Cơ chế lý thuyết
Phƣơng phỏp tỏch chiết DNA plasmid dựa trờn nguyờn lý sử dụng cỏc húa chất (SDS, NaOH) cú tỏc dụng phỏ vỡ cấu trỳc thành tế bào vi khuẩn, biến tớnh cỏc phõn tử protein và giải phúng cỏc plasmid của vi khuẩn. Khi thay đổi giỏ trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch cú chứa kali acetat, cỏc phõn tử protein và DNA hệ gen sẽ bị tủa, tỏch ra khỏi dung dịch bằng ly tõm tốc độ cao. RNA đƣợc loại bỏ bằng cỏch bổ sung RNase.
Quy trỡnh
- Cấy chuyển 1 khuẩn lạc của tế bào E.coli vào trong ống nghiệm chứa 1,7 ml mụi trƣờng LB cú bổ sung Amp (50 àg/ml), nuụi lắc qua đờm ở 370
C, 200 vũng/phỳt. - Chuyển 1,5 ml dịch nuụi cấy vào ống eppendorf loại 1,5 ml, ly tõm 6 phỳt tốc độ 7000 vũng/phỳt. Loại bỏ dịch nổi thu tế bào.
- Hũa đều tế bào thu đƣợc với 150 àl dung dịch Sol I bằng mỏy vortex, để trờn đỏ 5 phỳt.
- Bổ sung 200 àl dung dịch Sol II, đảo đầu ống eppendorf nhanh, nhẹ nhàng để trỏnh đứt gẫy DNA, ủ trờn đỏ 5 phỳt.
- Bổ sung tiếp 150 àl dung dịch Sol III và đảo nhẹ 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết tủa trắng, ủ trong đỏ 5 phỳt.
- Ly tõm 15 phỳt với tốc độ 12000 vũng/phỳt, 4 0C.
- Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf mới. Bổ sung 500 àl dung dịch phenol/chloform, trộn thật đều và ly tõm 15 phỳt, tốc độ 12000 vũng/phỳt.
- Hỳt pha trờn chuyển sang ống eppendorf và lặp lại bƣớc trờn với 450 àl hỗn hợp Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1). Bằng cỏch này lƣợng phenol cũn xút lại sẽ bị loại khỏi dung dịch DNA.
- Tủa dịch pha trờn với 2,5 lần thể tớch ethanol 100%, thờm dung dịch muối Natri acetat tới nồng độ cuối cựng là 0,3 M. Để dung dịch kết tủa ở - 200C trong 3 giờ.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thu DNA kết tủa bằng cỏch ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 10 phỳt. Phần tủa DNA đƣợc rửa 2 lần với ethanol 70%, mỗi lần 1 ml và ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 10 phỳt.
- Tủa DNA đƣợc làm khụ bằng mỏy Speed - Vac, hũa tan DNA plasmid vào 30 - 40 àl H2O cú chứa RNase nồng độ cuối cựng là 100 àg/ml, ủ hỗn hợp ở 370C trong thời gian 30 phỳt.
- Điện di kiểm tra DNA plasmid trờn gel agarose 0,8%.