CH NGă2 :ăV T LI UăVẨăPH NGăPHÁPăNGHIểNă CU
2.1. TH IăGIANăVẨă Aă IM NGIÊN CU
- Th i gian: T tháng 11/2013 đ n tháng 5/2014
- a đi m: Phịng thí nghi m Cơng Ngh Vi Sinh-Tr ng i h c M Thành ph H Chí Minh.
2.2. V T LI U NGHIÊN C U 2.2.1. iăt ng nghiên c u
Ch ng vi khu n Lactobacillus plantarum NT1.5 đ c cung c p t Phịng thí nghi m Cơng ngh Vi sinhậTr ng i H c M Tp H Chí Minh đư đ c ch ng minh có kh n ng lƠm gi m cholesterol và kh n ng làm probiotic (D ng Nh t Linh và cs., 2013)
2.2.2. Mơiătr ng ậ hóa ch t
Mơi tr ng MRS (Deman, Rogosa and Sharpe).
Môi tr ng MRSA.
C n 96o, c n 70o, H2SO4, NaOH, HCl.
Các lo i đ ng: glucose, sucrose, maltose, m t r đ ng, xylose, manitol.
Cao n m men, pepton, b t đ u nành, b t b p, amonium sulfate ((NH4)2SO4), urê (H2NCONH2)
Các mu i khoáng: NaCl, K2HPO4.3H2O, KH2SO4, MgSO4.7H2O, CaCl2, MnSO4.4H2O, CaCO3,
N c c t, n c mu i sinh lý 0,85 %.
2.2.3. D ng c
a petri, ng nghi m, erlen, becher, pipette, pipettman, đ u típ các lo i, , que c y, lam, lamer, đèn c n, kính hi n vi, gi y đo pH.
2.2.4. Trang thi t b - T c y - T m CO2 - N i h p ti t trùng - Kính hi n vi - Cân k thu t - Cân phân tích
SVTH: TR N TH KI U 25
- T s y - Lò viba
- Máy đo pH
- Máy đo m t đ quang
2.3. PH NGăPHÁPăNGHIểNăC U 2.3.1. Ho t hóa ch ng
T ng gi ch ng 20% glycerol/ -20o C, ti n hành ho t hóa ch ng Lactobacillus plantarum NT1.5 trên 5mL môi tr ng MRS (DeMan Rogosa and Sharpe) 37oC / 24-48 gi .
T ng môi tr ng l ng đư ho t hóa 24-48 gi chúng tôi ti n hành c y ria trên
môi tr ng MRSA (DeMan Rogosa and Sharpe agar), 37oC, 5%CO2, 48 gi .
Sau 48 gi ch n nh ng khu n l c riêng l , đi n hình c y trên môi tr ng th ch
đ ng MRSA gi ch ng cho các thí nghi m ti p theo.
2.3.2. Xây d ng bi uăđ t ngăquanăgi a giá tr OD và n ngăđ t bào.
2.3.2.1. nh l ng t bào b ng ph ng pháp đo OD
Nguyên t c
Khi m t pha l ng có nhi u phân t khơng tan thì s hình thành m t h huy n phù
vƠ có đ đ c b i các ph n t hi n di n trong môi tr ng l ng làm c n ánh sáng, làm phân tán chùm ánh sáng t i. T bào vi sinh v t là m t th c th nên khi hi n di n trong
môi tr ng c ng lƠm môi tr ng tr nên đ c. đ c c a huy n phù t l v i m t đ t bào. Trong m t gi i h n c a đ đ c và m t đ t bào, có th xác l p đ c quan h t l tuy n tính gi a m t đ t bƠo vƠ đ đ c. Do đó, có th đ nh l ng m t đ t bào m t cách gián ti p thông qua đo đ đ c b ng cách so màu các b c sóng t 550 ậ 610 nm (Tr n Linh Th c và cs., 2001).
Th c hi n
Ti n hành pha loãng huy n d ch vi khu n b ng môi tr ng MRS sao cho thu
đ c các huy n d ch có giá tr OD610: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.
Th c hi n đ nh l ng t bào b ng ph ng pháp đ m s l ng khu n l c.
Các giá tr OD610 t ng ng đ c pha loãng và tr i trên đ a môi tr ng MRSA các n ng đ đ m đ c.
SVTH: TR N TH KI U 26
Xây d ng đ ng t ng quan gi a OD610 và m t đ t bƠo t ng ng v i các huy n phù b ng ph n m m Excel c a Microsoft.
2.3.2.2. nh l ng t bào b ng ph ng pháp đ m khu n l c Ph ng pháp đ nh l ng t bào b ng cách đ m khu n l c đ c ti n hành v i các b c sau: (Tr n Linh Th c và cs., 2001) T i các n ng đ OD t n hành pha loãng b c 10 nh : 10-1 , 10-2, 10-3, 10-4, 10- 5,ầ
Tr i 0,1 mL huy n phù sau pha loưng lên đ a môi tr ng MRSA, m i n ng đ
pha loãng tr i 3 đ a.
37oC/5% CO2, 24 -48 gi .
Nh n di n khu n l c đ c tr ng vƠ đ m s khu n l c c a ch ng vi khu n Lactobacillus plantarum NT 1.5 t i m i đ pha lỗng: ch n đ pha lỗng có s khu n l c phân b h p lý nh t và trong kho ng 25 ậ 250 khu n l c/ đ a, đ m s khu n l c trên c 3 đ a l p l i trên cùng đ pha loãng.
Tính s l ng t bào có trong 1 mL m u theo cơng th c sau:
Trong đó:
A: M t đ t bào (CFU/ mL) N: T ng s khu n l c đ m đ c
ni: S đ a đ c đ m n ng đ pha loãng i V: S mL d ch m u c y vào m i đ a.
fi: n ng đ pha lỗng có s khu n l c đ c ch n đ m.
2.3.3. Xây d ngăđ ngăcongăt ngătr ng c a L. plantarum NT 1.5
2.3.3.1. Nguyên t c
S t ng tr ng c a vi sinh v t là s gia t ng s l ng t bào vi sinh v t trong qu n th và t c đ t ng tr ng là s t ng tr ng c a vi sinh v t trong m t đ n v th i
SVTH: TR N TH KI U 27
gian. M t qu n th vi sinh v t th ng có nh ng đ c tr ng t ng tr ng riêng khi đ c nuôi c y trong m t môi tr ng vƠ đi u ki n nh t đnh.
ng thái t ng tr ng c a vi sinh v t b t đ u t m t pha ti m tàng (lag phase).
Sau đó, s t ng tr ng b t đ u và s l ng t bƠo t ng l y ti n, giai đo n này g i là pha log (log phase). Theo th i gian, ngu n dinh d ng trong môi tr ng tr nên c n ki t cùng v i s tích l y c a đ c ch t. S t ng tr ng d ng l i vƠ đi vƠo pha n đ nh (stationary phase). N u ti p t c nuôi c y, các t bào b t đ u ch t vƠ đi vào pha suy tàn (death phase). M i lo i vi khu n l i có đ ng cong t ng tr ng riêng, do đó c n ph i kh o sát đ ng cong t ng tr ng c a ch ng vi khu n đang quan tơm đ xác đ nh đ c th i gian thu nh n s n ph m thích h p (Nguy n ThƠnh t, 2011).
2.3.3.2. Th c hi n
i u ch nh d ch khu n đư ho t hoá đ t giá tr OD610 t ng đ ng 108 t bƠo/mL, sau đó hút 2 mL d ch khu n cho vƠo erlen ch a 18 mL môi tr ng MRS. Nuôi d ch khu n 37o
C/5% CO2.
Theo dõi s t ng tr ng c a vi sinh v t các m c 0 gi , 3 gi , 6 gi , 9 gi , 12 gi , 15 gi , 18 gi , 21 gi , 24 gi , 27 gi , 30 gi , 33 gi , 36 gi , 39 gi , 42 gi , 48 gi b ng cách đo OD610đ xác đ nh m t đ t bƠo sau m i th i gian nuôi c y.
S d ng đ ng t ng quan gi a m t đ t bƠo vƠ OD610 đ xác đ nh m t đ t bƠo t i các giá tr OD610 t ng ng t i m i th i đi m kh o sát.
D a vƠo nh ng m c th i gian vƠ m t đ t bƠo, xơy d ng đ ng cong t ng tr ng c a vi sinh v tb ng ph n m m Excel c a Microsoft.
2.3.4. Kh o sát nhi tăđ , pH thích h p cho s t ngătr ng c a L. plantarum NT1.5
M c đích
Xác đ nh đ c nhi t đ vƠ pH thích h p thu đ c nhi u sinh kh i vi khu n nh t.
SVTH: TR N TH KI U 28
Ho t đ ng trao đ i ch t c a vi sinh v t là k t qu c a các ph n ng hóa h c. Các ph n ng này ph thu c ch t ch vào nhi t đ , do đó y u t nhi t đ nh h ng sâu s c
đ n quá trình sinh tr ng và phát tri n c a vi sinh v t. Vùng sinh tr ng c a vi sinh v t là vùng gi i h n gi a nhi t đ c c đ i và nhi t đ c c ti u mà vùng này khác nhau gi a các loài.
pH lƠ đ i l ng dùng đ đo đ ho t tính c a ion H+ trong môi tr ng. pH nh
h ng đ n ho t đ ng c a vi sinh v t là do s tác đ ng qua l i gi a ion H+ và các enzyme ch a trong thành t bào và màng t bào ch t. M i lồi vi sinh v t ch thích h p s ng trong kho ng pH nh t đnh. (Nguy n Lơn D ng vƠ c ng s , 2000)
Ti n hƠnh
i u ch nh d ch khu n đư ho t hoá đ t giá tr OD t ng đ ng 108
t bào/mL, sau
đó hút 1 mL dch khu n vƠo 9 mL môi tr ng MRS đ c đi u ch nh các giá tr pH l n l t nh sau: 4, 5, 6, 7, 8 (Bevilacqua và cs., 2008).
Nuôi các nhi t đ : 30o
C, 37oC, 40oC.
M i thí nghi m l p l i 3l n.
Sau th i gian nuôi c y, d ch khu n đ c đo OD610 vƠ d a vƠo đ ng t ng quan đ xác đ nh m t đ t bƠo.
K tăqu
S li u đ c x lỦ th ng kê ANOVA b ng ph n m m Statgraphics Plus 3.0 vƠ Excel c a Microsoft.
K t qu đ c trình bƠy d i d ng: trung bình sai s chu n.
2.3.5. Sàng l c các y u t dinhăd ng
2.3.5.1. Ngu n nit
Các ngu n nit đ c kh o sát lƠ: b t b p, b t đ u nƠnh, pepton, (NH4)2SO4, urê v i n ng đ kh o sát đ c th hi n trong b ng 2.1. (Han và cs., 2011; Altaf và cs., 2006)
SVTH: TR N TH KI U 29 ThƠnhăph n N ngăđ (g/L) Pepton 10 B tăb p 15 B tăđ uănƠnh 8 (NH4)2SO4 5 H2NCONH2 3
Môi tr ng ch n l c ngu n Nit t i u g m có ngu n nit c n kh o sát, glucose 20 g/L vƠ các thƠnh ph n cịn l i c a mơi tr ng MRS nh : tween 80, K2HPO4, CH3CO2Na, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O.
2.3.5.2. Ngu n cacbon
Các ngu n cacbon đ c kh o sát là: succrose, maltose, lactose, glucose, m t r
đ ng, b t b p v i kh i l ng kh o sát đ c trình bày trong b ng 2.2. (Altaf và cs., 2006; Farooq và cs., 2012; Han và cs., 2011; Magdalena và cs., 2010)
B ng 2.2. Các ngu n cacbon kh o sát
ThƠnhăph n Kh iăl ngă(g/L)
B tăb p 30 Glucose 20 Maltose 20 Succrose 20 M tăr ăđ ng 40 Lactose 20
Môi tr ng ch n l c ngu n cacbon t i u g m có ngu n nit t i u, ngu n cacbon c n kh o sát và các thành ph n cịn l i c a mơi tr ng MRS: tween 80, MgSO4, K2HPO4, CH3COONa, MnSO4.
SVTH: TR N TH KI U 30
Kh o sát các ngu n khoáng: CaCl2, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, K2HPO4, KH2PO4 v i kh i l ng đ c trình bày trong b ng 2.3.(Han và cs., 2011; Altaf và cs., 2006)
B ng 2.3. Các ngu n khoáng kh o sát
ThƠnhăph n Kh iăl ngă(g/L)
K2HPO4 0.5 KH2PO4 0.5 CaCO3 0.5 NaCl 0.5 CaCl2 0.5 MgSO4.7H2O 0.5
Môi tr ng ch n l c ngu n khoáng t i u bao g m ngu n nit t i u (10 g/L),
ngu n cacbon t i u (20 g/L), và ngu n khoáng c n kh o sát.
Ti n hành
Ch ng L. plantarum NT 1.5 đ c t ng sinh trên môi tr ng MRS 37oC, 5% CO2, 24 gi .
i u ch nh d ch khu n v 108 t bƠo/ mL sau đó b sung 1mL d ch khu n vào 20
mL môi tr ng kh o (pH, nhi t đ theo k t qu m c 2.3.4.) trong kho ng th i gian (theo k t qu m c 2.3.3), 5% CO2.
Sau th i gian nuôi c y đo m t đ t bào L. plantarum NT 1.5 b ng ph ng pháp đo đ đ c b c sóng 610 nm.
Các th nghi m đ c l p l i 3 l n, k t qu đ c x lỦ th ng kê ANOVA m t y u t b ng ph n m m Statgraphics Plus 3.0 vƠ ph n m m Excel. K t qu đ c trình bƠy d i d ng trung bình ± sai s .
2.3.6. Thi t k thí nghi m tìm y u t nhă h ngă đ n quá trình lên men t ngăsinh kh i theo thi t k Plackett- Burman
SVTH: TR N TH KI U 31
M c đích
Xác đnh các y u t quan tr ng nh h ng chính đ n quá trình lên men thu sinh kh i c a ch ng vi khu n L. plantarum NT 1.5.
Thi t k thí nghi m Plackett – Burman
Thi t k thí nghi m theo ma tr n Plackett ậ Burman v i các y u t g m có: ngu n nit , cacbon vƠ các ngu n khoáng đư đ c ch n m c 2.4.
M i y u t đ c kh o sát 2 m c đ : m c đ cao (+1) và m c đ th p (-1). Thi t k đ c b trí d a theo ph ng pháp qui ho ch th c nghi m b ng ph n m m th ng kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA đ c tính các giá tr t-value, p- value và m c đ tin c y.
Th c hi n :
T ng sinh ch ng L. plantarum trên 20 mL môi tr ng MRS 37oC, 24-48 gi .
i u ch nh d ch khu n đ t giá tr OD610 có m t đ t bào kho ng 108 t bào/mL. B sung 1 mL d ch khu n vƠo 20 mL môi tr ng kh o sát.
Nuôi vi khu n nhi t đ kh o sát theo m c 2.3.4., 5% CO2. Sau th i gian nuôi c y d ch khu n đ c đo OD610đ xác đ nh m t đ t bào.
M i nghi m th c c a thí nghi m đ c th c hi n v i 3 l n l p l i.
K t qu
S li u k t qu thí nghi m đ c th ng kê b ng ph n m m Minitab 16.2.0
nh h ng c a các y u t đ n sinh kh i ch ng vi khu n đ c mô t qua
ph ng trình h i quy b c nh t:
iXi
Y 0
D a vào phân tích h i quy, n u m c Ủ ngh a đ t trên 95% (p < 0,05), thì y u t
đó đ c cho là có nh h ng chính đ n s t ng sinh kh i t bào và v i k t qu thu ti p t c th c hi n các thí nghi m ti p theo đ xác đnh giá tr t i u cho s gia t ng sinh
SVTH: TR N TH KI U 32
2.3.7. Thí nghi m kh iăđ u
Thi t k thí nghi m d ng đ y đ 22, có b sung thêm đi m thí nghi m trung tâm. M i y u t đ c kh o sát 3 c p đ : m c đ cao (+1) và m c đ th p (-1) và m c trung tâm (0). Thi t k đ c b trí d a theo ph ng pháp quy ho ch th c nghi m b ng ph n m m th ng kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA. Thí nghi m đ c l p l i 3 l n.
Ti n hành
T ng t m c 2.3.6
2.3.8. Tìm kho ng t iă uă c a các y u t nhă h ng chính b ngă ph ngăpháp leo d c pháp leo d c
2.3.8.1. Thi t k thí nghi m
N u k t qu c a b c kh i đ u cho th y có th mơ t hàm m c tiêu b ng m t hàm h i quy b c nh t, đi u đó ch ng t vùng thí nghi m kh o sát cịn xa vùng c c tr . Ti n hành các thí nghi m leo d c nh m xác đnh vùng c c tr . Các thông s cho
ph ng pháp nƠy đ c tính tốn thơng qua h s h i quy t ph ng trình h i quy c a thí nghi m kh i đ u.
T m c c s c a các y u t này và các h s h i quy, các b c chuy n đ ng s
đ c tính nh sau:
Ch n b c chuy n đ ng ng v i y u t có giá tr tuy t đ i c a h s h i qui l n nh t vƠ tính tốn các b c chuy n đ ng cịn l i b ng các cơng th c:
Trong đó:
: Kho ng bi n thiên.
: H s h i qui c a y u t x1. : B c chuy n đ ng c a y u t x1.
SVTH: TR N TH KI U 33
T k t qu tính tốn b c chuy n đ ng c a t ng y u t nh h ng, thí nghi m b t đ u t m c trung tâm c a các y u t nh h ng chính. (Nguy n V n D và cs., 2011)
2.3.8.2. Ti n hành
T ng t m c 2.3.6.
2.3.9. Thí nghi m b m t ch tiêuăxácăđ nh giá tr t iă uăc a các y u t nh h ng chính. h ng chính.
T k t qu thí nghiêm leo d c, ti n hành thi t k thí nghi m Box-Behnken đ tìm giá tr t i u c a các y u t nh h ng chính.
2.3.9.1. Thi t k thí nghi m
M i y u t đ c kh o sát 3 m c đ : m c đ cao (+1), m c đ th p (-1) và m c
đ trung tâm (0) d a theo k t qu m c 2.3.8.
Thi t k đ c b trí d a theo ph ng pháp quy ho ch th c nghi m b ng ph n