2.2.1. Phương phỏp tỏch chiết DNA tổng số mầm ngụ
Nguyờn tắc
Thành tế bào thực vật đƣợc phỏ vỡ bằng cỏc biện phỏp cơ học kết hợp với việc sử dụng cỏc chất tẩy rửa mạnh. DNA đƣợc giải phúng và làm sạch tạp chất nhờ
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
proteinase K, dung dịch Chloroform – Isoamyl Alcohol (24:1). DNA đƣợc kết tủa trong cồn tuyệt đối ở - 20oC và thu tủa nhờ li tõm.
Quy trỡnh
DNA tổng số đƣợc tỏch chiết theo phƣơng phỏp của Becker và đtg [15], nhƣng cú cải tiến cho phự hợp với mụ mầm ngụ, bao gồm cỏc bƣớc sau:
- Nghiền 2g mầm ngụ bằng cối chày sứ (cối, chày sứ phải vụ trựng và đƣợc giữ lạnh ở - 70oC) trong Nito lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn.
- Hũa tan mẫu trong 5ml dung dịch đệm chiết cú thành phần: 0,1M NaCl; 10 mM Tris – HCl pH 8,0; 10mM EDTA pH 8,0; 2% SDS.
- Dịch mẫu đƣợc ủ ở 56oC trong 2 giờ, tiến hành đảo đều ống trong quỏ trỡnh ủ. - Thờm 1ml NaCl 6M, để 45 phỳt ở nhiệt độ phũng. Ly tõm mẫu ở 14.000v/p
ở 4oC, Thu dịch ở pha trờn.
- Bổ sung một thể tớch tƣơng ứng dung dịch 25: 24: 1, đảo đều và ly tõm ở 14000v/p trong 15 phỳt.
- Chuyển dịch pha trờn sang ống mới.
- Tiếp tục bổ sung thể tớch tƣơng ứng dung dịch 24 : 1 vào ống, đảo đều ống, ly tõm 14000v/p.
- Chuyển dịch pha trờn sang ống mới.
- Tủa DNA bằng cồn 100% trong 3 giờ ở - 20oC.
- Ly tõm 14.000v/p trong 15 phỳt ở 4oC loại bỏ dịch, thu tủa.
- Rửa kết tủa bằng cồn 70%. Ly tõm 14.000v/p trong 15 phỳt ở 4oC, thu kết tủa. - Làm khụ mẫu và hũa tan DNA trong nƣớc khử ion vụ trựng
- Loại RNA: Bổ sung Rnase vào mẫu DNA thu đƣợc để đạt đến nồng độ cuối cựng là 100àg/ml, ủ mẫu ở 37oC.
2.2.2. Phương phỏp điện di DNA trờn gel agarose
Sản phẩm DNA (tỏch chiết từ E.coli, mụ, từ phản ứng PCR…) đƣợc phõn
tớch định tớnh nhờ phƣơng phỏp điện di trờn gel agarose. Agarose là một loại polymer tỏch từ rong biển, cấu tạo của chỳng gồm 2 monomer là D - galactose và 3,6 - anhydro L - galactose [60].
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Nguyờn tắc:
DNA là cỏc đại phõn tử tớch điện õm nờn khi chịu tỏc động của một điện trƣờng cú hiệu điện thế và cƣờng độ dũng điện thớch hợp, chỳng sẽ di chuyển từ cực õm về cực dƣơng của điện trƣờng với tốc độ tỷ lệ nghịch với kớch thƣớc đoạn DNA.
Từ đú mà DNA đƣợc tỏch thành cỏc vạch khỏc nhau trờn bản gel.
Nồng độ gel tựy thuộc vào kớch thƣớc trung bỡnh của cỏc đoạn DNA cần phõn tỏch. Đoạn DNA cú kớch thƣớc càng nhỏ đũi hỏi hàm lƣợng gel agarose càng lớn và ngƣợc lại. Bảng 2.4 cho thấy mối tƣơng quan giữa nồng độ agarose cần sử dụng để phõn tỏch cỏc trỡnh tự DNA cú kớch thƣớc xỏc định [60].
Bảng 2.4. Tƣơng quan giữa nộng độ gel agarose và kớch thƣớc đoạn DNA cần phõn tỏch
Hàm lƣợng agarose trong gel (%w/v) Kớch thƣớc cỏc đoạn DNA cần phõn tỏch (kb) 0,3 5 – 60 0,6 1 – 20 0,7 0,8 – 10 0,9 0,5 – 7 1,2 0,4 – 6 1,5 0,2 – 3 2,0 0,1 – 2
Sau khi điện di xong, bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (EtBr) trong khoảng 10 phỳt. Cỏc phõn tử EtBr cú khả năng gắn xen giữa cỏc bazơ
của DNA và phỏt huỳnh quang dƣới tỏch dụng của tia UV, do đú cỏc đoạn DNA sẽ đƣợc biểu hiện thành vạch đỏ da cam dƣới ỏnh sỏng đốn UV. Để ƣớc lƣợng kớch thƣớc cỏc trỡnh tự DNA trong gel agarose ngƣời ta dựng yếu tố đỏnh dấu trọng lƣợng phõn tử (molecular weight marker – MWM) là một tập hợp nhiều trỡnh tự DNA cú kớch thƣớc đó biết (Marker DNA).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cỏc bƣớc tiến hành:
- Chuẩn bị gel agarose 0,8%: Cho 0,8g agarose vào 100 ml đệm TAE 1X, đun trong lũ vi súng cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 60oC thỡ đổ dung dịch agarose vào bản khuụn gel điện di đó cài lƣợc sẵn. Chiều dày gel khoản 50 mm là thớch hợp. Sau 30 - 40 phỳt khi agarose đó đƣợc polymer húa hoàn toàn là cú thể điện di đƣợc.
- Tra mẫu DNA vào giếng điện di: DNA đƣợc trộn với đệm tra mẫu (loading dye 10X) với tỉ lệ 1 DNA: 9 loading dye 10X, sau đú tra vào cỏc giếng trờn bản gel. Mẫu DNA đƣợc chạy điện di cựng với Marker DNA để xỏc định kớch thƣớc phõn tử của DNA.
- Chạy điện di: Chạy điện di với chƣơng trỡnh: Hiệu điện thế (U = 50 - 100 V), cƣờng độ dũng điện (I = 80 - 100 mA).
- Nhuộm DNA:Sau khi kết thỳc điện di, bản gel đƣợc lấy ra và ngõm vào dung dịch EtBr cú nồng độ 0,5 àg/ml khoảng 10 - 15 phỳt trờn một mỏy lắc nhẹ nhàng. Sau đú lấy bản gel ra và rửa bằng cỏch ngõm trong nƣớc sạch 2 lần, mỗi lần 5-10 phỳt.
- Quan sỏt và chụp ảnh: Bản gel đƣợc quan sỏt dƣới ỏnh sỏng tử ngoại UV254 nm, và đƣợc chụp ảnh bằng hệ thống chụp ảnh gel tự động.
2.2.3. PCR (Polymerase chain reaction)
Là phƣơng phỏp tổng hợp lƣợng lớn ADN in vitro trờn cơ sở mẫu khuụn. Quỏ trỡnh tổng hợp DNA kộo dài mồi dựa trờn nguyờn tắc bắt cặp đặc hiệu của cỏc đoạn DNA cú trỡnh tự bổ sung và khả năng kộo dài chuỗi của enzyme bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phõn lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ cú ba bƣớc: biến tớnh, gắn mồi, kộo dài chuỗi. Kết quả, sau khoảng 2 - 3 giờ, lƣợng ADN sẽ khuếch đại lờn khoảng 200 – 500 lần.
PCR tự mồi: Là một trong cỏc kỹ thuật phỏt triển từ PCR. Đõy là phản ứng sử
dụng cặp mồi dài cú trỡnh tự DNA gối lờn nhau để tiến hành tổng hợp kộo dài về hai
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
nhằm tạo điều kiện cho cặp mồi bắt cặp chộo với nhau và kộo dài. Sự bắt cặp chộo tƣơng đồng và kộo dài của cỏc đoạn đƣợc tiếp tục diễn ra ở cỏc chu kỳ sau: Sản phẩm của lần PCR tự mồi này đƣợc dựng làm khuụn cho phản ứng PCR tiếp theo nhằm tăng số bản sao mong muốn. Toàn bộ quỏ trỡnh cú thể lặp lại cho đến khi đạt đƣợc kết quả tốt nhất.
Thành phần phản ứng:
Một mẫu phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tớch 25àl gồm cỏc thành
phần nhƣ sau:
Nhõn gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng khuụn là sản phẩm của phản ứng của phản ứng PCR. Giai đoạn này gồm 30 chu kỳ trải qua cỏc bƣớc sau:
Bƣớc 1: Biến tớnh sợi DNA khuụn ở 940
C trong 4 phỳt (cắt đức liờn kết hydro
làm ruỗi hai mạch kộp).
Bƣớc 2: Biến tớnh DNA, tỏch thành hai sợi đơn ở 940C trong 30 giõy. Bƣớc 3: Gắn mồi trờn sợi khuụn ở 640C trong 40 giõy
Bƣớc 4: Tổng hợp, kộo dài chuỗi ở 720
C trong 30 giõy.
Bƣớc 5: Lặp lại 30 lần từ bƣớc 2 - 4.
Phản ứng kết thỳc ở 720C trong 7 phỳt và ủ mẫu ở 40C.
2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế
Cơ sở lý thuyết
Sử dụng cỏc enzyme hạn chế cắt phõn tử DNA thành hai mảnh dạng đầu
bằng hay đầu dớnh tại cỏc vị trớ xỏc định nhờ trỡnh tự nhận biết đặc hiệu.
Quy trỡnh
Một phản ứng cắt của enzyme hạn chế thƣờng đƣợc tiến hành trong tổng thể tớch là 10 àl gồm cỏc thành phần sau:
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn Thành phần Thể tớch (àl) H2O 6,5 Đệm 10X của enzyme 1,0 DNA plasmid 0,5àg/àl 2,0 Enzyme hạn chế 1U/àl 0,5
Hỗn hợp phản ứng cắt đƣợc trộn đều, ủ ở 370C với thời gian thớch hợp tựy từng loại enzyme. Sản phẩm phản ứng cắt đƣợc kiểm tra bằng cỏch điện di trờn gel agarose 0,8%.
2.2.5. Phản ứng nối ghộp gen
Cơ sở lý thuyết
Dƣới sự xỳc tỏc của enzyme T4 DNA ligase, cỏc cầu nối phosphodieste đƣợc hỡnh thành giữa hai nucleotide sỏt cạnh nhau trờn cựng một mạch (gốc phosphate đầu 5’ của nucleotide đoạn DNA này với gốc hydroxyl đầu 3’ của nucleotide của đoạn DNA kia), đồng thời giải phúng một phõn tử nƣớc.
Quy trỡnh
Thành phần của một phản ứng ghộp nối (10 àl):
Thành phần Thể tớch (àl)
T4 DNA ligase buffer 10X 1
Sản phẩm PCR 4
DNA plasmid 1àg/àl 1
T4 DNA ligase 5U/àl 1
H2O 5
Tổng 10
Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 160C trong khoảng 3 giờ.
2.2.6. Biến nạp plasmid
Cơ sở lý thuyết
Dƣới tỏc dụng của CaCl2 0,1 M, thành tế bào vi khuẩn E.coli đang ở giai
đoạn sinh trƣởng trở nờn xốp, tạo điều kiện cho DNA cú thể chui qua cỏc lỗ xốp trờn màng tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Quy trỡnh
- Tạo tế bào khả biến:
+ Cấy chuyển một khuẩn lạc E. coli DH5α trong 5 ml mụi trƣờng LB lỏng, lắc 200 vũng/phỳt ở 370C qua đờm.
+ Chuyển 0,5 ml dịch nuụi tế bào qua đờm sang 50 ml mụi trƣờng LB lỏng
(pha loóng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu), tiếp tục nuụi lắc ở 200 vũng/phỳt,
370C đến khi OD600 nm đạt 0,4 - 0,6. Dịch nuụi cấy sau khi chuyển sang ống ly tõm đƣợc để trong đỏ 20 phỳt.
+ Ly tõm 4000 vũng/phỳt ở 40C trong 10 phỳt, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào.
+ Tế bào sau khi ly tõm đƣợc hũa trong 50 ml CaCl2 0,1 M lạnh. Ủ 35 phỳt ở
00C, ly tõm 4000 vũng/phỳt ở 40C trong 10 phỳt để thu tế bào.
+ Hoà tan tế bào vào 25 ml CaCl2 0,1M lạnh. Ủ 25 phỳt ở 00C, ly tõm 4000 vũng/phỳt ở 40C trong 10 phỳt để thu tủa tế bào.
+ Hũa tế bào vào 1200 àl (800 àl CaCl2 0,1 M và 400 àl Glycerol 60%).
+ Chia vào cỏc ống eppendorf 1,5 ml, mỗi ống 80 àl dịch tế bào và bảo quản ở - 800
C.
- Biến nạp:
+ Tế bào khả biến đƣợc lấy ra từ - 800C và đƣợc làm tan trờn đỏ trong 30 phỳt (trỏnh sốc nhiệt).
+ Bổ sung vào mỗi ống tế bào khả biến 4 àl mẫu sản phẩm lai (DNA +
vector + T4 DNA ligase), đảo nhẹ nhàng để DNA phõn bố đều trong dịch tế bào khả biến. Sau đú, đặt toàn bộ trờn đỏ trong thời gian 15 phỳt.
+ Sốc nhiệt: Mẫu đang đặt trờn đỏ đƣợc chuyển ngay sang bể ổn nhiệt cú
nhiệt độ 420C trong 70 - 90 giõy. Sau đú mẫu đƣợc lấy ra và đặt ngay lờn đỏ lạnh trong thời gian 5 phỳt. Bổ sung 0,3 ml LB lỏng, lắc hỗn hợp tế bào ở 370C trong 60
phỳt.
+ Hỳt 200 àl dịch tế bào và cấy trải trờn đĩa mụi trƣờng LB đặc cú chứa
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.7. Tỏch chiết DNA plasmid
Cơ chế lý thuyết
Phƣơng phỏp tỏch chiết DNA plasmid dựa trờn nguyờn lý sử dụng cỏc húa chất (SDS, NaOH) cú tỏc dụng phỏ vỡ cấu trỳc thành tế bào vi khuẩn, biến tớnh cỏc phõn tử protein và giải phúng cỏc plasmid của vi khuẩn. Khi thay đổi giỏ trị pH của dịch chiết tế bào bằng dung dịch cú chứa kali acetat, cỏc phõn tử protein và DNA hệ gen sẽ bị tủa, tỏch ra khỏi dung dịch bằng ly tõm tốc độ cao. RNA đƣợc loại bỏ bằng cỏch bổ sung RNase.
Quy trỡnh
- Cấy chuyển 1 khuẩn lạc của tế bào E.coli vào trong ống nghiệm chứa 1,7 ml mụi trƣờng LB cú bổ sung Amp (50 àg/ml), nuụi lắc qua đờm ở 370
C, 200 vũng/phỳt. - Chuyển 1,5 ml dịch nuụi cấy vào ống eppendorf loại 1,5 ml, ly tõm 6 phỳt tốc độ 7000 vũng/phỳt. Loại bỏ dịch nổi thu tế bào.
- Hũa đều tế bào thu đƣợc với 150 àl dung dịch Sol I bằng mỏy vortex, để trờn đỏ 5 phỳt.
- Bổ sung 200 àl dung dịch Sol II, đảo đầu ống eppendorf nhanh, nhẹ nhàng để trỏnh đứt gẫy DNA, ủ trờn đỏ 5 phỳt.
- Bổ sung tiếp 150 àl dung dịch Sol III và đảo nhẹ 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết tủa trắng, ủ trong đỏ 5 phỳt.
- Ly tõm 15 phỳt với tốc độ 12000 vũng/phỳt, 4 0C.
- Thu dịch nổi và chuyển sang ống eppendorf mới. Bổ sung 500 àl dung dịch phenol/chloform, trộn thật đều và ly tõm 15 phỳt, tốc độ 12000 vũng/phỳt.
- Hỳt pha trờn chuyển sang ống eppendorf và lặp lại bƣớc trờn với 450 àl hỗn hợp Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1). Bằng cỏch này lƣợng phenol cũn xút lại sẽ bị loại khỏi dung dịch DNA.
- Tủa dịch pha trờn với 2,5 lần thể tớch ethanol 100%, thờm dung dịch muối Natri acetat tới nồng độ cuối cựng là 0,3 M. Để dung dịch kết tủa ở - 200C trong 3 giờ.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Thu DNA kết tủa bằng cỏch ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 10 phỳt. Phần tủa DNA đƣợc rửa 2 lần với ethanol 70%, mỗi lần 1 ml và ly tõm 12000 vũng/phỳt trong 10 phỳt.
- Tủa DNA đƣợc làm khụ bằng mỏy Speed - Vac, hũa tan DNA plasmid vào 30 - 40 àl H2O cú chứa RNase nồng độ cuối cựng là 100 àg/ml, ủ hỗn hợp ở 370C trong thời gian 30 phỳt.
- Điện di kiểm tra DNA plasmid trờn gel agarose 0,8%.
2.2.8. Tinh sạch ADN từ gel agarose bằng cột
Quy trỡnh:
- Cắt gel cho vào Eppendorf và cõn, bổ sung hai lần thể tớch đệm gắn ADN - Ủ ở 500
C trong 5 - 7 phỳt, làm tan rồi trộn đều lờn. - Bổ sung lờn cột và đợi 1 phỳt
- Ly tõm 6000 vũng /30 giõy, loại bỏ dịch ở ống dƣới
- Thờm 500àl đệm rửa (PE chứa 70% ethanol), ly tõm 6000 vũng / 30 giõy để loại bỏ dịch dƣới. Ly tõm tiếp 6000v/phỳt cho hết cồn.
- Chuyển sang Eppendorf mới và bổ sung 40μl H2O, đợi 5 phỳt. Ly tõm 13000 vũng/ phỳt thu ADN đó tinh sạch.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phõn lập Sus1 promoter từ mầm ngụ
3.1.1. Tỏch chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mầm ngụ
Mọi nghiờn cứu trờn bộ gen đều đƣợc bắt đầu từ việc tỏch chiết đƣợc DNA tổng số ở dạng tinh sạch với chất lƣợng tốt và lƣợng đủ lớn. Một trong mối quan tõm hàng đầu khi tỏch chiết DNA tổng số là thu nhận đƣợc cỏc phõn tử này ở trạng thỏi nguyờn vẹn tối đa khụng bị phõn hủy bởi cỏc nuclease nội bào. Cú rất nhiều phƣơng phỏp tỏch DNA từ nguyờn liệu thực vật, mỗi phƣơng phỏp lại cú những ƣu, nhƣợc điểm riờng phự hợp cho từng loại mụ khỏc nhau. Do mụ của mầm ngụ sử dụng trong nghiờn cứu này cú hàm lƣợng protein tƣơng đối cao, nờn chỳng tụi sử dụng proteinase K và SDS để tiến hành tỏch chiết DNA tổng số [15].
Hạt ngụ cho nẩy mầm sau đú thu mầm ngụ tỏch DNA tổng số. Để hạn chế sự phõn hủy DNA, việc tỏch chiết DNA đƣợc tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế sự hoạt động của cỏc enzyme này. Do vậy, trƣớc khi nghiền mẫu, cối và chày sứ đƣợc giữ trong tủ lạnh – 70oC. Mẫu sau đú đƣợc nghiền trong nito lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn. Mẫu đƣợc hũa tan trong dung dịch đệm chiết (gồm cỏc chất: SDS, Tris – HCl, EDTA, NaCl). Hỗn hợp dung dịch đệm này sẽ phỏ vỡ màng tế bào và màng nhõn, đồng thời giải phúng DNA ra mụi trƣờng. Thành phần SDS trong đệm chiết khụng những cú tỏc dụng phỏ vỡ tế bào mà cũn cú vai trũ