CH NGă2 :ăV T LI UăVẨăPH NGăPHÁPăNGHIểNă CU
2.3.5. Sàng lc các y ut dinhăd ng
2.3.5.1. Ngu n nit
Các ngu n nit đ c kh o sát lƠ: b t b p, b t đ u nƠnh, pepton, (NH4)2SO4, urê v i n ng đ kh o sát đ c th hi n trong b ng 2.1. (Han và cs., 2011; Altaf và cs., 2006)
SVTH: TR N TH KI U 29 ThƠnhăph n N ngăđ (g/L) Pepton 10 B tăb p 15 B tăđ uănƠnh 8 (NH4)2SO4 5 H2NCONH2 3
Môi tr ng ch n l c ngu n Nit t i u g m có ngu n nit c n kh o sát, glucose 20 g/L vƠ các thƠnh ph n cịn l i c a mơi tr ng MRS nh : tween 80, K2HPO4, CH3CO2Na, MgSO4.7H2O, MnSO4.H2O.
2.3.5.2. Ngu n cacbon
Các ngu n cacbon đ c kh o sát là: succrose, maltose, lactose, glucose, m t r
đ ng, b t b p v i kh i l ng kh o sát đ c trình bày trong b ng 2.2. (Altaf và cs., 2006; Farooq và cs., 2012; Han và cs., 2011; Magdalena và cs., 2010)
B ng 2.2. Các ngu n cacbon kh o sát
ThƠnhăph n Kh iăl ngă(g/L)
B tăb p 30 Glucose 20 Maltose 20 Succrose 20 M tăr ăđ ng 40 Lactose 20
Môi tr ng ch n l c ngu n cacbon t i u g m có ngu n nit t i u, ngu n cacbon c n kh o sát và các thành ph n cịn l i c a mơi tr ng MRS: tween 80, MgSO4, K2HPO4, CH3COONa, MnSO4.
SVTH: TR N TH KI U 30
Kh o sát các ngu n khoáng: CaCl2, NaCl, CaCO3, MgSO4.7H2O, K2HPO4, KH2PO4 v i kh i l ng đ c trình bày trong b ng 2.3.(Han và cs., 2011; Altaf và cs., 2006)
B ng 2.3. Các ngu n khoáng kh o sát
ThƠnhăph n Kh iăl ngă(g/L)
K2HPO4 0.5 KH2PO4 0.5 CaCO3 0.5 NaCl 0.5 CaCl2 0.5 MgSO4.7H2O 0.5
Môi tr ng ch n l c ngu n khoáng t i u bao g m ngu n nit t i u (10 g/L),
ngu n cacbon t i u (20 g/L), và ngu n khoáng c n kh o sát.
Ti n hành
Ch ng L. plantarum NT 1.5 đ c t ng sinh trên môi tr ng MRS 37oC, 5% CO2, 24 gi .
i u ch nh d ch khu n v 108 t bƠo/ mL sau đó b sung 1mL d ch khu n vào 20
mL môi tr ng kh o (pH, nhi t đ theo k t qu m c 2.3.4.) trong kho ng th i gian (theo k t qu m c 2.3.3), 5% CO2.
Sau th i gian nuôi c y đo m t đ t bào L. plantarum NT 1.5 b ng ph ng pháp đo đ đ c b c sóng 610 nm.
Các th nghi m đ c l p l i 3 l n, k t qu đ c x lỦ th ng kê ANOVA m t y u t b ng ph n m m Statgraphics Plus 3.0 vƠ ph n m m Excel. K t qu đ c trình bƠy d i d ng trung bình ± sai s .
2.3.6. Thi t k thí nghi m tìm y u t nhă h ngă đ n quá trình lên men t ngăsinh kh i theo thi t k Plackett- Burman
SVTH: TR N TH KI U 31
M c đích
Xác đnh các y u t quan tr ng nh h ng chính đ n quá trình lên men thu sinh kh i c a ch ng vi khu n L. plantarum NT 1.5.
Thi t k thí nghi m Plackett – Burman
Thi t k thí nghi m theo ma tr n Plackett ậ Burman v i các y u t g m có: ngu n nit , cacbon vƠ các ngu n khoáng đư đ c ch n m c 2.4.
M i y u t đ c kh o sát 2 m c đ : m c đ cao (+1) và m c đ th p (-1). Thi t k đ c b trí d a theo ph ng pháp qui ho ch th c nghi m b ng ph n m m th ng kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA đ c tính các giá tr t-value, p- value và m c đ tin c y.
Th c hi n :
T ng sinh ch ng L. plantarum trên 20 mL môi tr ng MRS 37oC, 24-48 gi .
i u ch nh d ch khu n đ t giá tr OD610 có m t đ t bào kho ng 108 t bào/mL. B sung 1 mL d ch khu n vƠo 20 mL môi tr ng kh o sát.
Nuôi vi khu n nhi t đ kh o sát theo m c 2.3.4., 5% CO2. Sau th i gian nuôi c y d ch khu n đ c đo OD610đ xác đ nh m t đ t bào.
M i nghi m th c c a thí nghi m đ c th c hi n v i 3 l n l p l i.
K t qu
S li u k t qu thí nghi m đ c th ng kê b ng ph n m m Minitab 16.2.0
nh h ng c a các y u t đ n sinh kh i ch ng vi khu n đ c mô t qua
ph ng trình h i quy b c nh t:
iXi
Y 0
D a vào phân tích h i quy, n u m c Ủ ngh a đ t trên 95% (p < 0,05), thì y u t
đó đ c cho là có nh h ng chính đ n s t ng sinh kh i t bào và v i k t qu thu ti p t c th c hi n các thí nghi m ti p theo đ xác đnh giá tr t i u cho s gia t ng sinh
SVTH: TR N TH KI U 32
2.3.7. Thí nghi m kh iăđ u
Thi t k thí nghi m d ng đ y đ 22, có b sung thêm đi m thí nghi m trung tâm. M i y u t đ c kh o sát 3 c p đ : m c đ cao (+1) và m c đ th p (-1) và m c trung tâm (0). Thi t k đ c b trí d a theo ph ng pháp quy ho ch th c nghi m b ng ph n m m th ng kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA. Thí nghi m đ c l p l i 3 l n.
Ti n hành
T ng t m c 2.3.6
2.3.8. Tìm kho ng t iă uă c a các y u t nhă h ng chính b ngă ph ngăpháp leo d c pháp leo d c
2.3.8.1. Thi t k thí nghi m
N u k t qu c a b c kh i đ u cho th y có th mơ t hàm m c tiêu b ng m t hàm h i quy b c nh t, đi u đó ch ng t vùng thí nghi m kh o sát cịn xa vùng c c tr . Ti n hành các thí nghi m leo d c nh m xác đnh vùng c c tr . Các thông s cho
ph ng pháp nƠy đ c tính tốn thơng qua h s h i quy t ph ng trình h i quy c a thí nghi m kh i đ u.
T m c c s c a các y u t này và các h s h i quy, các b c chuy n đ ng s
đ c tính nh sau:
Ch n b c chuy n đ ng ng v i y u t có giá tr tuy t đ i c a h s h i qui l n nh t vƠ tính tốn các b c chuy n đ ng cịn l i b ng các cơng th c:
Trong đó:
: Kho ng bi n thiên.
: H s h i qui c a y u t x1. : B c chuy n đ ng c a y u t x1.
SVTH: TR N TH KI U 33
T k t qu tính tốn b c chuy n đ ng c a t ng y u t nh h ng, thí nghi m b t đ u t m c trung tâm c a các y u t nh h ng chính. (Nguy n V n D và cs., 2011)
2.3.8.2. Ti n hành
T ng t m c 2.3.6.
2.3.9. Thí nghi m b m t ch tiêuăxácăđ nh giá tr t iă uăc a các y u t nh h ng chính. h ng chính.
T k t qu thí nghiêm leo d c, ti n hành thi t k thí nghi m Box-Behnken đ tìm giá tr t i u c a các y u t nh h ng chính.
2.3.9.1. Thi t k thí nghi m
M i y u t đ c kh o sát 3 m c đ : m c đ cao (+1), m c đ th p (-1) và m c
đ trung tâm (0) d a theo k t qu m c 2.3.8.
Thi t k đ c b trí d a theo ph ng pháp quy ho ch th c nghi m b ng ph n m m th ng kê Minitab 16.2.0 c a Minitab Inc., USA.
2.3.9.2. Ti n hành
T ng t m c 2.3.6.
2.3.10. Xácăđ nh th iăgianăt ngătr ng c a ch ng L. plantarum NT1.5 trên môiătr ng t iă u môiătr ng t iă u
Sau khi xác đ nh đ c môi tr ng vƠ đi u ki n nuôi c y t i u cho sinh kh i cao nh t chúng tôi ti n hành ki m đ nh k t qu và kh o sát l i th i gian t ng tr ng t i u
nh t c a ch ng vi khu n trên môi t ng kh o sát nhi t đ theo m c 2.3.4, 5% CO2.
SVTH: TR N TH KI U 34
CH NGă3:
K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N
SVTH: TR N TH KI U 35
3.1 K T QU XÂY D NG NGăT NGăQUANăGI A M T
T BÀO VI KHU N VÀ GIÁ TR OD610
có đ c đ ng t ng quan tuy n tính gi a OD610 và m t đ t bào
Lactobacillus plantarum NT 1.5 trên môi tr ng MRS, chúng tôi ti n xác đ nh m t
đ vi khu n nh ng giá tr đo OD610 t ng ng. K t qu xây d ng đ ng t ng
quan gi a m t đ t bào vi khu n và giá tr OD610 đ c trình bày trong b ng 3.1 và
đ th 3.1.
B ng 3.1: Giá tr đoăOD610 và m tăđ t bào (Log(N/mL)
OD610nm 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 S khu n l c bình quân (CFU/ mL) 7,2.10 6 1,31.107 1,98.107 2,5.107 3,3.107 Log (N/ mL) 6,857 7,117 7,297 7,398 7,519
th 3.1.ă ngăt ngăquanătuy n tính gi a OD610 và m tăđ t bào Lactobacillus plantarum NT 1.5 trênămơiătr ng MRS
Qua kh o sát q trình ni c y c a ch ng L. plantarum NT 1.5 trong 24 gi
đ c trình bày trên b ng và bi u đ chúng tôi nh n th y r ng m t đ t bào c a vi khu n L. plantarum NT1.5 trong huy n phù t bƠo t ng quan tuy n tính v i các
y = 1.603x + 6.7566 R² = 0.9617 6.800 6.900 7.000 7.100 7.200 7.300 7.400 7.500 7.600 0 0.2 0.4 0.6 lo g (N/m L) Giáătr ăOD610 log(N/mL)
SVTH: TR N TH KI U 36
giá tr OD610nm t 0,1 ậ0,5 theo ph ng trình y = 1,603x + 6,7566 v i m c đ tin c y 96,17%.
3.2 K T QU XÂY D NGă NGăCONGăT NGăTR NG C A
L. PLANTARUM NT 1.5
D a vào k t qu xây d ng đ ng t ng quan gi a m t đ t bào vi khu n và giá tr OD610 chúng tôi ti n hành xây d ng đ ng cong t ng tr ng tr ng c a ch ng Lactobacillus plantarum NT1.5. S t ng tr ng c a ch ng Lactobacillus plantarum NT1.5 đ c theo dõi t i các th i đi m kh o sát b ng cách đo OD610 theo nh ng m c th i gian nuôi c y. K t qu đ c trình bày trong b ng 3.2 và đ th 3.2.
B ng 3.2. Giá tr OD610 theo th i gian
Th iăgiană(gi ) Giáătr ăOD610 Log (N/mL) 0 0,023 ± 0,001 6,800 3 0,145 ± 0,000 6,990 6 0,369 ± 0,000 7349 9 0,625 ± 0,000 7,758 12 1,556 ± 0,003 9,250 15 1,944 ± 0,000 9,873 18 2,111 ± 0,000 10,141 21 2,084 ± 0,000 10,097 24 2,078 ± 0,000 10,088 27 2,070 ± 0,000 10,075 30 2,049 ± 0,000 10,041 33 2,036 ± 0,000 10,021 36 2,035 ± 0,000 10,019 39 2,013 ± 0,000 9,983
SVTH: TR N TH KI U 37 42 1,994 ± 0,000 9,952 45 1,993 ± 0,000 9,954 48 1,988 ± 0,000 9,944 51 1,971 ± 0,000 9,916 54 1,967 ± 0,000 9,910 57 1,935 ± 0,002 9,859 60 1,848 ± 0,000 9,719 63 1,806 ± 0,005 9,652 66 1,703 ± 0,000 9,486 69 1,615 ± 0,000 9,345 72 1,470 ± 0,016 9,114
th 3.2.ă ngăcongăt ngătr ng c a L. plantarum NT 1.5 theo th i gian trênămôiătr ng MRS
D a vào b ng k t qu giá tr OD (b ng 3.2) và đ th đ ng cong t ng tr ng c a L. plantarum NT 1.5 trên môi tr ng MRS (đ th 3.2) chúng tôi nh n th y r ng th i gian t 0 gi đ n 6 gi là th i gian vi khu n b c vào pha ti m tàng (pha Lag) th i gian này vi khu n t ng sinh r t ít (log có giá tr t 6,800 đ n 7,349). T 6 gi
đ n 18 gi vi khu n t ng sinh m nh nh t (log có giá tr t 7,349 đ n 10,141) đơy lƠ 0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 0h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 27h 30h 33h 36h 39h 42h 45h 48h 51h 54h 57h 60h 63h 66h 69h 72h Lo g (N / m L)
SVTH: TR N TH KI U 38
th i gian thu đ c nhi u sinh kh i vi khu n nh t. Vi khu n b c vào pha cân b ng trong th i gian 18 đ n 60 gi (log có giá tr t 10,141 đ n 9,719). Sau 60 gi vi khu n r i vƠo pha suy tƠn.
T k t qu trên chúng tôi ch n 18 gi (log = 10,141 N/ mL) là th i gian thích h p nh t đ thu nh n sinh kh i c a L. plantarum NT 1.5.
3.3 K T QU KH O SÁT NHI Tă , pH THÍCH H P CHO S
T NGăTR NG C A L. PLANTARUM NT1.5.
T k t qu xây d ng đ ng t ng quan gi a m t đ t bào vi khu n và giá tr
OD610, đ ng cong t ng tr ng tr ng ch ng Lactobacillus plantarum NT 1.5,
chúng tôi ti n hành kh o sát nh h ng c a nhi t đ nuôi c y và pH môi tr ng đ n s t ngtr ng c a L. plantarum NT1.5. K t qu đ c th hi n b ng giá tr Log (N/ mL) c a m i nhi t đ t i pH t ng ng.
K t qu kh o sát đ c trình bày trong b ng 3.3 vƠ đ th 3.3.
B ng 3.3. M tăđ t bào Lactobacillus plantarum NT1.5 (Log (N/ mL)) t i m i giá tr nhi tăđ vƠăđ pH kh o sát m i giá tr nhi tăđ vƠăđ pH kh o sát
pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8
30oC 7,605± 0,027 8,724± 0,174 9,782± 0,034 9,990 ± 0,025 9,352± 0,129
37oC 8,588± 0,167 9,389± 0,136 9,942± 0,020 10,011 ± 0,014 9,677± 0,007
SVTH: TR N TH KI U 39
th 3.3. nhăh ng c a nhi tăđ vƠăđ pH lên s t ngătr ng c a Lactobacillus plantarum NT1.5
D a vào b ng 3.3 và đ th 3.3 chúng tôi th y r ng t i pH=4 và 40oC
Lactobacillus plantarum NT1.5 t ng tr ng th p nh t (Log =7,605±0,027) và cao nh t 37oC và pH 7 (log (N/mL) = 10,011 ± 0,001). Nh v y chúng tôi ch n pH=7 và nhi t đ 37oC lƠ đi u ki n ni c y thích h p cho L.pantarum NT1.5 cho các thí nghi m ti p theo.
3.4 K T QU SÀNG L C Y U T DINHăD NG
T nh ng k t qu có đ c các thí nghi m tr c (xây d ng đ ng t ng
quan gi a m t đ t bào vi khu n và giá tr OD610, đ ng cong t ng tr ng tr ng , k t qu kh o sát nh h ng c a nhi t đ vƠ pH đ n s t ng tr ng c a L.
plantarum), chúng tôi ti n đ n b c sàng l c các y u t dinh d ng nh h ng đ n s sinh tr ng c a ch ng L. plantarum. Các ngu n dinh d ng kh o sát g m có:
ngu n nit , ngu n cacbon, ngu n khoáng.
3.4.1. Ngu n nit
Chúng tôi ti n hành kh o sát các ngu n nit : pepton, b t đ u nành, b t b p, (NH4)2SO4, Urê v i khói l ng m i ngu n đ c th hi n trong b ng 2.1 (m c 2.3.5.1). 0 2 4 6 8 10 12 pH = 4 pH = 5 pH = 6 pH = 7 pH = 8 Lo g (N / m L) 30oC 37oC 40oC
SVTH: TR N TH KI U 40
nh h ng c a các ngu n nit kh o sát đ n sinh tr ng c a L. plantarum NT1.5 đ c xác đ nh thông qua giá tr Log (N/ mL). K t qu thí nghi m đ c th hi n trong b ng 3.4 vƠ đ th 3.4.
B ng 3.4. Giá tr log (N/ mL) c a các ngu n nit kh o sát Ngu năNit Log (N/ mL) M tăđ ă(CFU/ămL)
B tăb p 7,193 ± 0,051c 1,5.107 Pepton 8,721 ± 0,164a 5,2.108 B tăđ uănƠnh 7,644 ± 0,164b 4,4.107 (NH4)2SO4 7,265 ± 0,021c 1,107 Urê 7,381 ± 0,012c 1.8.107 Trong cùng m t c t các ch s có cùng m u t khơng có s khác bi t m c ý ngh a 5% qua phép th Duncan. th 3.4. K t qu kh o sát ngu n nit
Theo k t qu thí nghi m b ng 3.4 và bi u đ 3.4 chúng tôi nh n th y r ng:
Gi a các s li u có s khác bi t Ủ ngh a v i đ tin c y p < 0,05 (ph l c 2). Trong các ngu n nit (h u c vƠ vơ c ) thì ngu n nit h u c nh h ng đ n m t đ vi khu n cao h n các ngu n nit vô c . Pepton cho m t đ vi khu n cao nh t (Log (N/ mL) = 8,721 ± 0,081), th p nh t là b t b p (Log (N/ mL) = 7,193 ± 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
bot bap pepton b t đ u nƠnh (NH4)2SO4 URE
Lo g (M / m L)
SVTH: TR N TH KI U 41
0,008. Vì v y, pepton đ c ch n là ngu n nit t t nh t cho s n xu t sinh kh i c a
L. plantarum NT1.5.
3.4.2. Ngu n cacbon
T k t qu m c 3.4.1 chúng tôi ti p t c kh o sát các ngu n cacbon. Môi
tr ng kh o sát g m có pepton, các ngu n khoáng c a môi tr ng MRS và các ngu n cacbon c n kh o sat.
Các ngu n cacbon c n kh o sát là: succrose, maltose, glucose, lactose, m t r đ ng, b t b p v i kh i l ng m i ngu n đ c trình bƠy trong b ng 2.2 (m c
2.5.3.2).
nh h ng c a các ngu n cacbon kh o sát đ n s sinh tr ng c a L.plantarun NT1.5 đ c xác đnh thông qua giá tr Log (N/ mL). K t qu thí nghi m đ c trình bày trong b ng 3.5 và bi u đ 3.5.
B ng 3.5. Giá tr log (N/ mL) c a các ngu n cacbon kh o sát
Ngu năCacbon Log (N/ mL) M tăđ ă(CFU/ămL)
Succrose 8,586 ± 0,057c 3,9.108 Maltose 9,519 ± 0,007a 3,0.109 Glucose 9,155 ± 0,014b 10,5.109 Lactose 7,198 ± 0,020d 1,6.107