Cơ sở lý thuyết
Dƣới tỏc dụng của CaCl2 0,1 M, thành tế bào vi khuẩn E.coli đang ở giai
đoạn sinh trƣởng trở nờn xốp, tạo điều kiện cho DNA cú thể chui qua cỏc lỗ xốp trờn màng tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Quy trỡnh
- Tạo tế bào khả biến:
+ Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5α trong 5 ml mụi trƣờng LB lỏng, lắc 200 vũng/phỳt ở 370C qua đờm.
+ Chuyển 0,5 ml dịch nuụi tế bào qua đờm sang 50 ml mụi trƣờng LB lỏng
(pha loóng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu), tiếp tục nuụi lắc ở 200 vũng/phỳt,
370C đến khi OD600 nm đạt 0,4 - 0,6. Dịch nuụi cấy sau khi chuyển sang ống ly tõm đƣợc để trong đỏ 20 phỳt.
+ Ly tõm 4000 vũng/phỳt ở 40C trong 10 phỳt, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào.
+ Tế bào sau khi ly tõm đƣợc hũa trong 50 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 35 phỳt ở
00C, ly tõm 4000 vũng/phỳt ở 40C trong 10 phỳt để thu tế bào.
+ Hoà tan tế bào vào 25 ml CaCl2 0,1M lạnh. Ủ 25 phỳt ở 00C, ly tõm 4000 vũng/phỳt ở 40C trong 10 phỳt để thu tủa tế bào.
+ Hũa tế bào vào 1200 àl (800 àl CaCl2 0,1 M và 400 àl Glycerol 60%).
+ Chia vào cỏc ống eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 80 àl dịch tế bào và bảo quản ở - 800
C.
- Biến nạp:
+ Tế bào khả biến đƣợc lấy ra từ - 800C và đƣợc làm tan trờn đỏ trong 30 phỳt (trỏnh sốc nhiệt).
+ Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 4 àl mẫu sản phẩm lai (DNA +
vector + T4 DNA ligase), đảo nhẹ nhàng để DNA phõn bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đú, đặt toàn bộ trờn đỏ trong thời gian 15 phỳt.
+ Sốc nhiệt: Mẫu đang đặt trờn đỏ đƣợc chuyển ngay sang bể ổn nhiệt cú
nhiệt độ 420C trong 70 - 90 giõy. Sau đú mẫu đƣợc lấy ra và đặt ngay lờn đỏ lạnh trong thời gian 5 phỳt. Bổ sung 0,3 ml LB lỏng, lắc hỗn hợp tế bào ở 370C trong 60
phỳt.
+ Hỳt 200 àl dịch tế bào và cấy trải trờn đĩa mụi trƣờng LB đặc cú chứa
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn