 [7] Giang Thị Kim Liên (2009), Bài giảng Qui hoạch thực nghiệm (các phương pháp thống kê xử lý số liệu thực nghiệm), Trường Đại Học Đà Nẵng [8] Mai Đàm Linh, Đỗ Minh Phương, Phạm Thị Tuyết, Kiều Hữu Ảnh, Nguyễn Thị Giang (2008), “Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn lactic phân lập địa bàn thành phố Hà Nội”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 24, Tr.221-226 [9] Dương Nhật Linh, Nguyễn Văn Minh, Lê Thị Anh Thiện, Phạm Trần Phương Dung, Phạm Thị Minh Trang, Trần Cát Đơng (2013), “Sàng lọc vi khuẩn lactic có hoạt tính giảm cholesterol”, Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc khu vực phía Nam lần III “Cơng nghệ sinh học sống”, Tr 151 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO [10] Nguyễn Đức Lượng Cao Cường (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 1- thí nghiệm hóa sinh học, Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh [11] Nguyễn Văn Thành Nguyễn Ngọc Trai (2012), phân lập tuyển chọn vi khuẩn Lactobacillus sp có khả ức chế vi khuẩn gây bệnh gan thận mủ đốm đỏ cá tra”, Tạp chí Khoa học, Pp 224-234 [12] Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phan Thị Phương Trang, Phạm Thị Hồng Tươi (2001), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất Đại học Quốc gia TP.HCM, Tr.15, 37, 39, 43 [13] Trần Linh Thước, Đặng Thị Phương Thảo, Đỗ Anh Tuấn, Cao Thị Ngọc Phượng, Võ Cẩm Quy (2011), Thực tập vi sinh vật, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh Tiếng Anh [14] Barthelmebs L., Divies C., and Cavin J F (2000), “Knockout of the p-coumarate decarboxylase gene from Lactobacillus plantarum reveals the existence of two othe inducible enzymatic activities involved in phenolic acid metabolism”, Appl Environ Microbiol, 66: Pp 3368-3375 [15] Barthelmebs, L., Divies, C and Cavin, J-F (2001), “Molecular characterization of the phenolic acid metabolism in the lactic acid bacteria Lactobacillus plantarum”, Lait, 81:Pp 161-171 [16] Bevilacqua A., Corbo M R., Mastromatteo M and Sinigaglia M (2008), “Combined effects of pH, yeast extract, carbohydrates and di-ammonium hydrogen citrate on the biomass production and acidifying ability of a probiotic Lactobacillus plantarum strain, isolated from table olives, in a batch system”, World J Microbiol Biotechnol, 24:Pp 1721–1729 [17] Daeschel M A and Nes I F (1995), Lactobacillus plantarum: physiology, genetics and applications in foods, in Food Biotechnology Microorganisms, New York, chap 21, Pp 721-743 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO [18] David M I., Weinert E., Kim C.S., Joseph M M and Sherri A M (2013), “Natural Farming: Lactic Acid Bacteria”, College of Tropical Agriculture and Human Resources”, [19] David D., Tryon V V and Dennis J P (1989), “Metabolism of Mollicutes: the Embden-Meyerhof-Parnas Pathway and the Hexose Monophosphate Shunt”, Journal of General Microbiology, Vol 135, Pp.683-691 [20] FAO/WHO(2001), “Report of a joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probiotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria”, Co´rdoba, Argentina [21] Farooq U., Anjum F M., Zahoor T., Rahman S U., Randhawa A., Ahmed A and Akram K (2012), “Optimization of lactic acid production from cheap raw material: sugarcane molasses”, Pak J Bot., 44(1):Pp.333-338 [22] Han B., Yu Z., Liu B., Ma Q and Zhang R (2011), “Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus plantarum YJG, isolated from the mucosa of the gut of healthy chickens”, African Journal of Microbiology Research, Pp 1147-1155 [23] Karlsson C., Ahrne S and Molin G ( 2009), “Probiotic therapy to men with incipient arteriosclerosis initiates increased bacterial diversity in colon: a randomized controlled trial”, Atherosclerosis [24] Kleerebezem M., Boekhorst J., Kranenburg R V., Molenaar D., Kuipers O P., Leer R., Tarchini R., Peters S A., Sandbrink H M., Fiers M W E J., Stiekema W., Lankhorst R M K., Bron P A., Hoffer S M., Groot M N N., Kerkhoven R., Vries M., Ursing B., Vos W M and Siezen R J (2003), “Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1”, Proc Natl Acad Sci U.S.A, 100:Pp 1990-1995 [25] Lim H J., Kim S Y and Lee W K (2004), “Isolation of cholesterol-lowering lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use”, Veterinary Science SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO [26] Lonnermark E., Friman V and Lappas G (2009), “Intake of Lactobacillus plantarum reduces certain gastrointestinal symptoms during treatment with antibiotics”, J Clin Gastroenterol [27] Marcel D (2005), “Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, Third Edition (Food Science and Technology)”, Library of congress Cataloging-in- publication Data, ISBN 0-203- 02673 X Master e-book ISBN [28] Nagarjun P A., Rao R S., Rajesham S and Rao L V (2005), “Optimization of Lactic Acid Production in SSF by Lactobacillus amylovorus NRRL B-4542 Using Taguchi Methodology”, The Journal of icrobiology, Pp 38-43 [29] Muhamad Nor N., Mohamad R., Ling Foo H and Rahim R A (2010), Improvement of Folate Biosynthesis by Lactic Acid Bacteria Using Response Surface Methodology”, Food Technol Biotechnol, 48(2):Pp 243–250 [30] Nissen L., Chingwaru W and Sgorbati B (2009 ), “Gut health promoting activity of new putative probiotic/protective Lactobacillus spp Strains: a functional study in the small intestinal cell model”, Int J Food Microbiol, Pp 288-94 [31] Ooi L G and Liong M T (2010), “Cholesterol-Lowering Effects of Probiotics and Prebiotics: A Review of in Vivo and in Vitro Findings”, International Journal of Molecular Sciences [32] Plackett R L and Burman J P (1946), “The Design of Optimum Multifactorial Experiments”, Biometrika, Pp 305-325 [33] Qin H., Zhang Z and Hang X (2009), “L.plantarum prevents enteroinvasive Escherichia coli-induced tight junction protein changes in intestinal epithelial cells”, BMC MicrobioJ, Pp 31;9;63 [34] Reichelt J L (2013), “The impact of Technical Exellence in Microbiology on the results obtained with Silage Inoculants and Bacterial Biopesticcides”, Bacterial Fermentation Pty Ltd [35] Shahravy A., Tababdeh F., Bambai B., Zamanizadeh H R and Mizani M (2012), “Optimization of probiotiic Lactobicillus casei ATCC 334 production using date SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO powder as cacbon source”, Chemical Industry & Chemical Engineering Quarterl, Pp 273−282 [36] Tanaka H., Doesburg K., Iwasaki T and Mierau I (2006), “Bile salt hydrolase and cholesterol removal effect by Bifidobacterium bifidum NRRL 1976”, World Journal of Microbiology & Biotechnology [37] Vamanu E cs (2009), “Studies regarding the production of probiotic biomass from Lactobacillus plantarum strains”, Archiva Zootechnica, Pp 92-101 [38] Vaquero, I., Marcobal, A and Muñoz, R (2004), “Tannase activity by lactic acid bacteria isolated from grape must and wine”, International Journal of Food Microbiology , 96: Pp 199-204 [39] Waugh A W G., Foshaug R., Macfarlane S., Doyle J., Churchili T A., Sydora B C and Fedorakr R N (2009), “Effect of Lactobacillus plantarum 299v treatment in an animal model of irritable bowel syndrome”, Microbial Ecology in Health and Disease, Pp 33-37 [40] Ziarno M., Sekul E and Lafraya A A (2007), “Cholesterol assimilation by commercial yoghurt starter cultures”, Acta Sci Pol., Technol Aliment, Pp 83-94 Tài liệu web [41] Learn about the Importance of Good Bacteria, Part II: Lactobacillus Plantarum (2010) http://www.naturalnews.com/027845_probiotics_health.html##ixzz32e0f5rNg [42].WHO(2013), http://www.who.int/gho/ncd/risk_factors/cholesterol_text/en/index.html SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 67 PHỤ LỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: MƠI TRƯỜNG  Thành phần mơi trường MRS: − Peptone 10 g − Cao thịt 10 g − Cao nấm men g − Glucose 20 g − K2HPO4 g − Natri acetate g − MgSO4.7H2O 0,2 g − MnSO4.4H2O 0,2 g − Tween 80 mL − (NH4)citrate g − Nước 1000 mL  Thành phần môi trường MRSA: giống thành phần môi trường MRS bổ sung thêm 20g agar SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 68 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 2: BẢNG KẾT QUẢ Bảng 2.1 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ đến khả tăng trưởng L plantarum NT1.5 SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 69 PHỤ LỤC Bảng 2.1 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố nguồn Nitơ khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 70 PHỤ LỤC Bảng 2.2.Kkết xử lí thống kê ANOVA yếu tố nguồn Cacbon khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 71 PHỤ LỤC Bảng 2.3 Kết xử lí thống kê ANOVA yếu tố nguồn muối khoáng khảo sát SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 72 PHỤ LỤC Đồ thị 2.1: Đồ thị ảnh hưởng chuẩn hóa SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 73 PHỤ LỤC Đồ thị 2.2 Pareto yếu tố ảnh hưởng SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 74 PHỤ LỤC Bảng 2.4 Kết phân tích hồi quy phương sai cho thí nghiệm P-B SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 75 PHỤ LỤC Bảng 2.5 Kết phân tích hồi quy phương sai thí nghiệm khởi đầu SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 76 PHỤ LỤC Bảng 2.6 Kết phân tích hồi quy phương sai thí nghiệm Box-Behnken SVTH: TRẦN THỊ KIỀU 77 ... QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM 12 1.3.1 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm 12 1.3.2 Thí nghiệm sàng lọc 14 1.3.3 Thí nghiệm tối ưu hóa 16 1.4 PHẦN MỀM QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM... đối tượng (Nguyễn Văn Dự cs., 2011) 1.3.1 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm Quy hoạch thực nghiệm sở phương pháp luận nghiên cứu thực nghiệm đại Đó phương pháp nghiên cứu mới, cơng cụ tốn học giữ... (Shahravy, 2012) Vì chúng tơi thực đề tài ? ?Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum NT1.5 phương pháp quy hoạch thực nghiệm? ?? Nội dung thực hiện:  Xây dựng biểu đồ thể mối tương quan