Tuyển chọn mọt số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao thuộc chi streptomyces

Số hóa trung tâm học liệu / ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TUYỂN CHỌN CÓ HOẠT TÍNH CAO STREPTOMYCES , - 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TUYỂN CHỌN CÓ HOẠT TÍNH CAO STREPTOMYCES : 60 42 01 14 , - 2013 Thái Nguyên, ngày CHỮ KÝ CỦA GIÁO VIÊN tháng năm 2013 XÁC NHẬN CỦA KHOA HƯỚNG DẪN PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Công Số hóa trung tâm học liệu / MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Chất kháng sinh hợp chất hữu có nguồn gốc từ hoạt động sống sinh vật, có khả ức chế tiêu diệt cách chọn lọc vi sinh vật nồng độ thấp Việc nghiên cứu sản xuất sử dụng có hiệu nhiều loại kháng sinh có ý nghĩa lớn y học nói riêng sản xuất nói chung Trong y học, chất kháng sinh sử dụng để cứu hàng triệu người khỏi bệnh nhiễm trùng Trong nông nghiệp, chất kháng sinh sử dụng để chữa bệnh làm tăng trọng cho vật nuôi phòng trừ dịch bệnh cho trồng Vì vậy, vai trò chất kháng sinh vô to lớn với đời sống người t kháng sinh mô tả, Streptomyces , mặt cải biến chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác thúc đẩy nghiên cứu để tìm chất kháng sinh Việt Nam nước nông Số hóa trung tâm học liệu / : “Tuyển ch Streptomyces” Mục tiêu nghiên cứu đề tài - Tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, chọn 01 chủng có hoạt tính kháng sinh cao kháng vi khuẩn gây bệnh người Nội dung nghiên cứu đề tài - Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao - Phân loại 01 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng cao kháng vi khuẩn gây bệnh người phương pháp truyền thống sinh học phân tử - Nghiên cứu điều kiện lên men chất kháng sinh chủng xạ khuẩn chọn Số hóa trung tâm học liệu / Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1 Đặc điểm hình thái phân loại xạ khuẩn * Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Theo Nguyễn Lân Dũng đtg (2008), tế bào xạ khuẩn (XK) có dạng sợi phát triển, phân nhánh mạnh vách ngăn ngang Hệ sợi XK chia thành khuẩn ty chất khuẩn ty khí sinh Khuẩn ty chất (KTCC) cắm sâu vào môi trường, có chức chủ yếu dinh dưỡng làm giá thể Đường kính KTCC thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty vách ngăn không bị đứt đoạn Khuẩn ty khí sinh (KTKS) XK phát triển bên không khí, bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc XK Khuẩn lạc XK dạng hình tròn khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm Khuẩn lạc XK không trơn ướt khuẩn lạc vi khuẩn, nấm men mà có dạng thô ráp, dạng phấn, không suốt, có nếp tỏa theo hình phóng xạ có tên XK Dùng que cấy không di khuẩn lạc XK KTCC bám sâu vào thạch Khuẩn lạc XK mang màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…[4] * Đặc điểm phân loại xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Hầu hết XK thuộc nhóm Gram dương, hiếu khí sống hoại sinh XK có khả sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng chất kháng sinh enzyme, chúng đóng vai trò to lớn nghiên cứu khoa học, y học công nghiệp [4] Số hóa trung tâm học liệu / Sự tồn XK thừa nhận biết đến trăm năm Ban đầu, xạ khuẩn xem nhóm VSV chúng có nhiều đặc điểm tương đồng với vi khuẩn nấm mốc Tuy nhiên, việc xác định thành phần hóa học cấu trúc XK từ năm 1950 xác nhận XK thuộc nhóm Prokaryote Trong số 1000 chi 5000 loài sinh vật nhân sơ công bố có khoảng 100 chi 1000 loài XK Mặc dù XK thuộc nhóm sinh vật nhân sơ chúng thường sinh trưởng dạng sợi hình thành nhiều bào tử Ngày nay, XK xếp vào Actinomycetales theo hệ thống phân loại Bergey Actinomycetes theo hệ thống phân loại Kracinhicop, gồm 10 bộ, 35 họ, 110 chi 1000 loài Hiện nay, 478 loài xạ khuẩn công bố thuộc chi Streptomyces, 500 loài thuộc chi lại xếp vào nhóm XK Hình thái đặc điểm chung để nhận dạng định danh XK [50],[53] 1.1.2 Cấu tạo tế bào hình thành bào tử xạ khuẩn * Cấu tạo tế bào xạ khuẩn Xạ khuẩn tế bào bao gồm thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân thể ẩn nhập Thành tế bào XK có dạng lưới, dày 10 - 20nm có tác dụng trì hình dáng khuẩn ty, bảo vệ tế bào Dưới lớp thành tế bào màng sinh chất dày khoảng 50nm cấu tạo chủ yếu thành phần photpholipid protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trình trao đổi chất trình hình thành bào tử xạ khuẩn Nguyên sinh chất nhân tế bào XK có điểm khác biệt so với sinh vật Prokaryote chỗ chúng có tỷ lệ G + C cao DNA, thường lớn 55%, vi khuẩn tỷ lệ 25 - 45% Các vật thể ẩn nhập tế bào chất xạ khuẩn gồm có hạt poliphotphate, hạt polisaccarid [2],[4] Số hóa trung tâm học liệu / * Sự hình thành bào tử xạ khuẩn Bào tử XK hình thành nhánh phân hóa khuẩn ty khí sinh - gọi cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử XK có dạng thẳng lượn sóng, dạng xoắn lò xo hay xoắn ốc Bào tử hình thành đồng thời tất chiều dài cuống sinh bào tử theo hai cách: kết đoạn hay cắt khúc thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn xù xì, có gai gai phát triển dài thành dạng lông Hình thái, cuống sinh bào tử bào tử đặc điểm quan trọng phân loại xạ khuẩn Bào tử XK bao bọc màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 400 A0 chia lớp Các lớp tránh cho bào tử khỏi tác động bất lợi điều kiện ngoại cảnh nhiệt độ, pH… [2] 1.1.3 Đặc điểm gen tính bất ổn định di truyền xạ khuẩn Do loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces chiếm phổ biến nên nghiên cứu XK chủ yếu nghiên cứu loài thuộc chi Streptomyces Kết nghiên cứu kính hiển vi điện tử quang học cho thấy chủng xạ khuẩn chi Streptomyces có DNA dạng đậm đặc, có nhiều tế bào hệ sợi, thường có bào tử Kích thước gen điển hình Streptomyces thường từ - 7Mb, có lên đến 8Mb, có tỷ lệ G+C cao thường chứa nhiều trình tự lặp lại Các trình tự DNA lặp lại tìm thấy với số lượng lớn Streptomyces sp, có kích thước khoảng từ 2,9 - 93Kb, lên đến 500 sao, cho nguyên nhân gây bất ổn định gen XK Điểm thú vị XK tính bất ổn định gen với tỷ lệ đột biến cao 0,001 Đột biến xảy bị xử lý tác nhân gây đột biến mà xảy chủng bảo quản điều kiện lạnh Số hóa trung tâm học liệu / Tính bất ổn định có nguyên nhân từ tái xếp lại nhiễm sắc thể, trình tự lặp lại cấu trúc DNA mạch thẳng XK với diện nhiều trình tự lặp lại ngược chiều (TIR: terminal inverted repeat) vùng cụ thể nhiễm sắc thể gọi vùng không ổn định [32] Tính bất ổn định gen XK hệ đặc điểm phát triển hệ sợi với tế bào nhiều nhân XK tạo thành bào tử Mặt khác, tỷ lệ G + C cao gen, với cụm GC nằm vùng mã hóa, hình thành nhiều trình tự lặp lại với tần suất cao nguyên nhân cấu hình DNA đặc biệt hình thành tảng cho việc tái tổ hợp dẫn đến đoạn tăng trình tự lặp lại Sự bất ổn định gen ảnh hưởng đến tất mặt phát triển Streptomycetes bao gồm trình chuyển hóa sơ cấp, trình biệt hóa tác động mạnh đến tính trạng trình trao đổi chất thứ cấp Hiện tượng phổ biến chi Streptomyces tạo cho XK nhiều kiểu hình khác Mặc dù có tính bất ổn định gen cao tế bào XK chịu đựng thay đổi to lớn đồng thời lượng lớn thông tin di truyền Ở Streptomyces glaucescens, việc khoảng 800Kb DNA gen làm suy yếu khả sống tế bào chủng phát triển môi trường nghèo dinh dưỡng Điều chứng tỏ chúng không gen thiết yếu nào, vùng gen bị liên quan đến trình trao đổi chất thứ cấp [44] Nhiều loài XK có chứa plasmid mạch thẳng có kích thước lớn Plasmid Streptomyces có kích thước đa dạng từ 4Kb đến 170Kb, gồm nhiều nhiễm sắc thể, có lẽ liên quan đến việc kiểm soát đặc điểm kiểu khả sinh sản, khả sinh kháng sinh kháng kháng sinh, biệt hóa… Số hóa trung tâm học liệu / 1.1.4 Sự phân bố xạ khuẩn tự nhiên Xạ khuẩn phân bố rộng rãi tự nhiên: đất, nước, rác thải, phân, cây, thảm mục có nhiều đất, trung bình gam đất có khoảng triệu XK [4] Sự phân bố XK phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu axit yếu 6,8 7,5 Số lượng XK đất thay đổi theo độ sâu lớp đất Càng xuống sâu số lượng tế bào XK giảm [50], [53] 1.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN 1.2.1 Phương pháp phân loại truyền thống Hiện nay, có nhiều khóa phân loại khác đưa nhằm mục đích phân loại XK tới chi loài ví dụ khóa phân loại Waksman (1916, 1919, 1961), Craxinhicop (1949, 1970), Flaig – Kutzner (1954, 1960), Gause (1957), Bergey (1989) [30] Đồng thời để thống cách mô tả XK, chương trình XK quốc tế (ISP) đưa phương pháp chung môi trường chuẩn để phân loại nhóm VSV Đánh giá ISP dựa đặc điểm hình thái, đặc điểm nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, sinh hóa XK môi trường ISP1 đến ISP9 [38] Ngày nay, nhờ phát triển mạnh mẽ số ngành như: Sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học kiến thức phân loại học XK có nhiều thay đổi Do số lượng loài xạ khuẩn mô tả ngày nhiều nên việc phân loại nhanh xác đến mức độ phân tử, phương pháp phân loại truyền thống, người ta sử dụng kết hợp với phương pháp phân loại sinh học phân tử Số hóa trung tâm học liệu / * Phân loại theo đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy Đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy tiêu quan trọng sử dụng phân loại XK Hầu hết chi XK mô tả phân loại theo đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy như: Màu sắc hệ KTKS, KTCC, màu sắc sắc tố tan, hình dạng kết cấu bề mặt bào tử, hình dạng CSBT, phân đốt khuẩn ty Tuy nhiên, VSV khác, XK không bền vững mặt di truyền, thường xuyên xẩy xếp lại phân tử DNA Trong loài biểu khác hình thái hay loài khác giồng hình thái Vì vậy, để phân loại xác, ngày người ta phải bổ sung thêm tiêu khác đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch hay sinh học phân tử * Phân loại theo đặc điểm phân loại Đây phương pháp có hiệu thông qua việc định tính định lượng thành phần hóa học tế bào VSV Trong việc phân tích cấu trúc mạch tetrapeptide peptydoglycan xem tiêu chuẩn hóa phân loại thiết yếu cho nhóm vi khuẩn G (+), có XK Các đồng phân diaminopimelic (DAP) thành phần peptydoglycan axit amin có ý nghĩa quan trọng phương pháp phân loại *Phân loại theo đặc điểm sinh lý - sinh hóa Người ta nuôi cấy chủng XK cần định loại môi trường dinh dưỡng khác điều kiện nhiệt độ thời gian định để nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chúng Một số đặc điểm sinh lý sinh hóa sử dụng như: khả đồng hóa nguồn cacbon nitơ, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả chịu muối yếu tố khác môi trường, tính chất đối kháng nhạy cảm với CKS, khả tạo thành CKS sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác XK [26] [...]... điểm sinh lý - sinh hóa Người ta có thể nuôi cấy các chủng XK cần định loại trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định để nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng Một số đặc điểm sinh lý sinh hóa được sử dụng như: khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, tính. .. của khuẩn ty Tuy nhiên, cũng như các VSV khác, XK rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xẩy ra sự sắp xếp lại trong các phân tử DNA Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giồng nhau về hình thái Vì vậy, để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải bổ sung thêm các chỉ tiêu khác như đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch hay sinh. .. loại Đây là phương pháp cơ bản có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV Trong đó việc phân tích cấu trúc mạch tetrapeptide của peptydoglycan được xem là tiêu chuẩn hóa phân loại thiết yếu nhất cho nhóm vi khuẩn G (+), trong đó có XK Các đồng phân của diaminopimelic (DAP) trong thành phần peptydoglycan là một trong những axit amin có ý nghĩa quan trọng trong.. .Số hóa bởi trung tâm học liệu / * Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là những chỉ tiêu quan trọng được sử dụng trong phân loại XK Hầu hết các chi XK được mô tả hiện nay được phân loại theo các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như: Màu sắc của hệ KTKS, KTCC, màu sắc của... của chúng Một số đặc điểm sinh lý sinh hóa được sử dụng như: khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của XK [26] 8