Tuyển chọn mọt số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao thuộc chi streptomyces

Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TUYỂN CHỌN CÓ HOẠT TÍNH CAO STREPTOMYCES , 8 - 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TUYỂN CHỌN CÓ HOẠT TÍNH CAO STREPTOMYCES : 60 42 01 14 , 8 - 2013 Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 CHỮ KÝ CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh XÁC NHẬN CỦA KHOA Công Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Chất kháng sinh là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ các hoạt động sống của các sinh vật, nó có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc đối với vi sinh vật ngay cả nồng độ thấp. Việc nghiên cứu sản xuất và sử dụng có hiệu quả nhiều loại kháng sinh có ý nghĩa rất lớn đối với y học nói riêng và sản xuất nói chung. Trong y học, chất kháng sinh đã được sử dụng để cứu hàng triệu người khỏi các bệnh nhiễm trùng. Trong nông nghiệp, chất kháng sinh được sử dụng để chữa bệnh làm tăng trọng cho vật nuôi và phòng trừ dịch bệnh cho cây trồng. Vì vậy, vai trò của chất kháng sinh là vô cùng to lớn với đời sống con người. t kháng sinh đã được mô tả, Streptomyces. , một mặt cải biến các chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác thúc đẩy nghiên cứu để tìm ra các chất kháng sinh mới. Việt Nam là nước nông Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2 : “Tuyển ch Streptomyces” 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, chọn 01 chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất kháng vi khuẩn gây bệnh trên người. 3. Nội dung nghiên cứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao. - Phân loại 01 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng cao nhất kháng vi khuẩn gây bệnh trên người bằng phương pháp truyền thống và sinh học phân tử. - Nghiên cứu điều kiện lên men chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn được chọn. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1. Đặc điểm hình thái và phân loại xạ khuẩn * Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Theo Nguyễn Lân Dũng và đtg (2008), tế bào xạ khuẩn (XK) có dạng sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn ngang. Hệ sợi của XK chia ra thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất (KTCC) cắm sâu vào môi trường, có chức năng chủ yếu là dinh dưỡng và làm giá thể. Đường kính KTCC thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngăn và không bị đứt đoạn. Khuẩn ty khí sinh (KTKS) của XK phát triển ra bên ngoài không khí, trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc XK. Khuẩn lạc XK dạng hình tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm. Khuẩn lạc của XK không trơn ướt như khuẩn lạc của vi khuẩn, nấm men mà có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên là XK. Dùng que cấy không di được khuẩn lạc của XK vì KTCC bám sâu vào trong thạch. Khuẩn lạc XK có thể mang các màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…[4]. * Đặc điểm phân loại xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Hầu hết XK thuộc nhóm Gram dương, hiếu khí và sống hoại sinh. XK có khả năng sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như các chất kháng sinh và enzyme, do đó chúng đóng vai trò to lớn trong nghiên cứu khoa học, y học và công nghiệp [4]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 Sự tồn tại của XK được thừa nhận và biết đến hơn một trăm năm nay. Ban đầu, xạ khuẩn được xem là một nhóm VSV vì chúng có nhiều đặc điểm tương đồng với cả vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, việc xác định được thành phần hóa học và cấu trúc của XK từ những năm 1950 đã xác nhận XK thuộc nhóm Prokaryote. Trong số 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố thì có khoảng 100 chi và 1000 loài XK. Mặc dù XK thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và hình thành nhiều bào tử. Ngày nay, XK được xếp vào bộ Actinomycetales theo hệ thống phân loại của Bergey hoặc Actinomycetes theo hệ thống phân loại của Kracinhicop, gồm 10 dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài. Hiện nay, 478 loài xạ khuẩn đã được công bố thuộc chi Streptomyces, hơn 500 loài thuộc các chi còn lại và được xếp vào nhóm XK hiếm. Hình thái luôn là đặc điểm chung để nhận dạng và định danh XK [50],[53]. 1.1.2. Cấu tạo tế bào và sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn * Cấu tạo tế bào của xạ khuẩn Xạ khuẩn là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của XK có dạng lưới, dày 10 - 20nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipid và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Nguyên sinh chất và nhân tế bào XK có điểm khác biệt so với các sinh vật Prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45%. Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt poliphotphate, các hạt polisaccarid [2],[4]. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 5 * Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử của XK có dạng thẳng hoặc lượn sóng, dạng xoắn lò xo hay xoắn ốc. Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo hai cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Bào tử của XK được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 400 A 0 chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH… [2]. 1.1.3. Đặc điểm bộ gen và tính bất ổn định di truyền của xạ khuẩn Do các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces chiếm phổ biến nên các nghiên cứu về XK chủ yếu là nghiên cứu trên các loài thuộc chi Streptomyces. Kết quả nghiên cứu dưới kính hiển vi điện tử và quang học cho thấy các chủng xạ khuẩn chi Streptomyces có DNA ở dạng đậm đặc, có nhiều bản sao trong tế bào hệ sợi, nhưng thường chỉ có một bản sao trong bào tử. Kích thước bộ gen điển hình ở Streptomyces thường từ 5 - 7Mb, có khi lên đến 8Mb, có tỷ lệ G+C cao và thường chứa nhiều trình tự lặp lại. Các trình tự DNA lặp lại được tìm thấy với số lượng lớn trong Streptomyces sp, có kích thước khoảng từ 2,9 - 93Kb, có thể lên đến 500 bản sao, được cho là một trong các nguyên nhân gây ra sự bất ổn định về gen ở XK. Điểm thú vị ở các XK là tính bất ổn định về gen với tỷ lệ đột biến cao hơn 0,001. Đột biến xảy ra không những do bị xử lý bởi các tác nhân gây đột biến mà cũng có thể xảy ra khi chủng được bảo quản trong điều kiện lạnh. Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 6 Tính bất ổn định này có nguyên nhân từ sự tái sắp xếp lại nhiễm sắc thể, có thể do các trình tự lặp lại và cấu trúc DNA mạch thẳng ở XK với sự hiện diện của nhiều trình tự lặp lại ngược chiều (TIR: terminal inverted repeat) ở những vùng cụ thể trên nhiễm sắc thể được gọi là vùng không ổn định [32]. Tính bất ổn định của bộ gen của XK còn là hệ quả của đặc điểm phát triển hệ sợi với các tế bào nhiều nhân ở XK và sự tạo thành bào tử. Mặt khác, tỷ lệ G + C cao trong bộ gen, với các cụm GC nằm ngoài vùng mã hóa, hình thành nhiều trình tự lặp lại với tần suất cao là nguyên nhân của cấu hình DNA đặc biệt hình thành nền tảng cho việc tái tổ hợp dẫn đến sự mất đoạn hoặc tăng bản sao các trình tự lặp lại. Sự bất ổn định gen ảnh hưởng đến tất cả các mặt của sự phát triển Streptomycetes bao gồm quá trình chuyển hóa sơ cấp, quá trình biệt hóa nhưng tác động mạnh đến các tính trạng của quá trình trao đổi chất thứ cấp. Hiện tượng này khá phổ biến trong chi Streptomyces và tạo cho XK nhiều kiểu hình khác nhau. Mặc dù có tính bất ổn định bộ gen cao nhưng tế bào XK vẫn có thể chịu đựng những sự thay đổi to lớn do sự mất đồng thời một lượng lớn thông tin di truyền. Ở Streptomyces glaucescens, việc mất khoảng 800Kb DNA gen đã làm suy yếu khả năng sống của tế bào nhưng chủng này vẫn có thể phát triển được trên môi trường nghèo dinh dưỡng. Điều này chứng tỏ rằng chúng không mất bất kỳ các gen thiết yếu nào, vùng gen bị mất có thể chỉ liên quan đến quá trình trao đổi chất thứ cấp [44]. Nhiều loài XK có chứa plasmid mạch thẳng có kích thước lớn. Plasmid ở Streptomyces có kích thước rất đa dạng từ 4Kb đến 170Kb, gồm nhiều bản sao trên một nhiễm sắc thể, có lẽ liên quan đến việc kiểm soát các đặc điểm về kiểu hình như khả năng sinh sản, khả năng sinh kháng sinh và kháng kháng sinh, sự biệt hóa… Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 7 1.1.4. Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, rác thải, phân, lá cây, thảm mục và có nhiều trong đất, trung bình mỗi gam đất có khoảng trên 1 triệu XK [4]. Sự phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào độ pH của môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Số lượng XK trong đất cũng thay đổi theo độ sâu của các lớp đất. Càng xuống sâu thì số lượng tế bào XK càng giảm [50], [53]. 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN 1.2.1. Phương pháp phân loại truyền thống Hiện nay, có nhiều khóa phân loại khác nhau được đưa ra nhằm mục đích phân loại XK tới chi và loài ví dụ như khóa phân loại của Waksman (1916, 1919, 1961), của Craxinhicop (1949, 1970), của Flaig – Kutzner (1954, 1960), của Gause (1957), Bergey (1989) [30]. Đồng thời để thống nhất cách mô tả XK, chương trình XK quốc tế (ISP) đã đưa ra các phương pháp chung và môi trường chuẩn để phân loại nhóm VSV này. Đánh giá của ISP dựa trên các đặc điểm về hình thái, đặc điểm nuôi cấy, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của XK trên các môi trường ISP1 đến ISP9 [38]. Ngày nay, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của một số ngành như: Sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học những kiến thức về phân loại học XK đã có nhiều thay đổi. Do số lượng các loài xạ khuẩn được mô tả ngày càng nhiều nên để cho việc phân loại được nhanh và chính xác đến mức độ phân tử, ngoài các phương pháp phân loại truyền thống, người ta còn sử dụng kết hợp với các phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử. [...]... Streptomyces parvullus HT19.1 có hoạt tính kháng sinh cao kháng được một số chủng nấm gây bệnh trên chè phân lập tại Thái Nguyên 1.3 LƢỢNG KHÁNG SINH VÀ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN 1.3.1.Giới thiệu chung về chất kháng sinh Chất kháng sinh được hiểu là các chất hóa học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến là từ VSV) hoặc hóa học, với đặc tính là ngay ở nồng... Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces fradiae vào năm 1949, có tác dụng chống cả các vi khuẩn Gr (-) và Gr (+) Đặc biệt là chống được nhiều loài vi khuẩn đã kháng lại với Penixilin và Streptomycin [2] Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea, có phổ kháng sinh rộng, có tác dụng chống cả vi khuẩn Gr (+) như tụ cầu, phế cầu đã kháng lại Penixilin... hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [37] 1.3.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của XK là khả năng sinh Tổng hợp CKS Trong số, 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Khả năng kháng. .. http://www.lrc-tnu.edu.vn/ cầu khuẩn [5], [15] Novobicin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và Streptomyces niveus, có hoạt tính mạnh đối với vi khuẩn Gr (+) Đặc biệt có khả năng chống các tụ cầu đã kháng với penixilin và một số CKS khác [12] Vancomycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces orientaliss, được dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là các... cho khả năng sinh kháng sinh của các chủng Streptomyces T - 41, Streptomyces D - 42, Streptomyces TC – 54 [8] Năm 2008, Bùi Thị Hà đã công bố chủng Streptomyces R2 và Streptomyces Đ1 sinh kháng sinh mạnh nhất khi sử dụng nguồn cacbon là saccarose [7] Kết quả nghiên cứu của Đào Thị Lương và đtg (2005) cho thấy, nguồn cacbon là tinh bột lại thích hợp nhất cho chủng Streptomyces L30 sinh kháng sinh [17]... Gr (+) như tụ cầu, phế cầu đã kháng lại Penixilin và vi khuẩn Gr (-) như màng não cầu, lậu cầu Trong y học, chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do nhiễm P.seudomonas [2] Tetracyclin: Là các kháng sinh được tách chi t từ dịch nuôi cấy một số chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, các chất kháng sinh này có phổ kháng sinh rộng, chống được cả các vi khuẩn Gr (+), Gr (-), ricketsia và một vài loài vi rút... Chloramphenicol: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuelae, được phát hiện vào năm 1947, có hoạt tính chống lại được nhiều loài vi khuẩn Gr (+), Gr (-) [15] Erythromycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces erythreus, là chất kháng sinh có phổ rộng đối với các vi khuẩn Gram dương, được sử dụng nhiều nhất trong điều trị bệnh viêm phổi do mycoplasma và viêm họng do liên 26 Số hóa bởi trung tâm... sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK, trong đó có tới 1/3 các chất kháng sinh là do xạ khuẩn hiếm sinh ra Trong y học, kháng sinh có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh nhằm mang lại hiệu quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng sinh (khi kết hợp hai KS hãm khuẩn) hoặc hiệu quả cộng lực - tăng hiệu lực của CKS (khi kết hợp hai KS diệt khuẩn) [14] 25 Số hóa bởi trung tâm... khác nhau của tỉnh Thái Nguyên và các tỉnh lân cận được sử dụng và tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính kháng sinh *Vi sinh vật kiểm định Gồm 9 chủng VSV kiểm định, trong đó có 7 chủng vi khuẩn thuộc 2 nhóm vi khuẩn G (+) và vi khuẩn G (-) và 2 chủng nấm mốc (bảng 2.1) Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật kiểm định Vi sinh vật kiểm định Cơ quan cung cấp Staphylococcus aureus ATCC Viện Kiểm Nghiệm – Bộ Y tế... hoang dại thường có hoạt tính thấp, để đưa vào sản xuất cần phải tiến hành chọn lọc chủng, sử dụng các biện pháp gây đột biến, các kỹ thuật di truyền hiện đại để chủ động tạo ra được các chủng giống tốt Điều quan trọng là các chủng mới được tuyển chọn phải đảm bảo cho hiệu suất kháng sinh cao, an toàn và có hiệu quả về mặt kinh tế 1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH 1.4.1 Ảnh hưởng . chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, chọn 01 chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất kháng vi khuẩn gây bệnh trên người. 3. Nội dung nghiên cứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng. chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao. - Phân loại 01 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng cao nhất kháng vi khuẩn gây bệnh trên người bằng phương pháp truyền thống và sinh học phân. LƢỢNG KHÁNG SINH VÀ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN 1.3.1.Giới thiệu chung về chất kháng sinh Chất kháng sinh được hiểu là các chất hóa học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn