Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy bán rắn thu enzyme cellulase từ nấm mốc aspergiluss niger

TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUN THIÊN NHIÊN TỐI ƢU HĨA MƠI TRƢỜNG NI CẤY BÁN RẮN THU ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger LÊ HOÀNG BẢO NGỌC AN GIANG, 10 – 2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP – TÀI NGUN THIÊN NHIÊN TỐI ƢU HĨA MƠI TRƢỜNG NI CẤY BÁN RẮN THU ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger LÊ HOÀNG BẢO NGỌC AN GIANG, 10 - 2015 CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Đề tài nghiên cứu khoa học: ―Tối ƣu hóa mơi trƣờng ni cấy bán rắn thu enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger‖, tác giả Lê Hồng Bảo Ngọc, cơng tác Khoa Nơng nghiệp – Tài nguyên Thiên nhiên thực Tác giả báo cáo kết nghiên cứu đƣợc Hội đồng Khoa học Đào tạo Trƣờng Đại học An Giang thông qua ngày Thƣ ký Phản biện Phản biện Chủ tịch hội đồng i LỜI CẢM TẠ Để hồn thành đề tài, tơi nhận đƣợc hỗ trợ lớn từ nhà trƣờng gia đình - Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thành viên gia đình tạo điều kiện để tơi nghiên cứu thực đề tài - Xin cảm ơn ban lãnh đạo trƣờng Đại học An Giang cho hội thực đề tài - Xin chân thành biết ơn giúp đỡ thầy cô môn Công nghệ Sinh học, thầy khu thí nghiệm đặc biệt cô Dƣơng Thị Huỳnh Nhƣ tạo điều kiện để tơi hồn thành đề tài - Cuối xin gửi lời cám ơn đến em sinh viên DH13SH giúp đỡ tơi q trình thực đề tài Trân trọng cảm ơn! An Giang, ngày 02 tháng 10 năm 2015 Ngƣời thực Lê Hoàng Bảo Ngọc ii TÓM TẮT Với ứng dụng to lớn nhiều lĩnh vực khác nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp chất tẩy rửa, công nghiệp sản xuất giấy, đặc biệt vai trị enzyme cellulase chuyển hóa sinh khối lignocellulose khơng góp phần giảm thiểu nhiễm mơi trƣờng mà cịn tạo sản phẩm có giá trị khác nhƣ xăng sinh học, đề tài ―Tối ƣu hóa mơi trƣờng ni cấy bán rắn thu enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger‖ đƣợc thực nhằm khảo sát khả sản xuất enzyme cellulase từ nguyên liệu sẵn có địa phƣơng Đề tài bao gồm thí nghiệm để khảo sát ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme cellulase nhân tố: chất cảm ứng (rơm, lục bình (Eichhornia crassipes), vỏ đậu nành, bã mía mùn cƣa với tỉ lệ bổ sung 15, 20, 25, 30 35%); thời gian nuôi cấy (15, 21, 39, 45, 63 giờ); nguồn carbon (glucose, saccharose, lactose với tỉ lệ 1; 1,5; 2%); nguồn nitơ (ammonium sulphat, natri nitrate, ure với tỉ lệ 0,1; 0,2; 0,3%) Cuối xác định khả ảnh hƣởng nhân tố chất cảm ứng, thời gian nuôi cấy, nguồn carbon nitơ thông qua xây dựng phƣơng trình hồi quy tối ƣu hóa phƣơng pháp leo dốc (Box – Wilson) Kết đạt đƣợc nhƣ sau: rơm lục bình nguồn chất thích hợp cho sinh tổng hợp cellulase (bao gồm β – glucosidase endoglucanase) từ Aspergillus niger, thời gian nuôi cấy 21 giờ, nguồn carbon đƣợc lựa chọn 1,5% glucose, nguồn nitơ 0,2% urê ammonium sulphat Bằng việc xây dựng đƣợc phƣơng trình hồi quy nhân tố lƣợng lục bình, thời gian ni cấy, lƣợng glucose lƣợng ammonium sulphat y = 2,5-0,08x1-0,14x2-0,11x3 sử dụng phƣơng pháp leo dốc xác định thành phần môi trƣờng tối ƣu cho trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 22,8 % lục bình, 1,17 % glucose, 0,2 % ammonium sulphat thời gian nuôi cấy tối ƣu 16,6 Qua hoạt tính enzyme endoglucanase tăng gấp 2,33 lần hoạt tính enzyme β-glucosidase tăng gấp 2,78 lần so với mức khảo sát ban đầu Từ khóa: Aspergillus niger, β-glucosidase, endoglucanase, lục bình, Box - Wilson iii ABSTRACT Enzyme cellulase have a lot of application in various industry such as food industry, textile industry, pulp and paper industry, detergent industry, especially in bioconversion of lignocellulosic biomass, that not only reduce enviromental pollution but also can produce valuable product as biofuels Therefore the thesis ―optimization of cellulase production by Aspergillus niger on solid state fermentation medium‖ was conducted to study the ability of enzyme cellulase production from local available by – product materials The thesis include experiments to study the effect on the synthesis of cellulase by Aspergillus niger of induction subtrate (rice straw, water hyacinth (Eichhornia crassipes), soyhull, sugarcane bagasse and sawdust with proportion from 15, 20, 25, 30, 35%), incubation duration (15, 21, 39, 45, 63 hours), carbohydrate source (glucose, saccharose, lactose with proportion from 1; 1,5 and 2%), nitrogen source (ammonium sulphate, sodium nitrate, urea and amount of nitrogen from to 0,3%) The last experiment defined regression equation of factors: subtrate, incubation duration, carbohydrate, nitrogen source and optimized by Box – Wilson method The result shown that rice straw and water hyacinth are suitable for the synthesis of cellulase by Aspergillus niger, the incubation duration is 21 hours, appropriate carbohydrate is 1,5% glucose, nitrogen is 0,2% urea or ammonium sulphate Regression equation of factors include amout of water hyacinth, incubation duration, amount of glucose and ammonium sulphate is y = 2,5-0,08x1-0,14x2-0,11x3 Using Box – Wilson method improve 2,33 fold endoglucanase activity, 2,78 fold β – glucosidase activity compared to innitial studies and define the optimal composition of culture medium are 22,8% water hyacinth; 1,17% glucose; 0,2% ammonium sulphate and 16,6 hours incubation Key word: Aspergillus niger, β-glucosidase, endoglucanase, water hyacinth, Box – Wilson method iv CAM KẾT KẾT QUẢ Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu cơng trình nghiên cứu có xuất xứ rõ ràng Những kết luận khoa học cơng trình chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác An Giang, ngày 02 tháng 10 năm 2015 Ngƣời thực Lê Hoàng Bảo Ngọc v MỤC LỤC Chƣơng 1: GIỚI THIỆU Trang 1.1 Tính cần thiết đề tài 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Đối tƣợng nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu 1.5 Những đóng góp đề tài Chƣơng 2: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 Lƣợc khảo vấn đề nghiên cứu 2.1.1 Tổng quan enzyme cellulase 2.1.2 Tổng quan nấm sợi Aspergillus niger 2.1.3 Giới thiệu số nhân tố ảnh hƣởng đến trình sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật 10 2.1.4 Giới thiệu thành phần môi trƣờng nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme cellulase 13 2.1.5 Các nghiên cứu enzyme cellulase 16 2.2 Câu hỏi nghiên cứu giả thiết nghiên cứu 18 Chƣơng 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Mẫu nghiên cứu 19 3.1.1 Nguyên liệu thô 19 3.1.2 Nấm Aspergillus niger 19 3.2 Thiết kế nghiên cứu 19 3.3 Công cụ nghiên cứu 19 3.3.1 Hóa chất 19 3.3.2 Dụng cụ - thiết bị 19 3.4 Tiến trình nghiên cứu 20 3.4.1 Phƣơng pháp phân tích 20 3.4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣở ồn nguyên liệu làm chấ hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 21 3.4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 22 vi 3.4.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣở ồn carbon bổ trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 22 3.4.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣở ồn nitơ bổ trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 23 3.4.6 Thí nghiệm 5: Tối ƣu hóa mơi trƣờng ni cấy việc tổng hợp enzyme cellulase theo mơ hình Box Wilson 24 3.5 Phân tích liệu 27 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Khảo sát ảnh hƣở ồn nguyên liệu làm chấ sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 28 4.2 Khảo sát ảnh hƣởng thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 30 4.3 Khảo sát ảnh hƣở ồn carbon bổ hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 31 4.4 Khảo sát ảnh hƣở ồn nitơ bổ hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger 33 4.5 Tối ƣu hóa mơi trƣờng ni cấy việc tổng hợp enzyme cellulase theo mơ hình Box Wilson 35 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Khuyến nghị 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC vii 44 DANH SÁCH BẢNG Trang Báng 1: Vi sinh vật phân hủy lignocellulose Bảng 2: Thành phần hữu vỏ trấu 13 Bảng 3: Thành phần dinh dƣỡng cám 14 Bảng 4: Thành phần hóa học lục bình (g/kg vật chất khơ) 14 Bảng 5: Thành phần hóa học bã mía (%) 15 Bảng 6: Thành phần hóa học vỏ đậu nành (%) 16 Bảng 7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 21 Bảng 8: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 23 Bảng 9: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 24 Bảng 10: Ma trận kế hoạch hóa nhân tố chất cảm ứng, thời gian nuôi cấy, carbon, nitơ (quy hoạch thực nghiệm) 26 Bảng 11: Ảnh hƣởng loại tỉ lệ chất cảm ứng đến hoạt tính enzyme β – glucosidase 28 Bảng 12: Ảnh hƣởng loại tỉ lệ chất cảm ứng đến hoạt tính enzyme endoglucanase 29 Bảng 13: Ảnh hƣởng thời gian ni cấy đến hoạt tính enzyme cellulase 30 Bảng 14: Ảnh hƣởng loại tỉ lệ carbon đến hoạt tính enzyme β – glucosidase 32 Bảng 15: Ảnh hƣởng loại tỉ lệ carbon đến hoạt tính enzyme endoglucanase 32 Bảng 16: Ảnh hƣởng loại tỉ lệ nitơ đến hoạt tính enzyme β – glucosidase 34 Bảng 17: Ảnh hƣởng loại tỉ lệ nitơ đến hoạt tính enzyme endoglucanase 34 Bảng 18 : Các mức yếu tố đƣợc chọn 35 Bảng 19: Kết quy hoạch thực nghiệm ảnh hƣởng nhân tố lƣợng lục bình, thời gian ni cấy, lƣợng glucose ammonium sulphat đến hoạt tính enzyme cellulase (β-glucosidase) 36 Bảng 20: Kết thực nghiệm tối ƣu hóa 37 Bảng 21: Lƣợng chất cho vào xây dựng đƣờng chuẩn glucose 47 Bảng 22: Kết đo OD dựng đƣờng chuẩn glucose 47 viii Xylanaza cung cấp cho chăn nuôi Journal of Science of Hanoi National University of Education Vol 52 Nu pp 123-129 Polaina, J & MacCable, P A (Eds.) (2007) Industrial Enzymes – Structure, Funtion and Applications The Netherlands: Springer Schuster, E., Dunn-Coleman, N., Frisvad, J C & van Dijck, P.W.M (2002) On the safety of Aspergillus niger – a review Appl Microbiol Biotechnol 59, 426-435 Singhania, R.R., Sukumaran R K., Patel A.K., Larroche, C & Pandey, A (2010) Advancement and compareative profiles in the production technologies using solid-state and submerged fermentation for microbial cellulases Enzyme and Microbial Technology 46, 541-549 Smith, J C (k.n.) Supercomputers Tackle Biofuel Production Problems Retrieved from http://scidacreview.org/0905/html/biofuel.html Souza, W R (2013) Microbial Degradation of Lignocellulosic Biomass Retrieved from http://www.intechopen.com/books/sustainable-degradation-oflignocellulosic-biomass techniques-applications-andcommercialization/microbial-degradation-of-lignocellulosic-biomass Talekar, S., Ghodake, V., Chavare, S., Ingrole, R., Kate, A., Magdum, S & Pillai, M (2011) Production and characterization of cellulase by local fungal isolate of India using Water Hyacinth as carbon source and reuse of fungal biomass for dye degradation International Journal of Engineering Science and technology Vol.3 No 3236-3241 Trần Thạnh Phong, Hồng Quốc Khánh, Võ Thị Hạnh, Lê Bích Phƣợng, Nguyễn Duy Long, Lê Tấn Hƣng & Trƣơng Thị Hồng Vân (2007) Thu nhận enzyme cellulase Trichoderma reesei môi trƣờng bán rắn Tạp chí phát triển KH & CN, Tập 10, Số 07 Trần Thị Thu Hằng (2013) Nghiên cứu chế tạo vật liệu composite nhựa polyethylene mùn cưa Truy cập từ sở liệu Trƣờng Đại học Đà Nẵng, Đà Nẵng, Việt Nam 43 PHỤ LỤC A PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM Quy trình tổng quát sản xuất bột bào tử Aspergillus niger (Lê Nguyễn Hồng Cúc, 2010) Chuẩn bị môi trƣờng ống thạch nghiêng Cơ chất Nƣớc Cấy mốc Aspergillus niger Ủ 300C, ngày Túi nhựa polypropylen Trộn Dung dịch đệm phosphate 0,05 M nƣớc cất Giống ống thạch nghiêng Khử trùng nhiệt ƣớt Để nguội 38 – 400C Dịch trích bào tử Chủng bào tử vào chất Trộn Ủ 30 – 380C, – ngày Thu hoạch bào tử (trong khối chất) Sấy khơ Xay nhuyễn Bột bào tử mốc Hình 13: Quy trình tổng quát sản xuất bột bào tử nấm Aspergillus niger Giải thích quy trình: 44 Ni giống: - Cấy giống Aspergillus niger vào môi trƣờng ống thạch nghiêng, ủ 300C ngày - Dịch trích bào tử: Hút ml nƣớc cất vô trùng cho vào ống thạch nghiêng thứ nhất, dùng que cấy vô trùng thu toàn sinh khối bề mặt thạch, dịch trích thu đƣợc cho vào ống thạch nghiêng thứ hai tiếp tục chà để thu sinh khối Hút ml dịch trích bào tử cho vào chất trùng để sản xuất bột bào tử - Cơ chất: Cân 40g hỗn hợp + cám theo tỷ lệ : 1, bổ sung 0,08g đạm amoni sulfate 17 ml nƣớc cất túi nhựa PP để môi trƣờng đạt độ ẩm 35% giúp nấm Aspergillus niger sinh bào tử tốt Túi chứa chất đƣợc đem trùng 1210C 30 phút Sau hấp trùng, chất đƣợc để nguội đến 30 – 400C - Cơ chất hấp trùng cho vào khay nhựa 7cm x 16cm chủng giống với tỷ lệ dịch trích 25% so với chất, tức ml dịch trích/ 40g chất khơ Đem ủ 300C - ngày - Thu hoạch toàn khối chất chứa bào tử khay nhựa - Sấy khô 400C 24 - Xay mẫu máy xay sinh tố bảo quản bột bào tử tử lạnh Phƣơng pháp xác định mật số bào tử (Trần Linh Thƣớc, 2010) Xác định gián tiếp số lƣợng bào tử cách đếm số khuẩn lạc phát triển môi trƣờng thạch: Dùng micropipet hút 0,1 ml dịch huyền phù nhƣ pha lỗng nồng độ thích hợp cho vào đĩa môi trƣờng PDA chuẩn bị sẵn, dùng que chà thủy tinh dàn lƣợng chất lỏng chứa bào tử bề mặt thạch ủ 24 giờ, sau tiến hành đếm khuẩn lạc Kết đếm số bào tử sống đƣợc trình bày số đơn vị hình thành khuẩn lạc CFU/ml (colony-forming unit) thay số tế bào/ml có khả nhiều tế bào hình thành nên khuẩn lạc Số lƣợng bào tử ml mẫu đƣợc tính theo công thƣc sau: Mi (CFU/ml) = Ai x Di/ V Trong đó: Ai số khuẩn lạc trung bình/ đĩa Di độ pha lỗng V thể tích huyền phù bào tử cho vào đĩa (0,1 ml) Mật số bào tử trung bình trog mẫu ban đầu trung bình cộng Mi độ pha lỗng khác Cách tính số bào tử/ g vật chất khô chất: từ số bào tử/ g chất tƣơi ta tính đƣợc số bào tử/ g vật chất khô chất theo công thức: h = x/y 45 Trong đó: h số bào tử/ g vật chất khô chất x số bào tử/g chất tƣơi y số g vật chất khô chất có 1g chất tƣơi Chuẩn bị hóa chất phân tích 3.1 Dung dịch đệm citrate: -  Dung Dịch (A) : Acid Citric 0,1M Acid Citric 21,01g Nƣớc cất 1000ml  Dung Dịch (B) : Trinatri citrate 0,1M Trinatri citrate 29,41g Nƣớc cất 100ml  Trộn 20,5 ml dung dịch (A) với 29,5 ml dung dịch (B) thu đƣợc dung dịch đệm citrate có độ pH=5  Trộn 33 ml dung dịch (A) với 17 ml dung dịch (B) thu đƣợc dung dịch đệm citrate có độ pH=4 3.2 Dung dịch Cellobiose 1%: Cân xác 1g cellobiose khơ, hịa tan vào đệm citrate pH 5.0 định mức đủ 100 ml Sau lắc đến hịa tan hồn tồn 3.3 Dung dịch CMC 1%: Cân xác 1g CMC khơ, hịa tan vào đệm citrate pH 5.0 định mức đủ 100 ml Sau lắc đến hịa tan hồn tồn 3.4 Thuốc thử DNS: Cho 1,6g NaOH vào 20 ml nƣớc cất, khuấy (1) Cho tiếp 1g DNS vào 30g Natri Kali tactrat cho vào 50 ml bƣớc cất Khuấy tan hoàn toàn (2) Trộn (1) (2) thành phần lại sau đánh siêu âm đến DNS tan hết Định mức 100 ml Dung dịch đựng chai tránh ánh sáng, đậy nắp kỹ tránh CO2 3.5 Hỗn hợp Na2CO3/NaHCO3: Hòa tan 54,28 g/l (512 mM) 24,2 g/l (288 mM) Cuối cùng, ta đƣợc hỗn hợp có pH 10 Xây dựng đƣờng chuẩn glucose: Cân xác 1g glucose (dạng khơ khơng ngậm nƣớc) hòa tan vào 200 ml với nƣớc cất Sử dụng bình định mức 46 Hút lần lƣợt 0, 1, 2, 3, 4, ml dung dịch đƣờng vào bình định mức 50 ml Thêm nƣớc vạch định mức Các dung dịch đƣờng pha có nồng độ glucose lần lƣợt 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 mg/ml Bảng 21: Lƣợng chất cho vào xây dựng đƣờng chuẩn glucose Số thứ tự ống nghiệm/ Nồng độ glucose (mg/ml) Đối chứng/0 1/0,1 2/0,2 3/0,3 4/0,4 5/0,5 Dung dịch glucose (ml) 2 2 Thuốc thử DNS (ml) 1 1 1 Thực phản ứng: Đầu tiên cho ml thuốc thử DNS vào ống nghiệm, sau cho ml glucose vào (Riêng ống đối chứng thay ml nƣớc cất) Lắc ống nghiệm này, đem đun cách thủy phút nhiệt độ sơi sau để nguội nhiệt độ phịng Đo bƣớc sóng 540nm Bảng 22: Kết đo OD dựng đƣờng chuẩn glucose Glucose (mg/ml) OD DC 0,25 0,1 0,494 0,2 1,035 0,3 1,419 0,4 2,03 0,5 2,455 2.5 y = 4.917x - 0.2385 R² = 0.9962 OD 1.5 OD Linear (OD) 0.5 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Nồng độ glucose (mg/ml) Hình 14: Đƣờng chuẩn glucose 47 0.6 Tiến hành phản ứng đo họat tính enzyme Cho ml cellobiose 1% (hoặc 1ml CMC 1%) ml dung dịch enzyme sau ly tâm vào ống nghiệm, đem ủ bể ủ nhiệt nhiệt độ 500C vòng 30 – 45 phút Kết thúc phản ứng phân cắt enzyme, lấy mẫu khỏi bể ủ nhiệt cho 50μl dung dịch Na2CO3/NaHCO3 vào Và vô hoạt enzyme cách xử lý nhiệt phút nhiệt độ sơi làm nguội đến nhiệt độ phịng Pha lỗng: Cho 0,5 ml dung dịch sau phản ứng vào 19,5 ml nƣớc cất để làm loãng dung dịch Cho ml thuốc thử DNS vào ống nghiệm có chứa ml mẫu sau pha loãng Đun cách thủy nhiệt độ sôi phút làm nguội đến nhiệt độ phịng Sau đó, đo OD bƣớc sóng 540 nm Dựa vào đƣờng chuẩn glucose xác định hàm lƣợng đƣờng khử sinh hoạt tính enzyme β-glucosidase Tính tốn kết Đơn vị hoạt tính enzyme ml enzyme đƣợc tính theo cơng thức: Trong đó: U: Hoạt tính enzyme (U/ml) X: Hàm lƣợng glucose dung dịch đo (mg/ml) Vhh: Thể tích hỗn hợp (enzyme, chất Cellobiose Na2CO3/NaHCO3) T: Thời gian phản ứng (45 phút) VE: Thể tích enzyme (1 ml) B KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣở ồn nguyên liệu làm chấ trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger Phân tích phƣơng sai hoạt tính β- glucosidase – Loại III Tổng bình phƣơng Nguồn biến động Tổng bình Độ Trung bình Tỉ số F Giá trị P phương tự bình phƣơng Nhân tố A:loaicochat 0,507665 0,126916 6,03 0,0004 B:luongcochat 0,360632 0,0721263 3,43 0,0086 Tƣơng tác AB 0,305799 20 0,0152899 0,73 0,7830 Sai số 1,26199 60 0,0210332 Tổng cộng 2,43609 89 48 Kiểm tra khác biệt hoạt tính β- glucosidase loại chất Method: 95,0 percent Duncan loaicochat Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups X bamia 18 1,27324 0,0341835 X vodn 18 1,28961 0,0341835 XX mc 18 1,33139 0,0341835 XX rom 18 1,40787 0,0341835 X lucbinh 18 1,47286 0,0341835 Kiểm tra khác biệt hoạt tính β- glucosidase lƣợng chất Method: 95,0 percent Duncan luongcochat Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups X 15 1,2245 0,0374461 X 35 15 1,35123 0,0374461 X 30 15 1,36265 0,0374461 X 25 15 1,36864 0,0374461 X 20 15 1,39775 0,0374461 X 15 15 1,42518 0,0374461 Phân tích phƣơng sai hoạt tính endoglucanase – Loại III Tổng bình phƣơng Nguồn biến động Tổng bình Độ Trung bình Tỉ số F Giá trị P phương tự bình phƣơng Nhân tố A:loaicochat 0,656567 0,164142 7,60 0,0001 B:luongcochat 0,300215 0,0600429 2,78 0,0253 Tƣơng tác AB 0,49922 20 0,024961 1,16 0,3231 Sai số 1,29604 60 0,0216007 Tổng cộng 2,75204 89 Kiểm tra khác biệt hoạt tính endoglucanase loại chất Method: 95,0 percent Duncan loaicochat Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups X bamia 18 0,906625 0,0346416 X mc 18 0,933956 0,0346416 X vodn 18 0,961897 0,0346416 X lucbinh 18 1,06356 0,0346416 X rom 18 1,1338 0,0346416 Kiểm tra khác biệt hoạt tính endoglucanase lƣợng chất Method: 95,0 percent Duncan luongcochat Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups X 15 0,916809 0,0379479 XX 35 15 0,95086 0,0379479 XXX 30 15 0,975719 0,0379479 XXX 20 15 1,0223 0,0379479 XX 25 15 1,04977 0,0379479 X 15 15 1,08435 0,0379479 49 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng thời gian ni cấy đến q trình sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger  Enzyme β- glucosidase Bảng ANOVA Nguồn biến Tổng bình động phương Between groups 0,803038 Within groups 0,0530489 Total (Corr.) 0,856087 Kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent LSD Count ba muoi chin gio bon muoi lam gio sau muoi ba gio muoi lam gio hai muoi mot gio  Enzyme endoglucanase Bảng ANOVA Nguồn biến Tổng bình động phương Độ tự 10 14 Trung bình Tỉ số F bình phƣơng Giá trị P 0,200759 0,00530489 0,0000 Mean 1,01742 1,05037 1,10596 1,41341 1,60626 Độ tự 10 14 37,84 Homogeneous Groups X X X X X Trung bình Tỉ số F bình phƣơng Giá trị P Between groups 0,978877 0,244719 41,55 0,0000 Within groups 0,0588964 0,00588964 Total (Corr.) 1,03777 Kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups X sau muoi ba gio 0,600932 X ba muoi chin gio 0,600932 X bon muoi lam gio 0,624609 X muoi lam gio 1,05491 X hai muoi mot gio 1,19028 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣở ồn carbon bổ sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger  Enzyme β- glucosidase Phân tích phƣơng sai hoạt tính β- glucosidase – Loại III Tổng bình phƣơng Nguồn biến động Tổng bình Độ Trung bình Tỉ số F Giá trị P phương tự bình phƣơng Nhân tố A:nguon carbon 0,217274 0,108637 10,05 0,0007 B:luong carbon 0,214138 0,0713795 6,60 0,0021 Tƣơng tác AB 0,214462 0,0357436 3,31 0,0162 50 Sai số 0,259403 24 0,0108085 Tổng cộng 0,905278 35 So sánh loại đƣờng nồng độ 1% Bảng ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 0,160725 0,0803623 8,31 Within groups 0,0580509 0,00967514 Total (Corr.) 0,218775 Kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups X sac1% 1,12449 X lac1% 1,16429 X glu1% 1,42577 So sánh loại đƣờng nồng độ 1,5% Bảng ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 0,216616 0,108308 10,45 Within groups 0,0621655 0,0103609 Total (Corr.) 0,278782 Kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups X lac15% 1,28988 X sac15% 1,38116 X glu15% 1,65499 So sánh loại đƣờng nồng độ 2% Bảng ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 0,216616 0,108308 10,45 Within groups 0,0621655 0,0103609 Total (Corr.) 0,278782 P-Value 0,0187 P-Value 0,0111 P-Value 0,0111 Kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups X lac2% 1,28988 X sac2% 1,38116 X glu2% 1,65499 So sánh nồng độ đƣờng glucose Bảng ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,119372 0,0397908 4,62 0,0372 Within groups 0,068976 0,008622 Total (Corr.) 0,188348 11 Kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups X glu0% 1,41616 51 X glu1% 1,42577 X glu2% 1,43332 X glu15% 1,65499 So sánh nồng độ đƣờng saccharose Bảng ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio Between groups 0,202388 0,0674626 9,34 Within groups 0,0578107 0,00722633 Total (Corr.) 0,260198 11 P-Value 0,0054 Kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups X sac1% 1,12449 X sac15% 1,38116 X sac0% 1,41616 X sac2% 1,45665 So sánh nồng độ đƣờng lactose Bảng ANOVA Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0,116726 0,0389088 4,78 0,0342 Within groups 0,0651158 0,00813947 Total (Corr.) 0,181842 11 Kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent LSD Count Mean Homogeneous Groups X lac1% 1,16429 XX lac15% 1,28988 X lac2% 1,38802 X lac0% 1,41616  Enzyme endoglucanase Phân tích phƣơng sai hoạt tính endoglucanase – Loại III Tổng bình phƣơng Nguồn biến động Tổng bình Độ Trung bình Tỉ số F Giá trị P phương tự bình phƣơng Nhân tố A:nguon carbon 0,215551 0,107775 7,51 0,0029 B:luong carbon 0,0257141 0,00857138 0,60 0,6228 Tƣơng tác AB 0,147225 0,0245375 1,71 0,1617 Sai số 0,344292 24 0,0143455 Tổng cộng 0,732782 35 Kiểm tra khác biệt hoạt tính endoglucanase nguồn carbon Method: 95,0 percent LSD nguon carbon Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups X lactose 12 0,901656 0,0345754 XX saccarose 12 0,990444 0,0345754 X glucose 12 1,09107 0,0345754 52 Kiểm tra khác biệt hoạt tính endoglucanase lƣợng carbon Method: 95,0 percent LSD luong carbon Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups X 0,95317 0,0399242 X 0,994519 0,0399242 X 1,00241 0,0399242 X 1,5 1,02746 0,0399242 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣở ồn nitơ bổ tổng hợp enzyme cellulase từ Aspergillus niger Phân tích phƣơng sai hoạt tính β- glucosidase – Loại III Tổng bình phƣơng Nguồn biến động Tổng bình Độ Trung bình Tỉ số F Giá trị P phương tự bình phƣơng Nhân tố A:nguon nito 0,176735 0,0883674 3,56 0,0444 B:luong nito 0,296152 0,0987172 3,97 0,0197 Tƣơng tác AB 0,191029 0,0318382 1,28 0,3031 Sai số 0,596521 24 0,024855 Tổng cộng 1,26044 35 Kiểm tra khác biệt hoạt tính β- glucosidase nguồn nitơ Method: 95,0 percent LSD nguon nito Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups X NaNO3 12 1,469 0,045511 XX Ure 12 1,52579 0,045511 X (NH4)2SO4 12 1,63766 0,045511 Kiểm tra khác biệt hoạt tính β- glucosidase lƣợng nitơ luong nito Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups X 0,1 1,45917 0,0525516 X 1,47792 0,0525516 XX 0,3 1,54953 0,0525516 X 0,2 1,68999 0,0525516 Phân tích phƣơng sai hoạt tính endoglucanase – Loại III Tổng bình phƣơng Nguồn biến động Tổng bình Độ Trung bình Tỉ số F Giá trị P phương tự bình phƣơng Nhân tố A:nguon nito 0,0223841 0,0111921 0,98 0,3912 B:luong nito 0,266537 0,0888456 7,75 0,0009 Tƣơng tác AB 0,0660174 0,0110029 0,96 0,4727 Sai số 0,275128 24 0,0114637 Tổng cộng 0,630067 35 Kiểm tra khác biệt hoạt tính endoglucanase nguồn nitơ Method: 95,0 percent LSD 53 nguon nito NaNO3 Ure (NH4)2SO4 Count 12 12 12 LS Mean 1,09159 1,09841 1,14756 LS Sigma 0,030908 0,030908 0,030908 Homogeneous Groups X X X Kiểm tra khác biệt hoạt tính endoglucanase lƣợng nitơ Method: 95,0 percent LSD luong nito Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups X 0,1 0,99246 0,0356895 XX 0,3 1,0791 0,0356895 XX 1,15528 0,0356895 X 0,2 1,22323 0,0356895 Thí nghiệm 5: Tối ƣu hóa mơi trƣờng ni cấy việc tổng hợp enzyme cellulase theo mơ hình Box Wilson  Endoglucanase Bảng ANOVA Source Sum of Squares Df Between groups 6,2156 Within groups 0,52256 12 Total (Corr.) 6,73816 17 Kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent Duncan Count Mean tn co so 1,28965 tn1 1,45762 tn2 1,7648 tn15 2,252 tn12 2,36522 tn11 3,01204  β- glucosidase Bảng ANOVA Source Sum of Squares Df Between groups 18,4323 Within groups 2,78291 12 Total (Corr.) 21,2152 17 kiểm tra khác biệt Method: 95,0 percent Duncan Count Mean tn co so 1,70076 tn1 1,7286 tn2 2,42647 tn15 2,49421 tn12 2,54618 tn11 4,72886 Mean Square F-Ratio 1,24312 28,55 0,0435467 P-Value 0,0000 Homogeneous Groups X XX X X X X Mean Square F-Ratio 3,68646 15,90 0,23191 Homogeneous Groups X X X X X X 54 P-Value 0,0001 C MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA Hình 15: Nguyên liệu mùn cƣa sau Hình 16: Nguyên liệu vỏ đậu nành sau sấy khơ sấy khơ, xay nhuyễn Hình 17: Ngun liệu bã mía sau Hình 18: Ngun liệu rơm sau sấy sấy khô, xay nhuyễn khô, xay nhuyễn 55 Hình 19: Nguyên liệu lục bình sau Hình 20: Nguyên liệu trấu sau sấy sấy khô, xay nhuyễn khơ Hình 21: Ngun liệu cám sau sấy khơ Hình 22: Mơi trƣờng ni cấy Hình 23: Mơi trƣờng nuôi cấy Aspergillus niger thu cellulase sau 15 Aspergillus niger thu cellulase sau 21 56 Hình 24: Mơi trƣờng ni cấy Hình 25: Mơi trƣờng ni cấy Aspergillus niger thu cellulase sau 39 Aspergillus niger thu cellulase sau 45 Hình 26: Mơi trƣờng ni cấy Hình 27: Môi trƣờng nuôi cấy Aspergillus niger thu cellulase sau 63 Aspergillus niger thu cellulase đƣợc ủ tủ ủ 57 ... cịn giảm nhiễm mơi trƣờng Từ lí trên, chúng tơi tiến hành thực đề tài nghiên cứu ? ?Tối ƣu hóa môi trƣờng nuôi cấy bán rắn thu enzyme cellulase từ nấm mốc Aspergillus niger? ??, với hi vọng đề đƣợc... 22: Môi trƣờng nuôi cấy Aspergillus niger thu cellulase sau 15 ix 56 Hình 23: Mơi trƣờng ni cấy Aspergillus niger thu cellulase sau 21 56 Hình 24: Mơi trƣờng ni cấy Aspergillus niger thu cellulase. .. NHIÊN TỐI ƢU HĨA MƠI TRƢỜNG NI CẤY BÁN RẮN THU ENZYME CELLULASE TỪ NẤM MỐC Aspergillus niger LÊ HOÀNG BẢO NGỌC AN GIANG, 10 - 2015 CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Đề tài nghiên cứu khoa học: ? ?Tối ƣu hóa