Tối Ưu Hóa Môi Trường Nuôi Cấy Trichoderma Hazianum Và Ứng Dụng Chế Phẩm Trong Nông Nghiệp

Ứng dụng của chế phẩm sinh học Trichoderma 2.2.1.Ứng dụng chế phẩm sinh học phục vụ cây trồng: [6] Phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh được sự trợ giúp của vi sinh vật chuyên

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

TÓM TẮT

Ngày nay, việc sử dụng phân bón vi sinh trong nông nghiệp đang được ứng dụng rộng rãi do những vấn đề nguy hại từ phân hóa học gây nên Vì thế, các nghiên cứu tạo

ra các chế phẩm sinh học phục vụ cho nông nghiệp cũng đang được tiến hành ngày

càng nhiều Và nói đến việc phòng trừ sâu bệnh hại trên cây trồng thì Trichoderma là loài nấm đang được quan tâm nhiều hiện nay do Trichoderma là một loài nấm đối

kháng, nó có khả năng đối kháng mạnh với nhiều loài vi nấm gây hại trên cây trồng Không chỉ vậy loài nấm này còn có khả năng hỗ trợ, cải thiện sự sinh trưởng của cây

Hai phương pháp chính để thực hiện đề tài là:

- Tối ưu hóa môi trường bán rắn nuôi cấy Trichoderma Hazianum

- Khảo sát tác dụng phòng bệnh trên rau cải bẹ xanh của Trichderma Hazianum

Trước thực trạng trên, dưới sự hướng dẫn của Ths Ngô Minh Nhã, sinh viên

Phạm Như Ngọc đã thực hiện đề tài “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Trichoderma Hazianum và ứng dụng chế phẩm trong nông nghiệp” Đề tài được thực hiện tại Phòng

Thí Nghiệm Vi Sinh, Trường CĐ Kinh tế - Công nghệ TP HCM từ ngày 4/10/2009 đến ngày 4/01/2010 Mục tiêu của đề tài là tạo môi trường tối ưu nuôi cấy

Trichoderma Hazianum và làm rõ khả năng phòng nấm bệnh trên rau của Trichoderma Hazianum

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC SƠ ĐỒ ix

DANH MỤC BIỂU ĐỒ ix

Chương 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và mục tiêu của đề tài: 2

1.3 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: 2

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma 3

2.1.1 Vị trí phân loại: 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái 3

2.1.3 Cấu tạo tế bào, sự sinh trưởng và hình thành bào tử của Trichoderma: 5

2.1.4 Đặc điểm sinh thái, sinh hóa 7

2.2 Ứng dụng của chế phẩm sinh học Trichoderma 8

2.2.1.Ứng dụng chế phẩm sinh học phục vụ cây trồng 8

2.2.2 Ứng dụng chế phẩm sinh học trong cải tạo đất và xử lý phế thải 9

2.2.3 Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen 10

2.2.4 Ứng dụng làm chất kiểm soát sinh học 10

2.2.5 Ứng dụng trong lương thực và ngành dệt 11

2.3 Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma 11

2.3.1 Tương tác với nấm bệnh 11

2.3.2 Tương tác với cây trồng 15

2.4 Trichoderma Harzianum 20

2.4.1 Phân loại 20

2.4.2 Đặc điểm 20

2.4.3 Các ứng dụng 21

2.5 Nấm Fusarium: 22

2.5.1 Phân loại 22

2.5.2 Đặc điểm 22

2.6 Nấm Sclerotium Rolfsii 24

2.6.1 Phân loại 24

2.6.2 Đặc điểm: 25

2.7 Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về ứng dụng vi nấm Trichoderma 27

2.7.1 Các nghiên cứu trong nước: 27

2.7.2 Các nghiên cứu ngoài nước: 27

Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện: 29

3.2 Vật liệu thí nghiệm: 29

3.2.1 Hóa chất và thiết bị sử dụng: 29

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu: 29

3.3 Bố trí thí nghiệm: 30

3.4 Phương pháp nghiên cứu: 30

3.4.1 Phương pháp nuôi cấy chủng Trichoderma Harzianum: 30

3.4.2 Quan sát đại thể nấm Trichoderma Harzianum 33

3.4.3 Quan sát vi thể Trichoderma Harzianum 34

3.4.4 Thử nghiệm khả năng đối kháng của Trichoderma Hazianum với nấm bệnh 34

3.4.5 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Trichoderma hazianum 35

3.4.6 Phương pháp xác định số tế bào vi sinh vật: 38

3.4.7 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm: 41

3.4.8 Khảo sát khả năng phòng bệnh trên cây trồng bởi chế phẩm Trichoderma Harzianum 41

3.5 Xử lý số liệu kết quả: 43

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

4.1 Quan sát đại thể Trichoderma Hazianum : 44

4.2 Quan sát vi thể T Hazianum: 46

4.3 Thử tính đối kháng của T.Hazianum với nấm bệnh: 48

4.4 Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy nấm Trichoderma Hazianum: 49

4.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chitin đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma Harzianum trong môi trường nuôi cấy bán rắn 50

4.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng trấu đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma

Harzianum trong môi trường nuôi cấy bán rắn 50

4.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng cám đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma Harzianum trong môi trường nuôi cấy bán rắn 51

4.4.4 Khảo sát môi trường tối ưu của T Hazianum bằng thực nghiệm 52

4.5 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm 55

4.6 Khảo sát khả năng chống bệnh trên cải bẹ xanh gây ra bởi 2 loài nấm bệnh S Rolfsii và Fusarium 55

4.6.1 Cải trồng chuẩn bị thí nghiệm: 55

4.6.2 Đánh giá hiệu lực phòng bệnh của T Hazianum: 57

4.7 Tính giá thành sản phẩm: 64

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65

5.1 Kết luận: 65

5.2 Đề nghị: 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

T Longibrachiatum: Trichoderma Longibrachiatum

T Polysporum: Trichoderma Polysporum

T Pseudokoningii: Trichoderma Pseudokoningi

T Citrinoviride: Trichoderma Citrinoviride

F Chlamydosporum: Fusarium Chlamydosporum

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Tác dụng và hiệu quả đề kháng cho cây trồng do loài Trichoderma mang lại 18

Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo 32

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng trấu đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma Hazianum 36

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng chitin đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma Hazianum 37

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng cám đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma Hazianum 38

Bảng 4.1 Mức biến thiên hàm lượng của các thành phần môi trường 53

Bảng 4.2 Kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm 53

Bảng 4.3 Chi phí trong 1 lít môi trường nhấn giống Trichoderma Hazianum 64

Bảng 4.4 Chi phí trong 1 kg môi trường lên men bán rắn 64

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma 4

Hình 2.2 Trichoderma Hazianum T-22 phát triển trên môi trường PDA (vùng màu xanh chứa bào tử) 4

Hình 2.3 Môi trường nuôi cấy Trichoderma hóa vàng 5

Hình 2.4 Trichoderma ký sinh trên Pythium gây bệnh trên rễ cây họ đậu (Trichoderma nhuộm màu vàng, Pythium nhuộm màu lục) 12

Hình 2.5 Hệ sợi nấm Trichoderma ký sinh trên khuẩn ty nấm bệnh 13

Hình 2.6 Sự gia tăng phát triển hệ rễ với thể cạnh tranh T-22 ở vùng rễ 16

Hình 2.7 Sự gia tăng sản lượng trên cây ớt với hạt giống được xử lí với T-22 17

Hình 2.8 Khuẩn ty Trichoderma Hazianum 20

Hình 2.9 A Khuẩn lạc Fusarium; B Sợi nấm Fusarium dưới kính hiển vi; C Hiện tượng thối rễ do Fusarium gây ra 24

Hình 2.10 S rolfsii phát triển trên môi trường thạch đĩa (A); Triệu chứng mục rửa thân do nấm kí sinh (B); Nấm gây bệnh trên cây thuốc lá (C); trên Thơm (D) 26

Hình 3.1 Phương pháp pha loãng mẫu theo dãy thập phân 39

Hình 3.2: Buồng đếm hồng cầu 39

Hình 4.1 Khuẩn lạc T Hazianum sau 1 ngày nuôi cấy 44

Hình 4.2 Khuẩn lạc T Hazianum sau 2 ngày nuôi cấy 45

Hình 4.3 Khuẩn lạc T Hazianum sau 3 ngày nuôi cấy 45

Hình 4.4 Khuẩn lạc T Hazianum sau 7 ngày nuôi cấy 46

Hình 4.5 Hệ sợi nấm và bào tử của T Hazianum dưới kính hiển vi 47

Hình 4.6 Sợi nấm có vách ngăn 47

Hình 4.7 Thể bình của T Hazianum dưới kính hiển vi 47

Hình 4.8 Mức độ đối kháng của T Hazianum và Fusarium (+++) 48

Hình 4.9 Mức độ đối kháng của T Hazianum và S rolfsii (++++) 49

Hình 4.10 Hình bào tử Trichoderma Hazianum trên ô vuông lớn của buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi 49

Hình 4.11 Cải bẹ xanh sau 15 ngày gieo 56

Hình 4.12 Cải bẹ xanh sau 25 ngày gieo 56

Hình 4.13 Cải bẹ xanh sau 35 ngày gieo 57

Hình 4.14 Triệu chứng bệnh do nấm S Rolfsii gây ra 60

Hình 4 15 Bệnh do Fusarium gây ra trên lá 61

Hình 4.16 So sánh rễ của cây trên nghiệm thức có nấm bệnh S Rolfsii và nghiệm thức có T Hazianum 62

Hình 4.17 So sánh rễ của cây trên nghiệm thức có nấm bệnh Fusarium và nghiệm thức có T Hazianum 62

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 3.1 Khảo sát khả năng phòng bệnh trên cây trồng bởi chế phẩm Trichoderma

Harzianum 42

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 4.1 Ảnh hưởng của hàm lượng chitin đến tốc độ sinh trưởng của T Hazianum 50

Biểu đồ 4.2 Ảnh hưởng của hàm lượng trấu đến tốc độ sinh trưởng của T Hazianum 51

Biểu đồ 4.3 Ảnh hưởng của hàm lượng cám đến tốc độ sinh trưởng của T Hazianum 52

Biểu đồ 4.4 Khảo sát môi trường tối ưu nuôi cấy T Hazianum bằng thực nghiệm 54

Biểu đồ 4.5 Tỷ lệ lá bệnh trên các nghiệm thức sau những thời gian khảo sát 58

Biểu đồ 4.6 Tỷ lệ cây bệnh trên các nghiệm thức sau những thời gian khảo sát 58

Biểu đồ 4.7 Khối lượng rễ cây ở các nghiệm thức 63

Trước hiện trạng này, việc nghiên cứu các chế phẩm sinh học phòng trừ sâu bệnh là điều hết sức cần thiết và cấp bách Ngày nay việc sử dụng phương pháp sinh học trong phòng trừ sâu bệnh và vi nấm đang được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu Các tác nhân đáng chú ý là một số loại nấm kí sinh có khả năng đối kháng với một số vi nấm gây hại cho cây trồng, đối kháng với nấm bệnh nhưng không gây ảnh hưởng tới các cây trồng Phương pháp này vừa giúp tiêu diệt hữu hiệu các vi nấm gây bệnh, vừa hiệu quả trong vấn đề bảo vệ môi trường Một trong số các loài nấm

kháng vi nấm gây bệnh đang được chú ý là Trichoderma Nó có khả năng đối kháng mạnh với các loại nấm bệnh như: Rhizoctonia, Sclerotium, Fusarium gây bệnh trên

cây lúa, bắp, tiêu

Trichoderma là vi nấm hoại sinh có khả năng sản sinh ra các loại enzym ngoại

bào rất hiệu quả Các chế phẩm enzym từ loài nấm này ( enzym chitinase, enzym beta

- glucannase, enzym protease) được sử dụng trực tiếp hoặc phối hợp với các thuốc diệt nấm để bảo vệ trái cây tránh bị thối rửa và cải thiện hiệu quả sử dụng thuốc diệt nấm

Chính vì thế, nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm Trichoderma trong nông nghiệp nên chúng tôi thực hiện đề tài “Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Trichoderma Harzianum và ứng dụng chế phẩm trong nông nghiệp”

1.2 Mục đích và mục tiêu của đề tài:

1.2.1 Mục đích:

+ Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy Trichoderma harzianum

+ Khảo sát khả năng phòng nấm gây bệnh của chế phẩm Trichoderma Harzianum trên rau cải bẹ xanh

1.2.2 Mục tiêu:

+ Xác định thành phần môi trường tối ưu nuôi cấy chủng Trichoderma Harzianum

+ Xác định khả năng phòng bệnh của chế phẩm Trichoderma Harzianum

trên cây rau cải bẹ xanh

1.3 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

Tạo tiền đề cho các nghiên cứu ứng dụng rộng rãi chế phẩm từ nấm

Trichoderma trong sản xuất rau quả sạch an toàn

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học của nấm Trichoderma

2.1.1 Vị trí phân loại:

Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong công

tác phân loại do còn nhiều đặc điểm cần thiết cho phân loại vẫn còn chưa được biết đầy đủ Theo truyền thống, hệ thống phân loại thường dựa vào sự khác biệt về đặc trưng hình thái, đặc điểm bào tử, cành bào tử và quá trình sinh sản bào tử vô tính

Năm 1801, Persoon ex Gray đã phân loại Trichoderma như sau: [22]

Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Euascomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Ainsworth và Sussman lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae [7]

Theo hai nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da Silva, Trichoderma thuộc

họ Hypocreaceae, lớp Nấm túi Ascomycetes; Các loài Trichoderma được phân thành 5

Hypocreanum Trong đó, 3 nhóm Trichoderma, Pachybasium và Hypocreanum có giai đoạn teleomorph (hình thái ở giai đoạn sinh sản hữu tính) là Hypocrea, nhóm Hypocreanum hiếm khi gặp dưới dạng teleomorph độc lập, nhóm Saturnisporum

không tìm thấy hình thức teleomorph [10]

Ngoài ra, theo tài liệu thống kê, có 6 chủng Trichoderma phổ biến: T Hazianum, T.Viride, T Reesei, T Longibrachiatum, T Koningii và T Hamatum

2.1.2 Đặc điểm hình thái [1], [4], [6]

Trichoderma là loại nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ khuẩn

ty, phát triển tốt trên đất và các tàn dư thực vật

Khuẩn ty của nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, phía cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không vách ngăn, không màu, liên kết thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử hình cầu, elip hoặc hình oval (với tỉ lệ dài : rộng từ 1 – 1,1 m) hay hình chữ nhật (với tỉ lệ dài rộng là hơn 1,4 m), đa số bào tử trơn láng, kích thước không quá 5 m Đặc điểm nổi bậc

của nấm Trichoderma là bào tử có màu xanh đặc trưng, một số ít có màu trắng (như T Virens), màu vàng hay xanh xám Trên môi trường PGA, khuẩn lạc ban đầu có màu

trắng, khi sinh bào tử thì chuyển sang xanh đậm, xanh vàng hoặc lục trắng Và một số loài còn có khả năng tiết ra một số chất làm môi trường hóa vàng

Hình 2.1 Khuẩn ty và cơ quan sinh bào tử của Trichoderma

Hình 2.2 Trichoderma Hazianum T-22 phát triển trên môi trường PDA (vùng

màu xanh chứa bào tử)

Hình 2.3 Môi trường nuôi cấy Trichoderma hóa vàng

Có một số loài Trichoderma cuống bào tử chưa được xác định Nó là một nhóm

sợi nấm bện vào nhau Một số loài khác cuống bào tử lại mọc lên từ những cụm hay

những nốt sần dọc theo sợi nấm hoặc ở khu vực tỏa ra của khuẩn lạc (T Koningii), có

kích thước từ 1 – 7 m, có hình đệm rất rắn chắc hoặc dạng như bông không rắn chắc, những nốt sần này dễ dàng được tách khỏi bề mặt thạch agar và chúng hoạt động như chồi mầm

2.1.3 Cấu tạo tế bào, sự sinh trưởng và hình thành bào tử của Trichoderma: [1]

2.1.3.1 Cấu tạo tế bào:

Trichoderma, cũng như các loại nấm mốc khác, có thành tế bào cấu tạo chủ

yếu là chitin (là polymer của n – acetylglucosamine) và chitosan (chitin bị deacetyl hóa) và các thành phần khác gồm  - glucan,  - glucan, mannoprotein (Siu – Wai Chui và David Moore, 2001), chất màu, lipid (8 – 33%) Màng tế bào dầy khoảng 7m, thành phần chủ yếu là lipid (40%) và protein (38%) Nhân phân hóa, thường hình tròn, đôi khi kéo dài, đường kính khoảng 2 – 3 m Ty thể hình elip, luôn di động

để tham gia vào quá trình hô hấp của tế bào (Lâm Thanh Hiền, 1999)

và NH3 là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi trồng Trichoderma

Ngoài ra, muối, các nguồn sulfur và các hỗn hợp như vitamin cũng có ảnh hưởng lớn

đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma Nhưng muối sodium chloride sẽ làm giảm

sự sinh trưởng và phát triển của một số loài Trichoderma Do đó trong môi trường

nuôi trồng không được có mặt của muối này

Nồng độ CO2 trong môi trường nuôi trồng cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm đối kháng trong đất Tuy nhiên ảnh hưởng của CO2 đến khả năng sinh

trưởng và sản xuất của Trichoderma phụ thuộc vào nồng độ pH của môi trường đất

Khi tăng nồng độ CO2 từ 2 - 10% thì tốc độ mọc của Trichoderma giảm trong môi

trường acid và tăng trong môi trường kiềm, và khi độ pH đạt đến 10% thì nồng độ CO2

không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của Trichoderma Như vậy CO2 có ảnh

hưởng đến sự sinh trưởng của Trichoderma tại độ pH có giá trị cao Tuy nhiên ở nồng

độ cao, CO2 sẽ ức chế mạnh sự phát triển của Trichoderma trong môi trường kiềm Điều này có thể giải thích vì sao Trichoderma chỉ phát triển trong môi trường đất

phèn, ẩm ướt, ít hiện diện trên đất kiềm [19]

2.1.3.3 Sự hình thành bào tử trên môi trường:

Phần lớn các loài Trichoderma có cảm quang, dễ nảy mầm ở nhiều điều

kiện môi trường tự nhiên và nhân tạo dưới điều kiện tối sáng lẫn lộn, hay bào tử có thể xuất hiện trong điện sáng Môi trường agar trong thời gian khoảng 20 – 30 giây với

cường độ chiếu sáng 85 lux thì làm tăng hiệu quả tạo bào tử Thể bào tử phialoconidio

cảm ứng với ánh sáng nhất sẽ xuất hiện nhiều dưới ánh sáng ban ngày trong khoảng 3 phút hoặc gần tia cực tím (bước sóng 366nm) trong khoảng 10 – 30 giây Các tác giả

đã công bố Trichoderma không hình thành bào tử dưới bước sóng 254nm hoặc trên

1.100nm và hình thành bào tử nhiều nhất ở bước sóng 380nm đến 440 nm Các bào tử cảm quang hạn chế phát triển dưới ảnh hưởng của hóa chất Các hỗn hợp như

azaguanine, 5 – fluorouracil, actiomycin D, cyloheximide, phenethyl alcohol và ethidium bromide ngăn cản sự hình thành các hậu mô bào tử, đây là một cấu trúc đặc biệt của cơ thể rất quan trọng trong hình thái học làm tăng tiềm năng trong phòng trừ

sinh học T Hazianum, T Hamatum, T Viride, T Virens ở trong cả môi trường lỏng

và rắn có acid thích hợp cho bào tử nảy mầm hơn là trong môi trường trung tính

2.1.4 Đặc điểm sinh thái, sinh hóa: [6], [12], [13], [16], [22]

Trichoderma spp là nhóm vi nấm phổ biến ở đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng,

đầm muối và đất sa mạc Hầu hết chúng là các vi sinh vật hoại sinh nhưng chúng cũng

có khả năng tấn công các loại nấm khác Trichoderma rất ít tìm thấy trên thực vật sống

và không sống nội kí sinh với thực vật Chúng có thể tồn tại trong tất cả các miền khí hậu từ miền cực Bắc tới những vùng núi cao cũng như miền nhiệt đới Tuy nhiên có một sự tương quan giữa sự phân bố các loài và các điều kiện môi trường

T Polysporum và T Viride có mặt ở vùng khí hậu lạnh, trong khi T Hazianum

có ở các vùng khí hậu nóng Điều này tương quan với nhu cầu nhiệt độ tối đa cho từng loài

Trichoderma là vi nấm ưa độ ẩm, chúng đặc biệt chiếm ưu thế ở những nơi ẩm

ướt và những khu rừng khác nhau Các loài Trichoderma khác nhau thì yêu cầu về độ

ẩm cũng khác nhau T Hazianum và T Pseudokoningii có thể chịu điều kiện độ ẩm

cao hơn so với những loài khác

Đa số các dòng nấm Trichoderma phát triển ở trong đất có pH từ 2.5 – 9.5, phát triển tốt nhất ở pH 4.5 – 6.5 Nhiệt độ để Trichoderma phát triển tối ưu thường là 25 –

300C, một vài dòng phát triển tốt ở 350C và một số ít phát triển ở 400C (Gary J Samuels, 2004) Theo Prasun K M và Kanthadai R (1997) hình thái khuẩn lạc và bào

tử của Trichoderma khác nhau khi ở nhiệt độ khác nhau Ở 350C chúng tạo ra những khuẩn lạc rắn dị thường với sự hình thành bào tử nhỏ và ở mép bất thường Và ở 370C không tạo bào tử sau 7 ngày nuôi cấy

Trichoderma có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbonhydrat,

amino acid đến amonia

Trichoderma có thể được phát hiện trong đất nhờ mùi hương của chúng, hương

dừa (6 – pentyl -  - pyrone dễ bay hơi) thường được tạo ra trong quá trình sinh trưởng

của Trichoderma

Với các phương pháp pha loãng, người ta ước tính Trichoderma có thể đạt đến

3% tổng số vi nấm hiện diện trong các loại đất rừng và 1.5% số lượng nấm trong đất đồng cỏ

Tuner và cộng sự (1997) chỉ ra rằng T Longibachiatum và T citrinoviride có

nhiều sự trùng nhau về khu vực phân bố địa lý Sự phân bố rộng khắp này có lẽ là do

sự phát tán hiệu quả (nhờ gió và côn trùng) hoặc biểu hiện một quá trình tiến hóa sớm

2.2 Ứng dụng của chế phẩm sinh học Trichoderma

2.2.1.Ứng dụng chế phẩm sinh học phục vụ cây trồng: [6]

Phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh được sự trợ giúp của vi sinh vật chuyên biệt có khả năng thúc đẩy quá trình chuyển hóa các phế thải hữu cơ thành phân bón

Thông thường trong các nhóm vi sinh vật chuyển hóa cellulose và ligno

cellulose là các loài Aspergillus Niger, T Reesei, Aspergilus sp., Pennicilium sp., Paeceilomyces sp … Nhóm nấm đối kháng Trichoderma hiện nay đang được ứng

dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất phân hữu cơ sinh học ở Việt Nam Phân hữu

cơ sinh học có phối trộn thêm nấm đối kháng Trichoderma là loại phân có tác dụng tốt

trong việc phòng trừ các bệnh vàng lá, chết nhanh, còn gọi là bệnh thối rễ do nấm

Phytophtora Palmirova gây ra Hay bệnh vàng héo rũ hay còn gọi là bệnh héo chậm

do một số nấm bệnh gây ra: Furasium Solari, Pythium sp., S rolfssi…

Nhóm phân hữu cơ sinh học bổ sung sinh vật trợ giúp làm giàu dinh dưỡng thường được chế biến bằng cách đưa thêm một số vi sinh vật có tên khác vào ví dụ

như nhóm vi khuẩn cố định nitơ tự do như Azotobacter, vi khuẩn hoặc nấm sợi phân giải photphat khó tan như Bacillus polymixa…

Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần thơ, Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho

thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng sông Cửu Long và Đông Nam Bộ Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng

phân huỷ cellulose, phân giải phân lân chậm tan Lợi dụng đặc tính này người ta đã

trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình

phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP Hồ Chí Minh), phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau ứng dụng hiệu quả.

2.2.2 Ứng dụng chế phẩm sinh học trong cải tạo đất và xử lý phế thải: [6]

Trong các chế phẩm cải tạo đất, nhóm vi sinh vật cũng được ứng dụng cải tạo đất bị ô nhiễm do kim loại nặng và các thuốc hóa học bảo vệ thực vật hữu cơ Các vi sinh vật này sống ở vùng rễ cây có sinh sản ra acid hữu cơ và tạo phức với kim loại nặng hoặc kim loại độc hại với cây trồng (nhôm, sắt…) Một số vi sinh vật có khả năng phân hủy các hợp chất hóa học có nguồn gốc hữu cơ Ngoài ra các vi sinh vật có khả năng phân giải hoặc chuyển hóa các chất gây ô nhiễm trong đất, qua đó tạo lại cho đất sức sống mới Bên cạnh đó chúng còn có thể phân hủy các chất phế thải hữu cơ, cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng, đồng thời giúp cây tăng khả năng kháng bệnh do các tác nhân trong đất gây ra

Các vi sinh vật thường được sử dụng trong cải tạo đất thoái hóa, đất có vấn đề

do ô nhiễm được ứng dụng nhiều như nấm rễ nội cộng sinh (VAM – Vacular Abuscular Mycorhiza) và vi khuẩn Pseudomonas

Xử lý các phế phẩm nông nghiệp: Chế phẩm sinh học nấm đối kháng

Trichoderma ngoài tác dụng sản xuất phân bón hữu cơ sinh học hay sử dụng như một

loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) thì còn có tác dụng để xử lý phân chuồng, phân gia súc, vỏ café, chất thải hữu cơ như rơm, rạ, rác thải hữu cơ rất hiệu quả Chế phẩm sinh

học BIMA (có chứa Trichoderma) của Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí

Minh, đang được nông dân ở Tp Hồ Chí Minh và khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long, Đông Nam Bộ sử dụng rộng rãi trong việc ủ phân chuồng bón lót cho cây trồng Việc sử dụng chế phẩm này đã đẩy nhanh tốc độ ủ loại phân chuồng nhanh gấp 2 – 3 lần so với phương pháp thông thường, giảm thiểu ô nhiễm môi trường do mùi hôi thối của phân chuồng Người nông dân lại tận dụng được nguồn phân tại chỗ, vừa đáp ứng được nhu cầu ứng dụng tăng khả năng kháng bệnh cho cây trồng do tác dụng nấm đối

kháng Trichoderma có chứa trong phân.

2.2.3 Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen: [6], [7]

Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hóa các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học Nhiều gen có

nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong

chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển

2.2.4 Ứng dụng làm chất kiểm soát sinh học: [6]

Hiện nay loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như được

đăng ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật Các chế phẩm nấm Trichoderma

được sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của

cây Nấm đối kháng Trichoderma có khả năng tiêu diệt và khống chế được các loại nấm bệnh hại cây trồng như: R Solani, Fusarium, Phytophtora sp., gây bệnh thối rễ, chết yểu, héo rũ Khả năng này là do Trichoderma tiết ra một loại enzym làm tan vách

tế bào của các loài nấm khác, sau đó nó tấn công vào bên trong nấm gây hại và tiêu diệt chúng

Chế phẩm sinh học này tạo điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm phát triển sống trong đất, kích thích sự tăng trưởng và phục hồi bộ rễ, đồng thời có khả năng phân giải tốt các chất xơ, chitin, ligin, trong phế thải hữu cơ thành các chất dinh dưỡng, tạo điều kiện cho cây hấp thụ dễ dàng Sử dụng chế phẩm kết hợp với phân hữu cơ có tác dụng cải tạo làm cho đất xốp hơn và làm tăng hàm lượng chất mùn và mật độ côn trùng có ích, giữ được độ phì của đất

Tóm lại tiềm năng sử dụng chế phẩm sinh học trong canh tác cây trồng rất lớn,

là một hướng đi đúng đắn, hướng tới một nền nông nghiệp hữu cơ sinh thái bền vững

và thân thiện với môi trường

Tuy nhiên, trên thực tế việc sử dụng chế phẩm sinh học ở Việt Nam còn rất hạn chế, đặc biệt là nhóm chế phẩm sinh học phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng Vì vậy nhà nước và ngành nông nghiệp phải có chính sách khuyến khích hỗ trợ các doanh nghiệp đầu tư vào sản xuất, kinh doanh trong lĩnh vực này Ngoài ra, cần có sự đầu tư chuyển giao kỹ thuật, tuyên truyền, hướng dẫn để người nông dân ủng hộ và ứng dụng rộng rãi các chế phẩm sinh học trong sản xuất nông nghiệp Như vậy mới giúp cho nông dân có

thể nâng cao chất lượng, giảm giá thành sản phẩm, tăng thu nhập cho nông dân trong nền kinh tế hội nhập và cải thiện chất lượng môi trường

2.2.5 Ứng dụng trong lương thực và ngành dệt: [7], [23]

Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzyme ngoại bào rất có hiệu quả Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt cho các mục đích tương tự Ví dụ, cellulase của nấm được dùng trong dệt vải quần jean, làm vải mềm hơn hoặc trong việc wash làm bạc vải quần Các enzyme cũng được dùng trong thức ăn gia cầm để tăng tiêu hóa của hemicelluloses từ lúa mạch hoặc các loại cây trồng khác

2.3 Khả năng kiểm soát sinh học của Trichoderma

2.3.1 Tương tác với nấm bệnh: [14]

Sự tương tác đối kháng giữa Trichoderma và các loại nấm khác được phân loại

như sau: tiết ra các chất kháng nấm bệnh, kí sinh trên cơ thể của nấm bệnh, cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh Những cơ chế này không tách biệt nhau, và cơ chế đối

kháng thực tế có thể là một trong những loại cơ chế này Ví dụ, sự kiểm soát Botrytis trên nho bởi Trichoderma bao gồm cả sự cạnh tranh dinh dưỡng và sự kí sinh trên

hạch nấm, cả hai cơ chế đã ngăn chặn tác nhân gây bệnh Cả cơ chế tạo ra chất kháng nấm và cơ chế kí sinh có thể liên quan đến sự cạnh tranh dinh dưỡng, sự sản xuất ra chất độc có ảnh hưởng đến tình trạng dinh dưỡng của môi trường tăng trưởng Các kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy các chất kháng sinh và các enzym thủy phân không chỉ được tạo ra đồng thời mà còn hỗ trợ nhau trong cơ chế đối kháng kí sinh

Gần đây có giả thiết cho rằng tác nhân kiểm soát sinh học T Harzianum T39 làm giảm lượng enzim phân hủy pectin do B Cinerea tạo ra do đó làm giảm sự gây

bệnh

2.3.1.1 Cơ chế tiết ra các chất kháng nấm bệnh (antibiosis):

Các chủng Trichoderma sản xuất đa dạng các chất chuyển hóa thứ cấp dễ

bay hơi và không bay hơi, một vài chất loại này ức chế vi sinh vật khác mà không có

sự tương tác vật lý Chất ức chế được coi là chất kháng sinh Chất có mùi dừa 6 – n –

pentyl – 2H – pyran – 2 – one (PPT) được tìm thấy ở một số chủng Trichoderma phân lập được Các chủng Trichoderma sản xuất nhiều loại kháng sinh khác nhau, môi

trường cũng tác động vào sự sản xuất cả về chất lượng và số lượng Hơn nữa các kháng sinh đặc hiệu tác động vào các tác nhân gây bệnh khác nhau thì khác nhau

2.3.1.2 Cơ chế ký sinh (mycoparasitism):

Theo Chet (1990) cơ chế đối kháng kí sinh gồm 4 giai đoạn:

(a) Sự tăng trưởng có tính chất hướng hóa, nó ký sinh phân nhánh hướng về những nấm đã được định trước, trong giai đoạn này tác nhân kích thích hóa học từ nấm đích hấp dẫn nấm đối kháng

(b) Sự nhận dạng đặc hiệu, vật kí sinh và vật đối kháng được Trichoderma nhận

dạng bằng phân tử, sự nhận dạng này có thể do tự nhiên hay hóa học, có lẽ trung gian bởi lectin trên bề mặt tế bào của các tác nhân gây bệnh và nấm đối kháng

(c) Sự tấn công và xoắn vòng của sợi nấm Trichoderma xung quanh vật chủ

(d) Sự bài tiết các enzym phân giải tế bào thực vật Hệ enzym phân giải vách tế bào bao gồm chitinase, glucanase và protease Những enzym này có khả năng bào mòn thành tế bào hay tiết ra những loại kháng sinh gây thủng sợi nấm vật chủ Đây là khả

năng tấn công trực tiếp của Trichoderma

Hình 2.4 Trichoderma ký sinh trên Pythium gây bệnh trên rễ cây họ đậu (Trichoderma nhuộm màu vàng, Pythium nhuộm màu lục)

Hình 2.5 Hệ sợi nấm Trichoderma ký sinh trên khuẩn ty nấm bệnh

Rhizoctnia solani

2.3.1.3 Cơ chế cạnh tranh (competition):

Cạnh tranh dinh dưỡng với nấm bệnh (competition for nutrient)

Lockwood (1981, 1982) và Wicklow (1992) đã đưa ra khái niệm cạnh tranh khai thác và cạnh tranh cản trở vào tương tác giữa quần thể nấm Sự canh tranh cản trở liên quan đến cơ chế hóa học và tập tính bởi vi sinh vật này giới hạn vi sinh vật khác tiếp xúc cơ chất và xảy ra do sự tương tác giữa hệ sợi nấm trong cùng loài hoặc khác loài

Sự cạnh tranh khai thác xảy ra giữa 2 loài cùng khai thác một nguồn lợi nhưng khác nhau về hiệu quả và tốc độ khai thác Trong trường hợp nguồn lợi là dinh dưỡng được xem như là cạnh tranh dinh dưỡng

Sự cạnh tranh cho mô hoại sinh (competition for necrotic tissue)

Botrytis và Sclerotina spp là mầm bệnh cơ hội tấn công vào mô thực vật lão

hóa hoặc mô chết và coi đó như nguồn dinh dưỡng, từ đây tiếp tục tấn công vào những

mô khỏe mạnh Khi đã xử lý Trichoderma, chúng làm suy yếu, làm chậm sự hình thành khuẩn lạc của Botrytis và Slcerotina trên những loại rau, trái cây khác nhau như

dâu, dưa chuột…

Sự cạnh tranh cho chất dịch rỉ từ hạt (competition for plant exudates)

Bệnh chết nhát (Damping-off) gây bởi Pythium ultimum ở một số loại ngũ

cốc và rau quả được xuất phát bởi sự đáp ứng nhanh chóng của mầm bệnh đối với

dịch rỉ từ hạt Túi bào tử của Pythium nảy mầm và xâm nhiễm vào hạt giống trong vòng vài giờ khi Pythium đã tràn lan trong đất xử lí hạt giống với Trichoderma làm giảm sức nảy mầm của túi bào tử Pythium, hiện tượng này được cho là sự cạnh tranh

chất kích thích nảy mầm

Sự cạnh tranh dinh dưỡng cũng được xem như cơ chế hữu hiệu nhất sử dụng

bởi T Hazianum T-35 trong sự kiểm soát Fusarium oxyporum trong vùng rễ cây bông

vải và dưa hấu

Sự cạnh tranh trên vị trí vết thương (competition for wound sites)

Một trong những thí nghiệm thành công đầu tiên của sự kiểm soát sinh học

trên vết thương do cắt xén là sử dụng T viride, áp dụng trong phun xịt hoặc dùng kéo lớn cắt, để kiểm soát mầm bệnh gây bạc lá (Chondrostereum purpureum) Thể Trichoderma đưa vào được chứng minh có khả năng mọc khuẩn lạc trên cây vừa bị cắt và ngăn ngừa sự xâm nhiễm của mầm bệnh ở rễ (Amillaria luteobubalina)

Sự thối thân thường theo cùng sự xâm nhiễm Botrytis vào vết thương bị cắt

trên cây cà chua trong nhà kính, căn bệnh này rất khó kiểm soát bởi những biện pháp

canh tác Thể Trichoderma được chứng minh có khả năng kiểm soát sự thối thân khi tiêm chủng trước hay cùng lúc với Botrytis, nhưng không có hiệu quả kiểm soát nếu

được tiêm sau, như vậy có thể cho rằng sự cạnh tranh mọc khuẩn lạc trên vết thương là yếu tố xác định sự giảm bệnh

Trong một nghiên cứu sự xâm nhiễm của Pythium vào rễ dưa chuột đã chỉ

ra rằng mặc dù không có sự hình thành khuẩn lạc của chủng T Hazianum trên toàn bộ

rễ nhưng vẫn có sự hình thành khuẩn lạc tại vết thương Sự cạnh tranh dinh dưỡng từ dịch rỉ vết thương của thể cạnh tranh rõ ràng là nguyên nhân làm giảm sự xâm nhiễm

của Pythium.

2.3.2 Tương tác với cây trồng: [15]

2.3.2.1 Hiệu quả của sự hình thành khuẩn lạc ở rễ đến cơ chế trao đổi chất

ở lá:

Một vài nghiên cứu cho thấy sự mọc khuẩn lạc ở rễ do các chủng

Trichoderma dẫn đến sự tăng cường hoạt tính của các enzym có liên quan đến tính

chống chịu của thực vật, bao gồm các peroxidase, chitinase,  - 1,3 – glucanase và

lipoxygenase Trong cây dưa chuột, sự thêm vào Trichoderma Asperellum T-203 đã

dẫn đến sự gia tăng sản lượng xuất phenylalanine amonia lyase nhất thời trong cả rễ và chồi cây, nhưng trong vòng 2 ngày, tác động này sẽ giảm xuống ở mức cơ bản ở cả hai

cơ quan trên Sự thay đổi trong cơ chế trao đổi chất của thực vật có thể dẫn đến sự tích

tụ các hợp chất kháng sinh Trichoderma không chỉ tạo ra chất kháng sinh một cách

trực tiếp mà còn kích hoạt mạnh mẽ vào cây trồng để cây trồng tự sản xuất các hợp chất kháng sinh Sự hình thành khuẩn lạc trên rễ bởi những loại nấm này gây biến đổi đáng kể đến bộ máy trao đổi chất của cây trồng

Những kết quả trên cho phép chúng ta tạo một mô hình cơ chế Trichoderma spp kiểm soát và làm giảm bệnh cây trồng Nhiều loài như T Virens, T Asperellum,

T Atroviride và T Hazianum gây sự thay đổi cơ chế trao đổi chất trên cây trồng làm

tăng cường khả năng kháng lại phổ rộng các tác nhân gây bệnh là các loài vi sinh vật Hơn thế, đáp ứng này còn hiệu quả trên nhiều loại cây trồng Khi bào tử hoặc cơ quan nhân giống khác được thêm vào đất và tiến đến tiếp xúc với rễ thì chúng nảy mầm và tăng trưởng trên bề mặt rễ, và tối thiểu một ít nhiễm vào phía ngoài tế bào rễ Chúng sản xuất tối thiểu 3 loại chất mà tạo ra đáp ứng bảo vệ của cây trồng, đáp ứng này ngăn chặn sự xâm nhiễm nhiều hơn nữa của mầm bệnh Những thể tạo ra sự đáp ứng bao gồm các peptide, protein và hợp chất trogn lượng phân tử nhỏ Trong một vài trường

hợp, sự kháng chỉ mang tính cục bộ như trong trường hợp của T.Virens trên cây bông vải, còn trên hầu hết hệ thống cây trồng Trichoderma khác thì tính kháng mang tính

toàn bộ

2.3.2.2 Cải thiện sự tăng trưởng của rễ:

Trong các nghiên cứu lý thuyết và ứng dụng thương mại, các chủng

Trichoderma đều tăng cường sự phát triển của rễ trên ngô và nhiều loại cây trồng

khác Tác động này kéo dài trong cả cuộc đời của cây lâu năm và có thể được tạo nên bằng thêm vào một lượng nhỏ vi nấm (nhỏ hơn 1g ha-1) được áp dụng như một biện

pháp xử lý hạt giống Ví dụ cây ngô được trồng trên cánh đồng với những hạt giống

được xử lý và không được xử lý với Trichoderma Sau một vài tháng, khi cây trồng đã

cao trên 2m các mương được đào thành các hàng và tần số mặt tiếp xúc của rễ trên khu

vực các luống cày được xác định Sự hiện diện của khuẩn lạc Trichoderma đã làm cho

mặt tiếp xúc của rễ sâu hơn Điều này dẫn đến tăng cường khả năng chịu hạn và có lẽ chống lại những loại đất cứng Sự tăng trưởng của các cây này có thể được tăng cường bởi sự hiện diện của vi sinh vật có ích trên rễ khác

Trong hầu hết các trường hợp đã đề cập ở trên thì không thể tách rời các tác động trực tiếp đến sự tăng trưởng cây trồng khỏi sự kiểm soát các mầm bệnh hoặc cá

vi sinh vật có hại khác ảnh hưởng xấu đến sự tăng trưởng của rễ Sự gia tăng đồng thời

cả sự phát triển của rễ và sự tăng trưởng cây trồng có lẽ gây bởi sự kiểm soát sinh học

và các tác động liên hệ đến rễ do hệ vi sinh vật, và cũng gây bởi sự cải tiến trực tiếp trên trong sự tăng trưởng cây trồng Hệ vi sinh vật có hại cho rễ làm giảm sự tăng trưởng trong sự thiếu vắng hoàn toàn bệnh cây Một vi sinh vật có hại sản xuất cyanid

– có lẽ tồn lưu trong nơi ở của chúng trong cuộc cạnh tranh Trichoderma spp kháng

lai cyanid và tạo ra hai loại enzym khác nhau có khả năng phân hủy chúng trong vùng

rễ Do đó Trichoderma có thể tăng cường trực tiếp cho sự tăng trưởng của rễ, kiểm

soát vi sinh vật có hại không phải là mầm bệnh, tiêu diệt các chất chuyển hóa độc hại được tạo ra bởi vi sinh vật có hại và trực tiếp kiểm soát mầm bệnh ở rễ Sự gia tăng tăng trưởng rễ do những nấm này cùng với sự tăng cường đồng thời tăng trưởng cây và

sự đề kháng stress được thực hiện bởi một vài con đường khác nhau, có thể mỗi đáp

ứng bao gồm nhiều cơ chế mà đã được miêu tả ở sự kiểm soát sinh học trên rễ và lá

Hình 2.6 Sự gia tăng phát triển hệ rễ với thể cạnh tranh T-22 ở vùng rễ

Ghi chú: Without T-22: không được xử lí với T-22

With T-22: đã xử lí với T-22

Hình 2.7 Sự gia tăng sản lượng trên cây ớt với hạt giống được xử lí với T-22 2.3.2.3 Tương tác tăng cường sử dụng chất dinh dưỡng:

Trichoderma spp gia tăng sự sử dụng và tập trung các chất dinh dưỡng (Cu,

P, Fe, Mn, Na) trong rễ trong môi trường ngập nước Sự gia tăng khả năng sử dụng này cho biết sự cải tiến các cơ chế sử dụng chất dinh dưỡng của cây trồng Hơn nữa có thể gia tăng trạng thái cân bằng dinh dưỡng khi thêm nguồn nitơ trong phân bón Điều

này cho thấy Trichoderma gia tăng hiệu quả sử dụng nguồn nitơ trong phân bón trên

cây ngô, và khả năng này có thể làm giảm sự ô nhiễm nitrat trong đất và bề mặt nước

Các phân tích đã cho thấy Trichoderma gây ra sự gia tăng sử dụng các yếu tố bao gồm

As, Co, Cd, Ni, Va, Mg, Mn, Cu, Bo, Zn, Al, Na

Tóm lại chủng Trichoderma có thể hòa tan nhiều loại dinh dưỡng cho cây

trồng khác nhau chẳng hạn như phosphate khó tan, Fe3+, Cu2+, Mn4+, Zn, có thể không dùng được cho cây trồng từ một số loại đất

Bảng 2.1 Tác dụng và hiệu quả đề kháng cho cây trồng do loài Trichoderma

mang lại [15]

Chủng

T.virens G-6,

G-6-5 và G-11

lá, rau diếp, đậu

Dưa chuột Lúa

Tác nhân

gây bệnh

Rhizoctonia solani

Colletotrichum lindemuthianum ; Botrytis cinerea

Botrytis cinerea

Pseudomonas syringae pv

lachrymans

Magnaporthe grisea ; Xanthomonas oryzae

pv.oryzae

Tác dụng

Bảo vệ tất cả các bộ phận của cây trồng, tạo ra chất độc terpenoid phytoalexins cho nấm

Bảo vệ lá khi T-39

đã xuất hiện duy nhất ở rễ

Bảo vệ lá khi T-39 đã xuất hiện duy nhất ở rễ

Bảo vệ lá khi T-203 đã xuất hiện duy nhất

ở rễ, sự sản xuất các hợp chất kháng nấm trên lá

Bảo vệ lá khi NF-9 đã xuất hiện duy nhất

đa

Giảm 42% trong vùng thương tổn

và giảm số lượng

sự lan tỏa các vùng thương tổn

Giảm 100% hội chứng mốc xám

25-Lên tới 80%

sự giảm bệnh trên lá, giảm

100 lần mức

độ tế bào vi khuẩn gây bệnh cho lá

Giảm 34-50% bệnh

Tác nhân

gây bệnh

Botrytis cinera

và Xanthomonas

campestris pv

phaseoli

Alternaria solani

Colletotrichum graminicola

C.orbiculare, P.syringae

pv.lachrymans

Phytophthora capsici

Bảo vệ lá khi T-22 đã xuất hiện duy nhất

ở rễ

Bảo vệ lá khi các chủng

Trichoderma

đã xuất hiện duy nhất ở rễ

Bảo vệ lá khi các chủng

Trichoderma

đã xuất hiện duy nhất ở rễ, tạo ra sự hóa

Giảm tới 80%

hội chứng thối sớm từ sự xâm nhiễm tự nhiên

Giảm 44%

kích thước thương tổn trên lá bị thương và không gây bệnh trên lá không bị thương

Bảo vệ 59%

khỏi bệnh gây bởi

C.orbiculare

và 52% khỏi bệnh gây bởi

P.syringae

Giảm gần 40% chiều dài thương

2.4 Trichoderma Harzianum:

2.4.1 Phân loại: [19]

Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Lớp: Sordariomycetes Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Trichoderma Loài: Trichoderma Harzianum

2.4.2 Đặc điểm: [4]

Giai đoạn đầu phát triển T Harzianum ra tơ màu trắng, sau đó chuyển dần sang

xanh đến ngày thứ 8, tơ chuyển sang xanh lá cây đậm hoàn toàn Mặt trái khuẩn lạc không màu Bào tử trần có hình gần cầu, hình trứng, phần gốc hơi bẹt, nhẵn Bào tử áo

ở giữa sợi nấm hoặc ở đỉnh các nhánh, hình cầu, nhẵn Đường kính 6 – 12m Giá bào

tử trần ngăn vách, phân nhánh 2,3 lần; đường kính 4 - 5m; dài 250m Thể bình 3 - 4

x 5 - 7m, thường thành cụm 2 – 5 cái ở đỉnh tận cùng, cũng đơn độc ở dọc các nhánh Thể bình ở giữa dài tới 17m và có đường kính ở giữa nhỏ hơn 2 – 3m ở phần rộng nhất

Hình 2.8 Khuẩn ty Trichoderma Hazianum

2.4.3 Các ứng dụng: [1]

Chế phẩm gồm Trichoderma Harzianum và Trichoderma Virens là thành phần chính chống lại sự thối rửa của táo sau thu hoạch Trichoderma Harzianum còn được kết hợp với Trichoderma Polysporum trong việc sản xuất Binabt được dùng chữa trị

các vết thương bị nhiễm trùng ở cây trồng

Trichoderma Harzianum AG2 được dung hợp với tế bào trần để phòng các

bệnh cây trồng

Một nghiên cứu gần đây cho biết nếu cây ngô có Trichoderma Harzianum T –

22 kí sinh ở rễ thì cần lượng phân đạm ít hơn 40% so với rễ không có Trichoderma Harzianum T – 22

Nhiều công trình khoa học đã chứng minh rằng Trichoderma Harzianum và Trichoderma Koningii kích thích sự nảy mầm và tăng trưởng của cây Đối với các hoa được trồng trong nhà kính thì Trichoderma Harzianum đẩy nhanh sự ra hoa bằng cách

rút ngắn ngày ra hoa hay tăng số lượng hoa

Một số chủng Trichoderma Harzianum còn có thể xâm nhập vào mô tế bào cây,

làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng

Trichoderma Harzianum đã chứng tỏ khả năng phân giải hiệu quả của chúng

trên ciliatin, glycophosphat và amino methylphosphoric acid (3 – methoxyphenyl)

Trichoderma Harzianum 2023 (Khoa sinh lý thực vật Trường Đại học Califonia) có

thể phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachchlorophenol Nấm này phân giải endosulfan trong nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau trong suốt quá trình sinh sống của nó

Trichoderma Harzianum CCT-4790 phân giải 60% thuốc diệt cỏ Duirion trong

đất trong 24h, đây là một tiềm năng tốt để xử lý sinh học các hóa chất ô nhiễm trong

đất và trong đầm lầy

2.5 Nấm Fusarium:

2.5.1 Phân loại: [29]

Giới: Fungi Ngành: Ascomycota Bộ: Hypocreales Họ: Hypocreaceae Giống: Fusarium Fusarium có hơn 20 loài Và ba loài Fusarium phổ biến thường gặp nhất là: F Solani, F Oxysporum, F Chlamydosporum [30]

2.5.2 Đặc điểm: [26], [30]

Fusarium phát triển nhanh trên môi trường Sabouraud dextro agar ở 250C Khuẩn lạc là những sợi tơ mịn như bông, bằng phẳng, mọc lan rộng Mặt trước khuẩn lạc thường có màu trắng, kem, nâu vàng, vàng, đỏ hoặc tím… Mặt sau khuẩn lạc có thể không màu, vàng nâu, đỏ hay tím sẫm…Hạch nấm, hệ các sợi nấm không hoạt động trong suốt thời gian dài với điều kiện bất lợi, có thể được nhìn thấy bằng mắt thường và nó có màu xanh đậm

Fusarium là chi lớn nhất trong Tuberculariaceae, chúng hoại sinh hoặc ký sinh

trên nhiều cây trồng, cây ăn trái và rau Nó là nguyên nhân chính làm héo rũ cây chủ

Hệ sợi nấm lan toả khắp mô mạch và lấp kín mạch gỗ Sự lấp mạch gỗ sẽ cản trở quá

trình chuyển vận nước làm héo cây, Fusarium cũng sản xuất một số chất độc tiết vào mạch dẫn cây chủ cũng có thể gây héo rũ, nhiều loài thực vật bị Fusarium tấn công

Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ

Một số loài Fusarium gây bệnh héo lá: F udum (trên đậu săn Cajanus cajan), F.oxysporum bv licopersici (trên cà chua Lycospersicon esculentum), F lini (trên cây lanh Linum usitatissimum), F solani (trên khoai tây Solanum tuberosum) và F orthaceras (trên đậu mơ-đậu Thổ Nhĩ Kỳ)

Hầu hết các loài Fusarium phân bố ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, một số

sinh sống trong đất ở khí hậu lạnh [30]

Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa 3 kiểu bào tử vô tính là bào tử đính

lớn (Macroconidia), bào tử đính nhỏ (Microconidia) và bào tử vách dày (hậu bào tử -

Chlamydospores) Bào tử đính lớn dài, nhiều nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh ra từ cuống bào tử, đầu và cuối bào tử lớn thuôn nhọn Một vài loài bào tử lớn tách rời và không gắn trên cuống bào tử, những tế bào sinh bào tử lớn gọi là thể bình (phialide)

Tiểu bào tử đính thường đơn nhân đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng được sinh ra từ một thể bình hay những cuống bào tử phân nhánh hoặc không phân nhánh Tiểu bào tử đính thường được giữ trong một nhóm nhỏ và tiểu bào tử đính của

Fusarium rất giống bào tử của Cephalosporium vì thế giai đoạn này thường Fusarium được xếp vào nấm Cephalosporium

Bào tử vách dầy hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc chen giữa các sợi nấm giả Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, chúng tách ra và mọc các ống mầm nếu bào tử gặp điều kiện thuận lợi Hậu bào tử hay bào tử vách dầy rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài [26]

Hình 2.9 A Khuẩn lạc Fusarium [28]

B Sợi nấm Fusarium dưới kính hiển vi [28]

C Hiện tượng thối rễ do Fusarium gây ra [27]

2.6 Nấm Sclerotium Rolfsii: [6]

2.6.1 Phân loại:

Nấm S rolfsii là nấm gây bệnh hại cây trồng được phát hiện năm 1892 bởi Peter

Henry Rolfs, được phân loại như sau:

Giới: Fungi Ngành: Basidiomycota Lớp: Basidiomycetes

C

Bộ: Agaricales Họ: Typhulaceae Giống: Sclerotium

Hạch nấm ban đầu khi hình thành có màu trắng, về sau chuyển màu vàng, và khi già sẽ có màu nâu đen như màu hạt chè Hạch nấm có dạng hình tròn, nhỏ như hạt cải, kích thước biến động tùy theo các nấm phân lập trên cây kí chủ

Nấm S Rolfsii chủ yếu gây bệnh thối gốc, héo rũ gốc mốc màu trắng trên một

số cây trồng Nguồn bệnh của nấm tồn tại chủ yếu trong đất, trong tàn dư thực vật, cây

kí chủ và trong các vật liệu giống nhiễm bệnh dưới dạng sợi nấm, hạch nấm Bệnh gây nên hiện tượng héo rũ, chết cây và ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây và đến năng suất Biểu hiện của bệnh là các sợi nấm màu trắng và các hạch nấm nhỏ màu nâu tròn dạng hạt cải được hình thành trên bế mặt gốc thân bị bệnh Các sợi nấm trắng phát triển mạnh khi bệnh lây từ cây bệnh sang cây khỏe Phổ kí chủ rộng bao gồm cà chua, ớt, bầu bí, đậu, cà rốt … Bệnh phát triển trong điều kiện thời tiết ấm, mưa hoặc

ẩm

Hình 2.10 S rolfsii phát triển trên môi trường thạch đĩa (A); Triệu chứng mục rửa thân

do nấm kí sinh (B); Nấm gây bệnh trên cây thuốc lá (C); trên Thơm (D)

2.7 Các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về ứng dụng vi nấm Trichoderma [6]

2.7.1 Các nghiên cứu trong nước:

Trichoderma còn được sử dụng để phân giải rác sinh hoạt và các phế thải nông nghiệp nhờ khả năng tiết ra cellulase, enzym này bền nhiệt hơn vi khuẩn (Nguyễn

Xuân Thành, 2003) Viện năng lượng Nguyên tử Việt Nam, Hoàng Hưng Tiến (2005),

đang tiến hành nghiên cứu “Gây tạo và chọn lọc đột biến Trichoderma chống chịu

thuốc trừ nấm hóa học tồn lưu trong đất canh tác bằng tia cực tím”

Lê Đình Đôn và cộng sự (2006) đã đánh giá hiệu quả phòng trừ nấm bệnh hại

cây trồng trong điều kiện đồng ruộng của T Virens, T Hazianum và T Asperellum

(có nguồn gốc trong nước) Thiết lập hoàn chỉnh qui trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học của 3 loại nấm này và đã đăng ký thương mại ba chế phẩm

“Trichoderma cho cây sầu riêng”, “Trichoderma cho cây rau xanh”, và “BIO – TRI”

với bản quyền thuộc trường Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, góp phần tạo sản phẩm nông nghiệp an toàn trong sử dụng

Cùng với chức năng nghiên cứu, chuyển giao công nghệ và sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp, năm 2007, Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM đã nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm sinh học BIMA có chứa vi

nấm Trichoderma, Trichoderma là loại nấm đối kháng có tác dụng cao trong việc thúc

đẩy quá trình phân hủy chất hữu cơ và có nhiều tác dụng, được dùng cho các loại cây trồng Chống được các loại nấm bệnh cây trồng gây bệnh thối rễ, chết yểu, xì mủ,…

do các nấm bệnh (R.Solani, Fusarium Solani, Phytophthora, S rolfsii,…) gây nên tạo

điều kiện tốt cho vi sinh vật cố định đạm sống trong đất phát triển Sinh tổng hợp các

enzym cellulase, chitinase, protease, pectinase, amylase có khả năng phân giải tốt các

chất xơ, chitin, lignin, pectin trong phế thải hữu cơ thành các đơn chất dinh dưỡng, tạo điều kiện cho cây hấp thu dễ dàng

2.7.2 Các nghiên cứu ngoài nước:

Trichoderma là loài sản xuất nhiều kháng sinh và enzym như chitinase, cellulase, đây là 2 loại enzym chính phân giải thành màng tế bào, phá hủy khuẩn ty của các nấm đối kháng với Trichoderma Một vài loài Trichoderma có tác động làm

tăng tỷ lệ nảy mầm Tuy nhiên cơ chế của tác động này chưa được biết (Gary J Samuels, 2004)

Trong quá trình sinh sản vô tính của Trichoderma có thể xảy ra hiện tượng đột

biến nên di truyền lại cho thế hệ sau hoặc sai sót từ quá trình phân chia tế bào và tác động của điểu kiện môi trường sống khác nhau nên sẽ dẫn đến sự sai khác và đa dạng

trong kiểu gen cũng như kiểu hình của cùng một loài Trichoderma Vì thế sẽ tạo ra

những dòng thích nghi tốt trong điều kiện sinh thái, địa lý khác nhau và đây chính là những dòng rất có ý nghĩa trong nghiên cứu cũng như việc tạo chế phẩm sinh học kiểm soát nấm bệnh thực vật (Gary E.Harman, 2000)

T Hazianum có khả năng phân hủy các hợp chất gây ô nhiễm trong đất rừng

Sự tồn tại của các hợp chất chlorouaiacol, hợp chất AOX (các hợp chất halogen thấm nước) trong chất thải của các nhà máy sản xuất bột giấy ở hồ Bonney, vùng Đông Nam

nước Úc và các sản phẩm phân giải của T Hazianum đã được nhà khoa học Van

Leeuwen cùng các cộng sự nghiên cứu ( Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998)

Chất tẩy trắng chlor của các nhà máy sử dụng sulfit hóa bột giấy được tháo ra

hồ một cách gián đoạn đã làm xuất hiện các hợp chất chlorophenol trong nước và cặn bẩn Hợp chất chlorophenol có khả năng làm giảm bớt sự tập trung của các chất tự do 2,4,6 – trichlorophenol; 4,5 – dichlorophenol và cả AOX trong môi trường chứa muối khoáng Loài nấm này cũng có khả năng dehalogen hóa tetrachloroguaiacol tự do trong môi trường khoáng mặn (Elisa Esposito và Manuela da Silva, 1998)

Sự cần thiết của việc tái tạo nguồn năng lượng được chú trọng trong việc tái tạo nguồn polysaccharide cellulose, là cơ chất có thể thủy phân bằng ezym để sản xuất

đường T Reesei QM9414, một vi sinh vật có thể tổng hợp cellulase, là đối tượng đột

biến bằng cách sử dụng kết hợp ánh sáng tia UV và sodium nitrite (45 phút, 0.5mg/l) Chủng đột biến có khả năng kháng lại mạnh hơn đối với các chất ức chế bởi đường sự gia tăng khả năng sinh tổng hợp cellulase tăng lên 1.5 – 1.75 lần và khả năng thủy phân tăng lên 1.2 lần (N.J Gadgil và ctv, 1995)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện:

- Cân điện tử loại 2 số lẻ

- Nồi hấp khử trùng autoclave, hiệu HYRAYAMA

- Máy microwave, loại LG microwave OVEN

3.2.2 Vật liệu nghiên cứu:

+ Giống: rau cải bẹ xanh, loại cải bẹ xanh cao cây

+ Loại nấm bệnh xử lý: Sclerotium Rolfsii và Fusarium, do Phòng thí nghiệm

Vi sinh Trường CĐ Kinh tế - Công Nghệ TP HCM cung cấp

+ Chủng Trichoderma Harzianum, do Phòng thí nghiệm Vi sinh Trường CĐ

Kinh tế - Công nghệ TP HCM cung cấp

+ Môi trường nuôi cấy Trichoderma Harzianum và vi nấm gây bệnh

+ Môi trường bán rắn nhân giống Trichoderma Harzianum

3.3 Bố trí thí nghiệm:

Nuôi cấy chủng Trichoderma Harzianum trên môi trường bán rắn có bổ sung

chitin

Nuôi cấy, nhân giống vi nấm gây bệnh Sclerotium Rolfsii và Fusarium

Quan sát đại thể, vi thể Trichoderma Harzianum

Tối ưu hóa thành phần môi trường nuôi cấy Trichoderma Harzianum

Khảo sát khả năng phòng chống nấm bệnh của chế phẩm Trichoderma Harzianum trên cây rau cải bẹ xanh

3.4 Phương pháp nghiên cứu:

3.4.1 Phương pháp nuôi cấy chủng Trichoderma Harzianum:

 Pha môi trường PGA: [3]

- Để chuẩn bị chất chiết khoai tây, đun sôi 200g khoai tây xắt lát, không gọt vỏ

trong 1 lít nước cất trong 30 phút Lọc qua vải thưa, giữ lại phần lỏng, đó là chất chiết khoai tây

- Trộn với các thành phần khác như Glucose (20g), MgSO4..7H2O (12,8g), agar (20g) rồi đun sôi để hòa tan

- Hấp tiệt trùng trong 15 phút ở 1210C

- Cho từng thể tích 20 – 25 ml vào các đĩa petri vô khuẩn 15 x 100 mm pH cuối

= 5,6  0,2 Lưu ý, nắp petri chỉ được mở một phần khi rót môi trường vào đĩa Sau khi rót môi trường thì đậy nắp lại, xoay đĩa theo đường tròn, tới, lui một cách nhẹ nhàng để tránh môi trường dấy lên thành và nắp đĩa Để yên cho môi trường nguội và đặc lại

- Đối với ống nghiệm, phân phối môi trường vào ống nghiệm có nút bông ngay

sau khi vô khuẩn môi trường Thể tích môi trường được phân phối vào ống nghiệm tùy thuộc vào chiều dài của thạch nghiêng, thường thì cho vào ống nghiệm một lượng môi trường bằng 1/3 thể tích ống nghiệm để làm thạch nghiêng

 Cấy chuyền và giữ giống:

- Từ ống giống gốc, tiến hành cấy chuyền trên môi trường PGA có bổ sung

khoáng, cấy sang 5 ống nghiệm Trong đó, bảo quản 2 ống giống trong tủ lạnh

để giữ giống

- 3 ống còn lại, ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày Tiếp tục cấy chuyền sang những ống nghiệm khác, 3 ống cấy vào 9 ống, ủ trong 5 ngày nhiệt độ phòng

 Nhân giống cấp 1:

 Pha môi trường nhân giống (PG):

- Thực hiện tương tự cách pha môi trường PGA Tuy nhiên ta không bổ sung

agar và sau khi hòa đều các thành phần môi trường ta phân ra các erlen 250ml ( mỗi erlen từ 150 – 200ml môi trường)

- Đóng nút bông lại, gói giấy báo và hấp tiệt trùng

 Tiến hành nhân giống:

- Dùng pipet hút nước cất vô trùng cho vào các ống giống

- Lấy que cấy mài nhẹ trên bề mặt thạch trong ống nghiệm để tách bào tử và hòa

đều chúng với nước cất tạo thành huyền phù

- Cho toàn bộ huyền phù vào trong bình erlen

- Đậy nút bông, gói báo và tiến hành nuôi cấy lắc trong 7 ngày

- Các thao tác được thực hiện trong tủ hút, có đèn cồn