Phân lập SUS1 Promoter từ cây ngô và thiết kế vector biểu hiện chứa SUS1 promoter và Gen Cryia (C)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ TÌNH PHÂN LẬP SUS1 PROMOTER TỪ CÂY NGÔ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CHỨA SUS1 PROMOTER VÀ GEN CRYIA(C) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN THỊ TÌNH PHÂN LẬP SUS1 PROMOTER TỪ CÂY NGÔ VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN CHỨA SUS1 PROMOTER VÀ GEN CRYIA(C) Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60. 42. 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. NÔNG VĂN HẢI THÁI NGUYÊN - 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa hề đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đƣợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã đƣợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Nguyễn Thị Tình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy PGS. TS. Nông Văn Hải – Phó viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Giám đốc phòng thí nghiệm trọng điểm – Trưởng phòng Công nghệ ADN ứng dụng đã tận tình chỉ dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập thực hiện luận văn tại Viện công nghệ sinh học. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS - NCS Huỳnh Thị Thu Huệ, TS. Lê Thị Thu Hiền, CN. Dương Thị Thu Hà, cùng toàn bộ cán bộ, đồng nghiệp trong phòng Công nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình công tác và nghiên cứu khoa học tại Phòng Thí nghiệm trong thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020 của Bộ Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn đã tạo điều kiện cho thực hiện luận văn này trong khuôn khổ đề tài mã số CNSH. ĐT .03/06 -2010. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô khoa Sinh trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên đã tận tình dạy dỗ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại khoa. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên, Các thầy cô Khoa Sau đại học - Trường Đại học Sư phạm Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và trong cuộc sống. Sự tin tưởng và khích lệ từ gia đình đã giúp tôi vững vàng, toàn tâm, toàn ý cho công việc. Từ trái tim mình, tôi muốn gửi lời cảm ơn đến tất cả mọi người ! Thái Nguyên, ngày 22 tháng 9 năm 2011 Tác giả Nguyễn Thị Tình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng các gen kháng sâu Bt trong tạo cây trồng chuyển gen có khả năng kháng sâu tự nhiên 3 1.2. Những nghiên cứu về Bacillus thuringiensis và gen cry 4 1.2.1. Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis 4 1.2.2. Một số nghiên cứu về gen Cry 5 1.2.3. Một số nghiên cứu về gen cryIA(c) 8 1.3. Promoter và vai trò điều khiển biểu hiện gen 9 1.3.1. Cấu trúc của gen 9 1.3.2. Cấu trúc promoter 10 1.3.3. Vai trò điều khiển biểu hiện gen của promoter 12 1.3.4. Những nghiên cứu Sus1 promoter 15 1.4. Agrobacterium tumefaciens và cơ chế chuyển gen vào thực vật 17 1.4.1. Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens 17 1.4.2 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 18 1.4.3 Cấu trúc và chức năng của các đoạn T- DNA 19 1.4.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens 19 1.4.5 Tƣơng tác giữa T - DNA và genome tế bào thực vật 21 1.4.6 Một số phƣơng pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 22 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Nguyên liệu 24 2.2. PHƢƠNG PHÁP 27 2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số mầm ngô 27 2.2.2. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose 28 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn iv 2.2.3. PCR (Polymerase chain reaction) 30 2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế 31 2.2.5. Phản ứng nối ghép gen 32 2.2.6. Biến nạp plasmid 32 2.2.7. Tách chiết DNA plasmid 34 2.2.8. Tinh sạch ADN từ gel agarose bằng cột 35 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Phân lập Sus1 promoter từ mầm ngô 36 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mầm ngô 36 3.1.2. Tách dòng đoạn Sus1 promoter trong pJET 1.2/blunt 39 3.1.3. Trình tự đoạn Sus1 promoter 42 3.2. Thiết kế vector biểu hiện gen thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter và gen cryIA(c) 45 3.2.1. Chuyển promoter Sus1 vào vector trung gian pRTRA7/3 46 3.2.2. Chuyển kết cấu biểu hiện chứa Sus1 promoter và gen cryIA(c) vào pCB301 49 3.3. Chuyển kết cấu Sus1 promoter và cryIA(c) trong pCB301 vào A. tumefaciens 50 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ THUẬT NGỮ Amp Ampicilin Bp Cặp base (base pair) Bt Bacillus thuringiensis ddNTP Dideoxy Nucleoside triphosphate DNA Deoxyribo Nucleoic acid dNTP Deoxy ribo Nucleoside triphosphate EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtOH Cồn (Ethanol) Kb Kilo base (1kb = 1000bp) kDa KiloDalton LB Luria Broth PCR Phản ứng chuỗi Polymerase phiên mã ngược Pcb Vector pCB301 – Kan pJET Vector pJET 1.2/blunt Rif Rifamycin RT- PCR Phản ứng chuỗi polymerase phiên mã ngược SDS Sodium Dodecyl Sulphate Tm Nhiệt độ nóng chảy (melting temperature) v/p Vòng/phút Đtg Đồng tác giả . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vi DANH MỤC HÌNH Hình Trang Hình 1. 1: Cấu trúc một gen 10 Hình 1.2: Vị trí của promoter trong gen 10 Hình 1.3 : Bản đồ Ti - plasmid dạng octopin 19 Hình 1. 4 . Quá trình chuyển T - ADN vào tế bào thực vật 20 Hình 3.1 : DNA Tổng số tách từ mầm ngô 38 Hình 3.2 : Điện di đồ sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter bằng cặp mồi F8 39 Hình 3.3. Điện di sản phẩm tách plasmid chọn dòng trong vector pJET 1.2/blunt 41 Hình 3.4 : Sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter từ vector pJET 1.2/blunt 42 Hình 3. 5: Kiểm tra các plasmid trong vector chọn dòng pJET1.2/blunt 42 Hình 3.6: So sánh trình tự đoạn Sus1 promoter từ ngô Q411 với trình tự MZESUS1 đã công bố 44, 45 Hình 3.7: Sơ đồ thiết kế vector pCB301 mang gen Cry1A(c) và Sus1 promoter 46 Hình 3.8: Ảnh điện di đồ các plasmid tái tổ hợp trong vector pRTRA7/3 48 Hình 3.9: PCR kiểm tra đoạn Sus1 promoter bằng cặp mồi Zsuc-PstIF và Zsuc-NcoIR 53 Hình 3.10: Kiểm tra plasmid trong vector pRTRA7/3 tái tổ hợp bằng enzyme Pst I và NcoI 49 Hình 3.11: Kết cấu kiểm tra Sus1 promoter và gen cryIA(c) trong vector pCB301 bằng Hind III 50 Hình 3.12: Sản phẩm tách DNA từ A. Tumefaciens 52 Hình 13: Sản phẩm PCR từ chủng .Tumefaciens với cặp mồi Zsuc - PstI và Zsuc - NcoIR 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vii DANH MỤC BẢNG Bảng Trang Bảng 1.1 Một số trình tự thƣờng có ở promoter sinh vật nhân chuẩn 11 Bảng 2. 1. Các cặp mồi đƣợc sử dụng 25 Bảng 2. 2. Các hóa chất sử dụng 26 Bảng 2. 3. Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu 28 Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa nộng độ gel agarose và kích thƣớc đoạn DNA cần phân tách 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU Trong nghiên cứu thiết kế vector chuyển gen thực vật, ngoài việc tìm kiếm phân lập các gen quy định cho các tính trạng có giá trị thì việc tìm kiếm phân lập các promoter cũng rất cần thiết để tăng cƣờng mức độ biểu hiện đặc hiệu của gen. Trƣớc đây, các gen quan tâm thƣờng đƣợc điều khiển bởi các promoter cơ định nhƣ: CaMV 35S - promoter, actin promoter, NOS promoter, Ubiquitin promoter dẫn đến sản phẩm gen đƣợc biểu hiện hầu hết ở các mô và cơ quan. Xu hƣớng hiện nay là sử dụng các promoter đặc hiệu để điều khiển gen ở những mô mong muốn hoặc trong các giai đoạn phát triển nhất định của cây. Promoter của gen mã hóa sucrose synthase1 (Sus1) của ngô đã đƣợc chứng minh trên cây thuốc lá chuyển gen là một promoter đặc hiệu ở tế bào phloem. Vì vậy, Sus1 promoter của ngô có thể đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu chuyển gen nhằm biểu hiện các tính trạng ở phloem [74]. Ở Việt Nam, promoter của gen mã hóa sucrose synthase1 đã đƣợc phân lập ở hai giống lúa Tám xoan và Dự thơm nhằm mục đích làm nguyên liệu cho các nghiên cứu chuyển gen cho lúa [4]. Các gen cry đƣợc phân lập từ các chủng Bacillus thuringensis (Bt). Có khoảng 150 gen mã hóa cho các protein tinh thể độc có tác dụng với một số loại sâu. Trong số các nghiên cứu về độc tố cry, cryIA(c) là một trong những protein đƣợc nghiên cứu kỹ, nổi bật với độc tính kháng sâu mạnh, chống lại côn trùng bộ cánh vẩy. Trên thế giới, việc thiết kế vector chuyển gen thực vật mã hóa protein gây độc cho côn trùng có nguồn gốc từ Bt đƣợc bắt đầu từ những năm đầu của thập kỷ 20. Đến năm 2002, cây trồng chuyển gen có khả năng sinh ra các độc tố kháng sâu có nguồn gốc Bt đã đƣợc trồng trên 62 triệu hecta trên toàn thế giới [66]. Gen cry đã chuyển vào nhiều cây trồng nhƣ: cryIA(b) vào cây thuốc lá, gen cryIA(c) vào cà chua, đậu tƣơng, lúa, bông [38, [59], [70]. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu thiết kế vector chứa gen kháng sâu đƣợc tiến hành khá nhiều. Gen cryIA(c) đã đƣợc chuyển vào vector chuyển gen thế hệ mới dƣới sự điều khiển của Ubiquitin promoter phục vụ nghiên cứu chuyển gen vào lúa [3] và đƣợc thiết kế trong vector pCB301 dƣới sự [...]... thut v cỏc phng phỏp thc hin trong quỏ trỡnh tỏch dũng gen, gn gen vo vector biu hin - To c chng Agrobacterium tumefaciens cha Sus1 promoter v gen cryIA( c) 1.3 Ni dung ca ti - Phõn lp Sus1 promoter t ngụ - Thit k vector biu hin thc vt pCB301 cha Sus1 promoter v gen cryIA( c) khỏng cụn trựng - To chng A.tumefaciens mang Sus1 promoter v gen cryIA( c) khỏng cụn trựng 1.4 í ngha khoa hc v thc tin ca ti... phloem phc v cho nghiờn cu chuyn gen khỏng sõu cho cõy ngụ, chỳng tụi ó tin hnh nghiờn cu ti: Phõn lp Sus1 promoter t cõy ngụ v thit k vector biu hin cha Sus1 promoter v gen cryIA( c) 1.1 Mc tiờu ca ti To ra mt vector biu hin thc vt mang ng thi Sus1 promoter phõn lp t ngụ v gen cryIA( c) khỏng cụn trựng 1.2 Yờu cu ca ti - Nm c cu trỳc Sus1 promoter, c im, cu trỳc ca gen cryIA( c) - Nm c cỏc nguyờn lý, k... ghộp vi promoter thỡ gen ngoi lai cn chuyn s khụng hot ng) Promoter v gen cu trỳc c iu khin biu hin ớnh kốm to thnh mt kt cu biu hin gen hay kt cu gen (gene expression cassette hay gene construct ) Gen v promoter cú th c phõn lp t cỏc ngun sinh vt khỏc nhau nh t thc vt, vi khun v virus Mt s kt cu gen biu hin c kt ni vi nhau thnh chui trong vector, mt hoc vi gen trong s ú s l gen khỏng khỏng sinh,... gen cryIA( b) v cryIA( c) bng cỏch thay th cỏc trỡnh t Adenin/Timin bng trỡnh t Guanin/Cytonin m vn gi nguyờn trỡnh t acid amin ca protein [2] Cỏc gen ci bin ny c t di s iu khin ca on khi ng mnh ó c chuyn vo ging bụng Coker vi mc biu hin protein tng 100 ln [3] ó thit k vector th h mi mang gen khỏng cụn trựng cryIA( c) chuyn vo cõy thuc lỏ 1.3 Promoter v vai trũ iu khin biu hin gen 1.3.1 Cu trỳc ca gen. .. cỏc gen cú giỏ tr trong cõy trng Cỏc nghiờn cu chuyn gen thc vt thng s dng CaMV19S promoter [68], Ubiquitin ca ngụ [61] Hin nay promoter ca gen mó húa sucrose synthase c phõn lp v ng dng rng rói 1.3.4 Nhng nghiờn cu Sus1 promoter cõy mt lỏ mm, sucrose c mó húa ớt nht bi hai gen: cú th l SH1 hoc Sus1 [44], [51], [74] Vớ d, lỳa mch cú 2 gen sucrose synthase [22], lỳa mỡ cú 2 gen [23], tulip cú 2 gen. .. biu hin gen (promoter) Promoter, bao gm trỡnh t nucleotide nm ngc phớa trờn u 5 so vi v trớ khi u phiờn mó gen (transcription start site TSS) Tựy thuc vo khong cỏch t TSS, cỏc thut ng promoter gn hay promoter ti thiu (khong vi trm nucleotide quanh vựng TSS) (proximal promoter hay minimal promoter) v promoter xa (hng nghỡn nucleotide phớa trờn TSS) (distal promoter) cú th c s dng C hai loi promoter. .. limitation) + Promoter cm ng: Trong iu kin stress (hn, nhit cc oan, oxy húa cao), cỏc gen chng chu thng biu hin vi tc nhanh Vỡ vy vn khi ng s phiờn mó cng nh cu trỳc promoter ca chỳng v cỏc promoter tham gia vo vic iu khin biu hin gen c c bit quan tõm + promoter c hiu mụ Promoter ch iu khin biu hin gen nhng mụ c hiu, vớ d promoter c hiu bú mch thc vt iu khin biu hin gen bú mch Promoter ny S... ú, gen cryI (cryIAa, cryIAb, cryIAc, cryIB, cryIC, cryIE, cryIF) chim 57 %, cryII chim 5%, cry4 (cryIVA, cryIVB) chim 43%, cryVIII chim 8% Ngoi ra, cỏc gen cyt, gen vip, gen parasporin cng c phỏt hin chim khong 1 - 5% [11] Cho ti nay, cú hng trm gen cry ó c cụng b Tuy nhiờn, hu ht mi quan tõm u tp trung vo nhúm gen cryI, cryIII, cryIV Cỏc chng mang gen cryI cú kớch thc 490 980 bp Cỏc chng mang gen. .. chuyn gen khỏng hiu Vit Nam, hng nghiờn cu chuyn gen vo cõy trng ang c tip cn, u t v trin khai nghiờn cu, ng dng vi s chỳ trng c bit Cỏc ti chuyn gen thc vt ch yu tp trung hon thin phng phỏp chuyn gen vo cõy trng thụng qua vi khun Agrobacterium, thu thp v phõn lp mt s gen v promoter cú giỏ tr phc v cho nụng nghip, c bit phi k n nhúm gen khỏng sõu cry Nhiu cu trỳc Ti plasmid cha gen cryIA( c), cryIA( b)... hin c 3 gen cựng mó húa cho sucrose synthase 1.3.3.2 Promoter v ng dng trong cụng ngh gen thc vt V c bn vic chuyn gen ngoi lai vo sinh vt nhn to sinh vt bin i gen cn phi tin hnh mt s bc bt buc, trong ú cú bc phõn lp cỏc gen riờng l kim soỏt cỏc tớnh trng c th, cỏc gen ny c nhõn lờn v gn mt promoter vo trc cỏc gen ny nhm m bo chỳng cú th hot ng tt trong cỏc sinh vt ớch (nu khụng cú bc ghộp vi promoter . tài: Phân lập Sus1 promoter từ cây ngô và thiết kế vector biểu hiện chứa Sus1 promoter và gen cryIA( c)” 1.1. Mục tiêu của đề tài Tạo ra một vector biểu hiện thực vật mang đồng thời Sus1 promoter. vật pCB301 chứa Sus1 promoter và gen cryIA( c) 45 3.2.1. Chuyển promoter Sus1 vào vector trung gian pRTRA7/3 46 3.2.2. Chuyển kết cấu biểu hiện chứa Sus1 promoter và gen cryIA( c) vào pCB301. lập Sus1 promoter từ ngô - Thiết kế vector biểu hiện thực vật pCB301 chứa Sus1 promoter và gen cryIA( c) kháng côn trùng. - Tạo chủng A.tumefaciens mang Sus1 promoter và gen cryIA( c) kháng