Nghiên cứu phân lập một số chủng xạ khuẩn có khả năng ức chế nấm mốc gây hại trên cam tại huyện cao phong, tỉnh hòa bình

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài luận văn kết thúc khóa học, với tình cảm chân thành, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới trƣờng Đại học Lâm nghiệp tạo điều kiện cho tơi có mơi trƣờng học tập tốt suốt thời gian học tập, nghiên cứu trƣờng Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PG.TS Bùi Văn Thắng Th.S Nguyễn Thị Minh Hằng giúp đỡ suốt trình nghiên cứu trực tiếp hƣớng dẫn tơi hồn thành đề tài luận văn tốt nghiệp Đồng thời, tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn tới Th.S Nguyễn Thị Hồng Nhung môn Vi sinh – Hóa sinh Viện cơng nghệ sinh học tạo điều kiện cung cấp dụng cụ thí nghiệm, hóa chất đầy đủ suốt trình học tập hồn thành Khóa luận tốt nghiệp lần Mặc dù đƣợc thầy (cô) hƣớng dẫn tôi, giúp chỉnh sửa luận văn nhƣng khơng tránh khỏi sai sót, mong bạn đọc thông cảm bổ sung thêm để luận văn đƣợc hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Xuân Mai, ngày 14 tháng năm 2018 Sinh viên thực Đào Thị Thoa i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu khuẩn xạ 1.1.1.Phân bố xạ khuẩn tự nhiên 1.1.2.Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 1.1.3.Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 1.1.4.Cấu trúc tế bào xạ khuẩn 1.1.5.Đặc điểm sinh lý – sinh hóa xạ khuẩn 1.2.Các phƣơng pháp phân loại xạ khuẩn 1.3.Chất kháng sinh t xạ khuẩn 1.3.1 ự h nh thành chất kháng sinh xạ khuẩn 1.3.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 11 1.4 Bệnh nấm mốc gây hại cam ứng dụng chất kháng sinh bảo vệ thực vật 12 1.4.1.Bệnh nấm mốc gây hại cam 12 1.4.2.Các chất kháng sinh bảo vệ thực vật 13 CHƢƠNG 2: V T LIỆ N I D NG V HƢƠNG H NGHI N C 15 2.1 Vật liệu 15 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu 15 2.1.2.Hó chất 15 2.1.3.Thiết ị dụng cụ th nghiệm 15 2.1.4.Nguyên liệu 15 2.3 hƣơng pháp nghiên cứu 16 ii 2.3.1 hƣơng pháp thu mẫu đất 16 2.3.2 hƣơng pháp phân lập xạ khuẩn t đất 18 2.3.3 hƣơng pháp phân lập nấm mốc t cam Cao Phong 18 2.3.4 hƣơng pháp xác định hoạt t nh đối kháng nấm củ chủng xạ khuẩn với nấm mốc hại can 18 2.3.5 hƣơng pháp khảo sát đặc tính sinh lý hóa chủng xạ khuẩn có khả sinh chất đơi kháng mạnh 19 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N 20 3.1 Kết phân lập xạ khuẩn 20 3.2 Kết phân lập chủng nấm mốc gây hại cam 22 3.3 Xác định hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc 22 3.4 Đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng xạ khuẩn X1, X2 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO iii DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc t đất 21 Bảng 3.2: Kết vòng đối kháng chủng nấm với chủng nấm mốc hại cam 23 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng nhiệt độ đến sinh trƣởng chủng xạ khuẩn X1, X2 25 iv DANH MỤC HÌNH H nh 1.1: Khuẩn lạc xạ khuẩn Hình 1.2: Các kiểu hệ sợi xạ khuẩn Hình 1.3: Các dạng cuống sinh bào tử xạ khuẩn Hình 1.4: Bào tử xạ khuẩn Hình 1.4 Sự phát triển nấm mốc cam .13 H nh 2.1: Vƣờn trồng c m Cao Phong .17 H nh 2.2: Các mẫu đất thu vƣờn c m .17 Hình 3.1: Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn phân lập t đất trồng cam 20 Hình 3.2: Nấm mốc đƣợc ni cấy đĩ peptri 22 Hình 3.3: Biểu đồ thể khả sinh chất đối kháng chủng xạ khuẩn 23 H nh 3.4: Vòng đối kháng chủng xạ khuẩn X1 với nấm N1 24 H nh 3.5: Vòng đối kháng chủng xạ khuẩn X2 với nấm N2 24 v ĐẶT VẤN ĐỀ Cây có múi tên gọi chung nhóm cam, chanh, quýt, bƣởi thuộc họ Rutaceae đƣợc trồng 100 quốc gia giới Đây loại có tầm quan trọng hàng đầu, với sản lƣợng hàng trăm triệu năm c m chiếm đến 54% Ở Việt Nam, cam Cao Phong – Hoà B nh nh ng giống c m đặc sản mang lại hiệu kinh tế cao Tuy nhiên, cam nh ng loại có tuổi thọ bảo quản ngắn, tổn thất sau thu hoạch cao Sự hƣ hỏng nấm mốc gây bệnh nh ng vấn đề nghiêm trọng làm giảm giá trị thƣơng phẩm cam Hiện nay, để giúp c m đƣợc tƣơi lâu thời gi n ảo quản k o dài th ngƣời t thƣờng sử dụng thuốc ảo quản ằng chất hóa học Tuy nhiên, loại thuốc tác nhân gây ô nhiễm môi trƣờng ảnh hƣởng sức khoẻ ngƣời Do việc hạn chế khả phát tán gây ệnh nấm mốc x nh dựa vào khả đối kháng vi sinh vật nhƣ vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn nhằm đƣ r phƣơng pháp th ch hợp để c m lâu thối Trong số vi sinh vật thƣờng đƣợc sử dụng để ức chế vi sinh vật gây bệnh, xạ khuẩn nhóm có nhiều tiềm tỷ lệ lồi có khả sinh chất kháng sinh c o có nhiều chất kháng sinh có khả chống nấm mạnh Hị B nh tỉnh giàu tiềm nơng, lâm nghiệp Trong c m loại chủ đạo hàng năm ệnh nấm gây r nh ng thiệt hại không nhỏ làm giảm suất chất lƣợng sản phẩm Vì việc tìm kiếm chủng xạ khuẩn có khả sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật xây dựng nơng nghiệp an tồn bền v ng Do tơi thực đề tài: Nghiên cứu, phân lập số chủng xạ khuẩn có khả ức chế nấm mốc gây hại cam huyện Cao Phong, tỉnh Hịa Bình nhằm kh i thác nguồn vi sinh vật phong phú tỉnh CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu khuẩn xạ 1.1.1 Phân bố xạ khuẩn tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi tự nhiên Phần lớn xạ khuẩn tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh (khuẩn ty) [3] Chúng có đất nƣớc, rác, phân chuồng, bùn, chí chất mà vi khuẩn nấm mốc không phát triển đƣợc Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác thảm thực vật [5] Theo Waksman g m đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm - 45% tổng số vi sinh vật [3] Sự phân bố xạ khuẩn phụ thuộc nhiều vào độ pH mơi trƣờng, chúng có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu axit yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có lớp đất kiềm axit lớp đất kiềm, số lƣợng xạ khuẩn đất th y đổi theo thời gi n năm Một nh ng đặc tính quan trọng xạ khuẩn khả h nh thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn đƣợc phân lập t đất có khả sinh chất kháng sinh Cho tới khoảng 8000 chất kháng sinh biết giới có tới 80% xạ khuẩn sinh [6].Trong số có 15% có nguồn gốc t loại xạ khuẩn nhƣ Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng ý xạ khuẩn cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đ ng dùng y học nhƣ gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào q trình chuyển hố nhiều hợp chất đất nƣớc Dùng để sản xuất nhiều enzym nhƣ prote z amylaza, xenluloz …một số axit amin axit h u Một số xạ khuẩn gây bệnh cho ngƣời động vật 1.1.2 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Khuẩn lạc xạ khuẩn Đặc điểm bật xạ khuẩn có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh khơng có vách ngăn (chỉ tr cuống bào tử hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh nấm mốc với đƣờng k nh th y đổi khoảng 0,2 1mm đến – 3mm, chiều dài đạt tới vài cm [3] K ch thƣớc khối lƣợng hệ sợi thƣờng không ổn định phụ thuộc vào điều kiện sinh lý nuôi cấy K ch thƣớc hệ sợi xạ khuẩn nh ng đặc điểm phân biệt khuẩn lạc xạ khuẩn khuẩn lạc nấm mốc hệ sợi nấm mốc có đƣờng kính lớn th y đổi t - 50 mm, dễ quan sát mắt thƣờng K ch thƣớc hình dạng khuẩn lạc th y đổi tuỳ lồi tuỳ vào điều kiện nuôi cấy nhƣ thành phần môi trƣờng, nhiệt độ độ ẩm… Đƣờng kính khuẩn lạc ch ng 0,5 - mm nhƣng có khuẩn lạc đạt tới đƣờng kính 1cm lớn Khuẩn lạc có lớp, lớp vỏ ngồi có dạng sợi bện chặt, lớp tƣơng đối xốp, lớp gi a có cấu trúc tổ ong Khuẩn lạc xạ khuẩn thƣờng rắn chắc, xù xì, có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào k ch thƣớc bào tử Trƣờng hợp khơng có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo Kích thƣớc khuẩn lạc th y đổi tùy loài xạ khuẩn tùy điều kiện ni cấy Khuẩn lạc thƣờng có dạng phóng xạ, số có dạng nh ng vịng trịn đồng tâm cách khoảng định Nguyên nhân tƣợng vòng tròn đồng tâm xạ khuẩn sinh chất ức chế sinh trƣởng, sợi mọc qua vùng chúng sinh trƣởng yếu qu đƣợc vùng có chất ức chế chúng lại sinh trƣởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng lại sinh chất ức chế sinh trƣởng sát với khiến khuẩn ty lại phát triển yếu Cứ tạo thành khuẩn lạc có dạng vịng trịn đồng tâm Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nh u: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài điều kiện ngoại cảnh H nh 1.1 huẩn ạc huẩn [1] Khuẩn ty xạ khuẩn Trên môi trƣờng đặc, hệ sợi xạ khuẩn phát triển thành loại: loại cắm sâu vào môi trƣờng gọi hệ sợi chất (khuẩn ty chất substrate mycelium) với chức chủ yếu dinh dƣỡng Một loại phát triển bề mặt thạch gọi hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức chủ yếu sinh sản Nhiều loại có hệ sợi chất nhƣng có loại (nhƣ chi Sporichthya) lại có hệ sợi kh sinh Khi hệ sợi ký sinh v a làm nhiệm vụ sinh sản v a làm nhiệm vụ dinh dƣỡng Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn gi i đọan phát triển 11 m/giờ chất nhân tế bào xạ khuẩn xếp đặn theo chiều dài sợi Do đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi trƣơng lên s u - xuất trình tổng hợp ARN, nhân gene cần thiết t genom tiến hành tổng hợp protein, nhƣ sợi đƣợc hình thành phát triển Một số xạ khuẩn có sinh nang bào tử bên chứa bào tử nang Hình 1.2: Các kiểu hệ sợi xạ khuẩn [1] 1.1.3 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn đƣợc hình thành nhánh phân hóa khuẩn ty khí sinh - gọi cuống sinh bào tử Đó qu n sinh sản đặc trƣng cho xạ khuẩn Hình thái, cuống sinh bào tử bào tử đặc điểm quan trọng phân loại xạ khuẩn Sau thời gian phát triển đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên nh ng sợi phân hóa gọi cuống sinh bào tử; tuỳ theo t ng lồi mà cuống sinh bào tử thẳng hay uốn cong, xoắn lò so hay xoắn ốc; chúng mọc đơn mọc đối, mọc vịng, mọc thành chùm, số vòng xoắn cuống sinh bào tử t – 10 vịng đƣờng kính vịng xoắn th y đổi t – 7nm [2] giải Ngồi ra, nhiều xạ khuẩn cịn tiết chất k ch th ch sinh trƣởng thực vật nhƣ k ch th ch khu hệ vi sinh vật có lợi vùng rễ [3] 1.4.2.2 Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn phòng trừ nấm gây bệnh thực vật Để tránh dịch bệnh nơng nghiệp ngƣời ta sử dụng số biện pháp kỹ thuật nhƣ th y đổi cấu trồng, mùa vụ Tuy nhiên biện pháp gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh số bệnh mà trƣớc t gặp Việc tuyển chọn dòng kháng bệnh đƣợc vài năm s u tác nhân gây ệnh lại kháng lại Việc sử dụng chất kháng sinh trồng trọt nhằm mục đ ch nhƣ chống bệnh nấm gây rau trồng, chống bệnh vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng cỏ dại kiềm chế bệnh thực vật sinh t đất So với thuốc hóa học, dùng chất khang sinh bảo vệ thực vật v a có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc c o độ độc thấp khơng gây nhiễm mơi trƣờng, cịn có khả ức chế vi sinh vật kháng thuốc hóa học chất kháng sinh dịch lên men chủng sinh chất kháng sinh dùng để xử lý hạt giống với mục đ ch tiêu diệt nguồn bệnh bên hạt, diệt bệnh phận nằm đất khử trùng đất [3] 14 CHƯƠNG 2: I N I NG HƯƠNG H NGHI N C 2.1 ật iệu 2.1.1 Đối tƣợng nghi n cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập t đất Thị trấn C o hong huyện C o hong tỉnh Hò B nh - Cam bị mốc thu Thị trấn C o hong huyện C o hong tỉnh Hị B nh 2.1.2 H a chất Hó chất dùng th nghiệm: KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4, KCl, NaNO3, đƣờng D- glcose g r tinh ột t n cồn 960 2.1.3 Thiết ị ụng cụ th nghiệm - Các thiết bị: Nồi hấp vô trùng, tủ cấy vơ trùng, tủ sấy, kính hiển vi, tủ lạnh máy đo pH máy li tâm cân phân t ch điện tử lị vi sóng - ng th nghiệ B nh t m giác ống nghiệm đĩ peptri que tr ng que cấy đ n cồn màng ọc thực phẩm út ghi k nh ăng d nh giấy túi nilong, dây chun 2.1.4 Ngu n iệu - Các mẫu đất đƣợc lấy vƣờn trồng c m thị trấn Cao Phong - Cam đƣợc thu vƣờn trồng cam thị trấn Cao Phong 2.1.5 Các môi trƣờng sử dụng đề tài dụng môi trƣờng G use để phân lập nuôi cấy xạ khuẩn xác định hoạt t nh đối kháng nấm môi trƣờng DA ( ot to D- glucose Ag r) để phân lập nuôi cấy nấm ôi trường a KH2PO4 th nh hần g : 0,5g KNO3 : 1,0g MgSO4.7H2O: 0,5g Agar : 20g NaCl : 0,5g Tinh ột t n : 20g FeSO4 : 0,01g Nƣớc cất lit 15 : ôi trường Khoai tây th nh hần (g/l): : 200g Đƣờng D- glucose: 20g Agar :20g Nƣớc cất : lit 2.1.6 Thời gian địa điểm - Thời gi n: T tháng 1- 4/2018 - Đị điểm: Các th nghiệm đƣợc tiến hành phịng th nghiệm Vi sinh – Hóa sinh Viện công nghệ sinh học – Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp 2.2 Nội dung nghiên cứu - Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm t mẫu đất thu thập thị trấn Cao Phong - Phân lập chủng nấm mốc gây thối c m thị trấn Cao Phong - Khảo sát khả đối kháng củ chủng xạ khuẩn với nấm mốc hại cam Cao Phong 2.3 hƣơng pháp nghi n cứu 2.3.1 hƣơng pháp thu m u đất Địa điểm thu m u đất: Đất đƣợc lấy vƣờn trồng c m Thị trấn C o hong huyện C o hong tỉnh Hò B nh Cách ấ m u: Dùng dao lấy khoảng – 10g đất cách ề mặt t – 10 cm vị tr để vào túi nilon khử trùng, buộc kín lại Cách ảo quản m u: Mẫu đất đƣợc mang phịng thí nghiệm, tiến hành phơi khơ mẫu điều kiện tự nhiên u nhặt bỏ rác, đá xác h u đem mẫu nghiền cối sứ tiến hành sàng qua rây Mẫu đất nghiền xong đƣợc đựng túi nilon kín bảo quản tủ lạnh 40C 16 H nh 2.1 ƣờn trồng cam Cao Phong H nh 2.2 Các m u đất thu vƣờn cam 17 2.3.2 hƣơng pháp phân ập huẩn t đất Cân g đất cho vào bình tam giác 250 ml ml nƣớc cất vô trùng khuấy cho đất hồn t n hết Dùng pipet vơ trùng hút ml dịch đất sang ống nghiệm có ml nƣớc vơ trùng tiếp tục pha lỗng đến 10-2, 10-3, 10-4, 10-6 T nồng độ pha loãng nồng độ 10-2 đến 10-5 nhỏ ml s ng đĩ petri môi trƣờng Gause Dùng que cấy trải đậy đĩ petri gói lại lật sấp đặt vào tủ ấm nhiệt độ 28 – 30 0C ngày Tiến hành quan sát phân biệt khuẩn lạc xạ khuẩn với loại vi sinh vật khác T khuẩn lạc đƣợc làm cấy truyền s ng đĩ peptri khác tiếp tục nuôi điều kiện ngày Bảo quản tủ lạnh để thực thí nghiệm 2.3.3 hƣơng pháp phân ập nấm mốc t cam Cao Phong Chọn nh ng lành lặn, không sây sát, không sâu bệnh Các mẫu sau thu hoạch để nơi thoáng mát Sau vài ngày cam xuất đốm trắng chuyển sang màu xanh Dùng que cấy lấy bào tử nấm nuôi môi trƣờng PDA 28 – 300C Sau 3-5 ngày, hệ sơi nấm mọc nhiều đĩ peptri Lúc dùng que cấy lấy hệ sợi làm nghiệm hƣơng pháp ác định hoạt t nh đối háng nấm chủng xạ 2.3.4 khuẩn với nấm mốc hại can Nguyên tắc: Hoạt t nh đối kháng xạ khuẩn thể thơng qua kích thƣớc vòng đối kháng (vòng suốt bao quanh khuẩn lạc) Chất đối kháng xạ khuẩn tiết r để ức chế phát triển nấm mốc, làm nấm khơng phát triển đƣợc tạo thành vịng đối kháng hƣơng pháp thỏi thạch - Mụ đí h: Xác định khả đối kháng nấm t chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc với chủng nấm mốc hại cam - Cách tiến hành Xạ khuẩn đƣợc nuôi cấy môi trƣờng G use đĩ petri ngày Dùng khoan nút chai khoan thỏi thạch chứa xạ khuẩn đặt vào đĩ petri chứa 18 môi trƣờng DA u cấy chấm điểm nấm mốc khắp bề mặt thạch Để vào tủ lạnh – cho hoạt chất đối kháng t thỏi thạch khuếch tán vào môi trƣờng Để vào tủ ấm, nuôi 28 – 30 0C đọc kết sau ngày - Tính kết : Hoạt tính kháng sinh = D – d mm Trong đó: D đƣờng k nh vịng đối kháng d đƣờng kính thỏi thạch (d = mm) 2.3.5 hƣơng pháp hảo sát đặc tính sinh lý hóa chủng xạ khuẩn có khả sinh chất đôi háng mạnh hƣơng pháp xác định nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng chủng xạ khuẩn có hoạt t nh đối kháng mạnh nhất: Nuôi chủng xạ khuẩn nhiệt độ khác nhau: 250C, 280C, 300C, 350C, 400C sinh trƣởng chúng 19 u đánh giá khả CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết phân lập xạ khuẩn T mẫu đất thu vƣờn trồng cam thị trấn Cao Phong, huyện Cao Phong thuộc tỉnh Hị B nh tơi phân lập khiết đƣợc chủng xạ khuẩtn đƣợc ký hiệu lần lƣợt X1, X2, X3, X4, X5, X6 Hình 3.1: Khuẩn lạc chủng xạ khuẩn phân lập t đất trồng cam Qua hình nhận thấy: Các chủng xạ khuẩn: X1, X X4 có hình dạng k ch thƣớc rõ so với chủng lại điều chứng tỏ môi trƣờng nuôi cấy (môi trƣờng Gause 1), nhiệt độ (28 – 30 0C) phù hợp cho chủng phát triển T kết phân lập số lƣợng xạ khuẩn phân bố tƣơng đối nhiều Chính thị trấn Cao Phong có nhiều tiềm để phát triển ăn hệ vi sinh vật phù du Nguồn xạ khuẩn nhiều hội tụ yếu tố sau: - Thành phần inh ƣỡng đất giàu nguồn Cacbon, Nito, Phopho chất vi lƣợng - Độ pH đất: Xạ khuẩn có nhiều lớp đất trung tính kiềm yếu acid yếu (pH = 6,8 – 7,5) 20 - Khí hậu: Xạ khuẩn vi sinh vật ƣ nhiệt, xạ khuẩn phát triển mạnh nhiệt độ 28 – 30 0C Thị trấn C o hong vùng đất cao, khí hậu ơn hịa nên có nhiều xạ khuẩn nhƣ vi sinh vật khác sinh sống - Thành phần môi trƣờng phân lập nuôi cấy chủng xạ khuẩn đủ hàm lƣợng thành phần cần thiết cho xạ khuẩn phát triển T yếu tố kể nhận thấy yếu ên tác động nhiều đển phân bố, khả phát triển xạ khuẩn Sau nuôi cấy chủng xạ khuẩn môi trƣờng G use (đặc) khuẩn lạc chủng xạ khuẩn có đặc điểm h nh thái nhƣ s u: Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc t đất Chủng xạ khuẩn X1 Đặc điểm hình thái Bề mặt xạ khuẩn lúc đầu nh ng chấm nhỏ, có màu trắng đục, sau ngày ni cấy bề mặt xạ khuẩn có màu trắng đậm hơn, xuất thành t ng cục, dùng que cấy lấy khuẩn lạc lên thấy khuẩn lạc cứng dai, sợi chất dính chặt vào mặt thạch, không tiết sắc tố X2 Bề mặt xạ khuẩn có màu trắng sáng, dùng que cấy lấy khuẩn lạc lên thấy khuẩn lạc rắn chắc, sợi chất k ăn sâu vào mặt thạch, không tiết sắc tố X3 Bề mặt xạ khuẩn trơn nhẵn dạng da, dùng que cấy lấy khuẩn lạc thấy khuẩn lạc mền, sợi chất bám chặt vào mặt thạch, có tiết sắc tố màu nâu thấm dần vào mặt thạch X4 Bề mặt khuẩn lạc màu trắng, mép khuẩn lạc có hệ sợi tua xung quanh, dùng que cấy lấy khuẩn lạc thấy khuẩn lạc cứng, khó lấy khơng tiết sắc tố X5 Bề mặt khuẩn lạc có màu vàng nhạt khơ dùng que cấy lấy thấy khuẩn lạc cứng nhƣng sợi chất bám vào mặt thạch, không tiết sắc tố X6 Bề mặt khuẩn lạc có màu vàng, dùng que cấy lấy khuẩn lạc thấy khuẩn lạc cứng, sợi chất bám vào mặt thạch, không tiết sắc tố 21 T đặc điểm hình thái khuẩn lạc xạ khuẩn kể trên, chủng xạ khuẩn có chung đặc điểm sau: Khuẩn lạc đ số có màu trắng rắn chắc, sợi chất bám chặt vào mặt thạch chủ yếu không tiết sắc tố 3.2 Kết phân lập chủng nấm mốc gây hại cam T mẫu cam bị thối thu thập đƣợc, phân lập đƣợc chủng nấm Các chủng nấm có đặc điểm nhƣ s u: Chủng nấm (N1): B n đầu nấm mọc rải rác bề mặt thạch Sau ngày nuôi cấy hệ sợi nấm ăn l n k n hết đĩ peptri Hệ sợi có màu trắng đồng đều, sợi chất bám vào mặt thạch nên dùng que cấy lấy nấm khó Chủng nấm (N2): Hệ sợi nấm mọc t mẫu cấy Sau ngày nuôi cấy chúng mọc k n đĩ peptri Hệ sợi có màu trắng xen kẽ màu đen sợi chất không bám vào mặt thạch nên dùng que cấy lấy nấm dễ dàng Hình 3.2: Nấm mốc đƣợc ni cấy tr n đĩa peptri Nhìn vào chủng nấm phân lập đƣợc cho thấy: Chủng nấm N1 phát triển tốt chủng nấm N2 Kết cho thấy: - Mơi trƣờng PDA thích hợp cho nấm phát triển - Nhiệt độ nuôi cấy 28 – 300C nhiệt độ lý tƣởng cho nấm sinh trƣởng 3.3 Xác định hoạt tính kháng nấm chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc Sau phân lập làm khiết chủng xạ khuẩn dùng phƣơng pháp thỏi thạch để xác định hoạt t nh đối kháng nấm chủng xạ khuẩn 22 với chủng nấm Kết vòng đối kháng nấm mốc hại cam chủng xạ khuẩn đƣợc thống kê bảng 3.2: Bảng 3.2: Kết vòng đối kháng chủng nấm với chủng nấm mốc hại cam Chủng xạ khuẩn òng đối kháng nấm (mm) Chủng N1 Chủng N2 X1 10,00 8,40 X2 7,62 11,70 X3 3, 54 3,23 X4 8,65 6,12 X5 7,00 9,60 X6 2,59 3,40 Hình 3.3: Biểu đồ thể hoạt tính đối kháng chủng xạ khuẩn 23 T bảng 3.2 hình 3.3 nhận thấy: - Khả đối kháng chủng xạ khuẩn với nấm mốc hại cam mức độ khác Có chủng sinh hoạt tính cao có chung sinh hoạt tính thấp - Vịng đối kháng chủng nấm c o vòng đối kháng chủng nấm điều cho thấy N1 - Khả sinh chất đối kháng chủng xạ khuẩn X1 X2 c o hẳn so với chủng xạ khuẩn lại - Khả sinh chất kháng sinh chủng xạ khuẩn X3, X6 thấp - Các chủng xạ khuẩn có hoạt t nh đối kháng với chủng nấm N1 c o chủng nấm N2 T kết trên, chọn đƣợc chủng xạ khuẩn có khả kháng nấm mốc hại cam cao chủng X1 có vịng đối kháng 10 mm chủng X2 có vịng đối kháng 11,7 mm Hình 3.4 ịng đối kháng chủng xạ khuẩn X1 với nấm N1 24 H nh 3.5 òng đối kháng chủng xạ khuẩn X2 với nấm N2 3.4 Đặc điểm sinh lý sinh hóa chủng xạ khuẩn X1, X2 Ảnh hƣ ng nhiệt độ đến sinh trƣ ng Sau tuyển chọn đƣợc chủng xạ khuẩn X1, X2 có khả sinh hoạt tính kháng nấm cao Rồi mang chủng nuôi nhiệt độ khác Khả sinh trƣởng chủng đƣợc thể bảng 3.3 Bảng 3.3: Ảnh hƣ ng nhiệt độ đến sinh trƣ ng chủng xạ khuẩn X1, X2 Nhiệt độ 250C 280C 300C 350C 400C X1 ++ +++ +++ + - X2 + ++ +++ + - Chủng xạ khuẩn Chú thích: +++: inh trƣởng mạnh ++: inh trƣởng trung bình +: inh trƣởng yếu -: Khơng sinh trƣởng Kết bảng 3.3 cho thấy: Hai chủng X1 X2 có khả sinh trƣởng khoảng nhiệt độ t 25 – 30 0C Chủng X1 X2 sinh trƣởng tốt nhiệt độ 28 – 30 0C chủng sinh trƣởng yếu nhiệt độ 350C chúng không sinh trƣởng 40 0C Nhƣ nhiệt độ thích hợp cho chủng phát triển tốt 28 – 30 0C 25 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận T mẫu đất trồng cam, phân lập đƣợc chủng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng mức độ khác Trong số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc có chủng có hoạt t nh đối kháng cao chủng X1có vịng đối kháng 10 mm chủng X2 có vịng đối kháng 11,7 mm Đã xác định đƣợc nhiệt độ thích hợp cho chủng xạ khuẩn sinh trƣởng t 28 – 30 0C Phân lập đƣợc chủng nấm mốc (N1, N2) hại c m có chung đặc điểm: Phát triển tốt môi trƣờng PDA Kiến nghị Cần tối ƣu hó số điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn nhƣ nguồn Cacbon, Phospho Nito Nghiên cứu thêm đặc điểm sinh học,đặc tính sinh lý hóa khả sinh chất kháng sinh chủng xạ khuẩn X1, X2 Sản xuất chế phẩm sinh học t chủng xạ khuẩn v a phân lập đƣợc để giúp cam sau thu hoạch lâu hƣ hỏng 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Lân Dũng ( chủ biên) (2002) Vi sinh vật học phần 1, Hà Nội – nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006) Khảo sát đặc điểm vai trò chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii Trần Thị Minh Định, Trần Thanh Thuỷ (số 12- 2007) Khảo sát đặc điểm số chủng nấm sợi có kháng sinh chống sinh vật gây hại Tạp chí khoa học ĐH T HCM tr ng 138 – 150 Bùi Thị Hà (2008) Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Stretomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh chè Thái Nguyên Trƣờng đại học Thái nguyên Trung tâm khuyến nông quốc gia – Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn( 2013) Sổ t y hƣớng dẫn phịng tr sâu, bệnh hại ăn có múi Nhà xuất Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hà (2015) Nghiên cứu phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn nội sinh có múi đặc sản tỉnh Hò B nh Viện đại học Mở Hà Nội Khƣu hƣơng Yến Anh (2015) Nghiên cứu xạ khuẩn có khả đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn lúa phân lập t đất huyện Thoại ơn tỉnh An Gi ng Trƣờng đại học An Giang Hà Viết Cƣờng , Trần Thị Định (2016) Xác định loài nấm mốc vi khuẩn gây bệnh sau thu hoạch vải phƣơng pháp phòng tr Tạp chí KH Nơng nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 4, trang 635 – 644 Tài liệu tiếng anh Raphael S Pimenta, Francisco L Silva, Juliana F.M Silva, Paula B Morais, Danúbia T Braga, Carlos A Rosa, Ary Corrêa Jr Biological control of Penicillium italicum, P digitatum and P expansum by the predacious yeast saccharomycopsis schoenii on oranges Brazilian Journal of Microbiology (2008), page 85 - 93 l z s ll J Teixido˜ N nd Vin ˜s I (2003) Effect of w ter ctivity and temperature on germination and growth of Penicillium digitatum, P italicum and Geotrichum candidum J Appl Microbiol 94, 549–554 R Lahlali, M.N Serrhini, D Friel1 and M.H Jijakli In vitro effects of water activity, temperature and solutes on the growth rate of P italicum Wehmer and P digitatum Sacc Journal of Applied Microbiology, page 628 – 636