Hiện nay cú một số phƣơng phỏp chuyển gen nhƣ: Chuyển gen trực tiếp bằng phƣơng phỏp sỳng bắn gen, chuyển gen bằng phƣơng phỏp vi tiờm, chuyển gen giỏn
tiếp thụng qua vi khuẩn A. tumefaciens. Thụng dụng vẫn sử dụng phƣơng phỏp chuyển gen thụng qua vi khuẩn A. tumefaciens. Với mục đớch sử dụng phƣơng phỏp chuyển gen thực vật thụng qua A. tumefaciens, chỳng tụi đó tiến hành chuyển pCB301 + Sus1 + cryIA(c) vào chủng A. tumefaciens C58 (pGV2260).
Cỏc vector tỏi tổ hợp cú thể đƣợc chuyển vào A. tumefaciens bằng phƣơng phỏp trực tiếp nhƣ xung điện hay bằng phƣơng phỏp giỏn tiếp nhƣ phƣơng phỏp phối ba (Tri – parental mating method) Trong đú, phƣơng phỏp xung điện là phƣơng phỏp hiệu quả, cú thời gian thớ nghiệm ngắn (từ 2 - 3 ngày) trong khi phƣơng phỏp phối ba cần 4 - 7 ngày với cỏc thể sau biến nạp hoàn toàn khụng cú khả năng bị nhiễm cỏc tế bào E.
coli nhƣ vẫn xảy ra ở phƣơng phỏp phối ba nờn đƣợc chỳng tụi sử dụng để tạo chủng A. tumefaciens. Để cú tế bào khả biến A. tumefaciens dựng cho xung điện, chỳng tụi đó
tiến hành nuụi cấy lại cỏc chủng trờn mụi trƣờng thạch đặc YEP, sau đú nuụi lắc trong 2ml mụi trƣờng LB trong khoảng 6 giờ ở 29o
C. Dịch vi khuẩn này (100àl) đƣợc tiếp tục nuụi qua đờm trong 100ml mụi trƣờng LB cú bổ sung Amp, Kan, Spec. Tế bào khả biến chủng A. tumefaciens C58 và LBA+ Kan + spec cú bổ sung 1μl pCB301 + Sus1 +
cryIA(c) (đối với mẫu thớ nghiệm) đƣợc chỳng tụi xử lý bằng xung điện ở điều kiện
25àF; 400Ω; 2,5kV; 8 - 10ms. Sau khi xung điện, mẫu đƣợc bổ sung ngay 1ml mụi trƣờng SOC, lắc ở 29oC trong 2 giờ và cấy trải trờn đĩa petri chứa cỏc mụi trƣờng chọn lọc thớch hợp: LB + spec 50àg/ml. Tƣơng tự cỏc mẫu đối chứng khụng bổ sung
pCB301 + Sus1 promoter + cryIA(c) cũng đƣợc xung điện và cấy trải trờn đĩa petri chứa mụi trƣờng LB cú bổ sung Spec + Amp + Kan. Kết quả biến nạp cho thấy tế bào khả biến A. tumefaciens chủng C58 mọc rất tốt cũn đối chứng khụng mọc.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Cỏc khuẩn lạc A. tumefaciens cú chứa plasmid tỏi tổ hợp đƣợc chỳng tụi phỏt hiện bằng phƣơng phỏp tỏch chiết DNA plasmid hỡnh 3.12 sau đú để khẳng định chắc chắn chỳng tụi tiến hành PCR sản phẩm tỏch A. tumefaciens.
Hỡnh 3. 12: Sản phẩm tỏch DNA từ A. Tumefaciens
MK: Maker; Đ/C: Đối chứng Agrobacterium ko chứa đoạn chốn; 1, 2, 3 Agrobacterium chứa vector pCB301 + Sus1 + cryIA(c)
Để khẳng định chắc chắn chỳng tụi tiến hành PCR sản phẩm tỏch A. tumefaciens với cặp mồi ZSus - PstIF và ZSus - NcoIR. Kết quả đƣợc thể hiện ở (hỡnh
3.13). cho thấy chỳng tụi đó tạo ra chủng A. Tumefaciens chứa vector pCB301 mang Sus1 promoter và gen cryIA(c).
M 1
1,0kb 1,2kb
1,5kb
kb
Hỡnh 3.13: Sản phẩm PCR từ chủng A. Tumefaciens với cặp mồi Zsuc - PstIF và Zsuc -NcoIR
M: Maker, 1: Sản phẩm PCR từ A. Tumefaciens
Với việc phõn lập đƣợc đoạn Sus1 promoter từ dũng ngụ Q411 của Việt Nam, chỳng tụi đó chủ động đƣợc nguồn nguyờn liệu về promoter cần thiết cho cỏc
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
nghiờn cứu chuyển gen sau này, đặc biệt khi cú nhu cầu cần biểu hiện tớnh trạng mong muốn ở cỏc tế bào phloem. Việc biểu hiện gen ngoại lai trong cõy trồng sẽ đƣợc thuận lợi hơn khi gen đú đƣợc điều khiển bới chớnh promoter cú cựng nguồn với cõy đƣợc chuyển gen. Vỡ vậy, cấu trỳc pCB301 + Sus1 + cryIA(c) đƣợc tạo ra cú Sus1 promoter đƣợc phõn lập từ ngụ sẽ rất cú giỏ trị cho việc biểu hiện gen
cryIA(c) ở cõy ngụ chuyển gen. Ngoài ra, cấu trỳc này vẫn cú thể sử dụng đƣợc
trong cỏc nghiờn cứu chuyển gen nhằm tăng cƣờng khả năng khỏng sõu cho cỏc cõy trồng khỏc. Nhƣ đó đề cập, đoạn gen cryIA(c) trong nghiờn cứu cú gắn với trỡnh tự mó húa cho đoạn peptide cmyc nờn cũng thuận lợi cho việc kiểm tra sự điều khiển của Sus1 promoter đối với sự biểu hiện của gen cryIA(c) trong cõy chuyển gen bằng lai western với khỏng thể khỏng cmyc. Nhƣ vậy, việc phõn lập đƣợc Sus1 promoter từ cõy ngụ và thiết kế đƣợc vector pCB301 + Sus1 + cryIA(c) đó tạo đƣợc nguồn nguyờn liệu cú giỏ trị cho cỏc nghiờn cứu chuyển gen cho cõy trồng.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
Từ cỏc kết quả nghiờn cứu thu đƣợc chỳng tụi đƣa ra một số kết luận nhƣ sau:
1. Đó phõn lập đƣợc Sus1 promoter từ dũng ngụ Q411 của Việt Nam và xỏc định đƣợc trỡnh tự của Sus1 promoter với kớch thƣớc 1116 bp với cỏc hộp TATA ở vị trớ - 55 và hộp CCAAT ở vị trớ - 136 so với vị trớ khởi đầu dịch mó và cú độ tƣơng đồng là 100% so với trỡnh tự MZESUS1 đó đƣợc cụng bố trờn Ngõn hàng gen quốc tế.
2. Đó thiết kế đƣợc vector biểu hiện thực vật pCB301 + Sus1 + cryIA(c) mang Sus1 promoter và gen cryIA(c).
3. Đó tạo đƣợc chủng A. tumefaciens C58 (pGV2260) mang vector
pCB301+Sus1+cryIA(c) phục vụ cho việc chuyển gen khỏng sõu vào ngụ và cỏc cõy trồng khỏc ở Việt Nam.
Đề nghị
Kiểm tra sự biểu hiện của gen cryIA(c) dƣới sự điều khiển của Sus1
promoter trờn cõy mụ hỡnh.
Tiến hành chuyển gen cryIA(c) dƣới sự điều khiển của Sus1 promoter vào
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Chu Hoàng Hà, Phạm Thị Võn, Lờ Trần Bỡnh (2009), Tạo cõy trồng chuyển gen khỏng vi rus bằng kỹ thuật RNAi, Hụi nghị Quốc gia về Sinh vật biến đổi gen và Quản lý an toàn sinh học, 2009, pp, 19 – 28.
2. Lờ Thị Thu Hiền, (2003), “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang gen khỏng cụn trựng để chuyển vào cõy trồng” Luận ỏn tiến sỹ Sinh học, Viện Cụng nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam.
3. Lờ Thị Thu Hiền, Nguyễn Thựy Dƣơng, Đào Thị Thu Hà, Huỳnh Thị Thu Huệ, Lờ Trần Bỡnh, Nụng Văn Hải (2004) “Thiết kế vector thế hệ mới mang gen khỏng cụn trựng cryIA(c) để chuyển vào cõy trồng, “ Tạp chớ Cụng nghệ Sinh học 2 (1): 85-92.
4. Lờ Thị Thu Hiền, Nguyễn Hải Hà, Đào Thị Thu Hà, Vũ Hải Chi, Nguyễn Viết Cƣờng, Nụng Văn Hải “Phõn lập và xỏc định trỡnh tự đoạn điều khiển của gen tổng hợp đƣờng (Rsuc1 – promoter) từ cỏc giống lỳa Việt Nam”, Tạp chớ Cụng
nghệ sinh học số 5 (1): 57 – 67, 2007.
5. Lờ Thị Thu Hiền, Trần Thị Phƣơng Liờn, Nụng Văn Hải (2007) “Promoter và ứng dụng trong cụng nghệ gen thực vật” Tạp chớ Cụng nghệ sinh học.
6. Trần Thị Cỳc Hũa, “Tạo dũng đậu tương biến đổi gen khỏng sõu và chịu hạn”, Cần Thơ, 2007.
7. Huỳnh Thu Huệ, Trần Thị Ngọc Diệp, Lờ Thị Thu Hiền, Nụng Văn Hải. (2008) “Thiết kế vector và kiểm tra biểu hiện của gen CryIA(c) trờn cõy thuốc lỏ Nicotiana Benthamiana”, Tạp chớ Cụng nghệ sinh học số 6 (4): 1-6.
8. Vừ Thị Thƣơng Lan, (2006), “Giỏo trỡnh sinh học phõn tử tế bào và ứng dụng“,
NXB Giỏo dục, Hà Nội
9. Đặng Trọng Lƣợng, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (2001), “Nghiờn cứu chuyển gen cryIA(c) khỏng sõu vào một số giống cải bắp (Brassica oleracea var capitata) thụng qua Agrobacterium”, Kết
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
quả nghiờn cứu khoa học 1999 – 2000, Viện di truyền Nụng Nghiệp, Nhà xuất bản Nụng Nghiệp, Hà Nội, pp. 120 – 128.
10.Tạ Kim Nhung, (2009), “Nghiờn cứu khả năng tiếp nhận gen khỏng sõu (CryIAc) của một số dũng ngụ Việt Nam thụng qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, luận văn Thạc sỹ khoa học, Trường Đại học khoa học tự nhiờn – Đại học Quốc gia Hà Nội.
11.Mai Trƣờng, Nguyễn Hữu Hổ, Lờ Tấn Đức, Nguyễn Thị Thanh, Nguyễn Văn Uyển (1998), “Bƣớc đầu chuyển gen Bar, gusA và, cryIA(c) vào cõy đậu xanh (Vigna radiata L.) nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”, Hội nghị toàn quốc lần thứ nhất về cụng nghệ sinh học cõy vào cõy lỳa, pp.86-87.
Tài liệu tiếng anh
12. Adamczyk J. J, Mahaffey J.S.(2008), “Efficacy of Vip3A and cryIAb transgenic trait in cotton against various lepidopteran pests”, Fla Entomol, 91(4), pp.570 – 575.
13. Balk, P. A, De Boer, A. D (1999), Rapid stalk elongation in tulip (Tulipa
gesneriana L. cv. Apeldoorn) and the combined action of cold-induced invertase
and the water - channel protein gammaTIP. Planta 209, 346 - 354.
14.Barton MK, Schedl TB and Kimble J .1987. Gain - of - function mutations of fem-
3, a sex-determination gene in Caenorhabditis elegans. Genetics, 115, pp. 107–119.
15. Becker C, Shutov AD, Nong Van Hai, Senyuk VI, Jung R, Horstmann C, Fischer J, Nielsen NC, Muntz K (1995) Purification, cDNA cloning and characterization of proteinase B - an asparagine - specific endopeptidase. Eur J Biochem 228: 456-463.
16.Berger B. R. Christie P. J. (1994) “Genetic complementation analys of the
Agrobacterium tumefaciens virB operon: virB2 throught virB11 are essential
virulence genes”. Bacteriol(176), pp. 3646-3660.
17.Bergvinson D. J, Arnason J. T, Mihm J. A, and Jewel D. C. 1997. Phytochemical basis for multiple borer resistance in maize. In Insect Resistant Maize: Recent Advances and Utilization. Proceedings of an international symposium, 27
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
18.Birich R.G., (1997), "Plant transformation: problems and strategies for practical application", Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol.48: 297-326.
19. Brock T.D., Madigan M.T., (1991), “Biology of microorganisms, Prentice-Hall
International Editionas”, pp. 301-302, pp. 663-666.
20.Buchanan C.D., Klein P.E., Mullet J.E.(2004), “Phylogenetic analysis of 5’ – noncoding region from the ABA – responsive rab 16/17 gene family of sorghum, maize and rice provides insight into the composition, organization and function of cis – regulatory modules”, Genetớc 168: 1639 – 1654.
21. Carlson S. J, Chourey P. S. (1996). Evidence for plasma membrane-associated forms of sucrose synthase in maize. Mol Gen. Genet. 252, 303-310.
22. Carlson, S. J, Chourey, P.S., Helentjaris T, Datta, R. (2002). Gene expression studies on developing kernels of maize synthase (SuSy) mutants show evidence for a third SuSy gene. Plant Mol. Biol. 49, 15-29.
23.Chen, Y. C. Chourey, P.S. (1989). Spatial and temporal expression of the two sucrose synthase genes in maize: immunohistilogical evidence. Theor Appl Gene 78, 553-559.
24. Cheng X, Sardana R, Kaplan H, Altosaar I (1998) Agrobacterium - transformed rice plants expressing synthettic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxin to
stript stem borer and yellow stem borer. Proc Natl Acad Sci USA 95: 2767-2772.
25. Cheng, W. H., and Chourey, P. S. (1999). Genetic evidence that invertase- mediated release of hexoses is critical for appropriate carbon partitioning and normal seed development in maize. Theor. Appl. Genet. 98, 485-495.
26. Crickmore N., zeigler D.R., Feitelson J., (1998) “Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins”. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, p.p 807-813.
27.Datta K., Vasquez A., Tu J., Torrzo L., Alam M.F., Oliva N., Abrigo E., Khush G.S., Datta S.K. (1998), “Constitutive and tissue – specific differential expression of the cryIA(b) gene in transgenic rice plants conferring resistance to rice insect pest”, Theor Appl Genet 97: 20 – 30.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
28.Delisle A.J., Ferl R.J. (1990), “Characterization of the Arabidopsis Adh G – box – binding factor”, The plant Cell 2(6): 547 – 557.
29.Dively G.P.(2005),”Impact of transgenic vip3A x cryIAb lepidopteran –
resistant filed corn on the nontarget arthropod community”, Environ Entomol, 34(5), pp. 1267 1291.
30.Ellis J.G., Lewellyn D.J., Dennis E.S., Peacock W.J. (1987), “Maize Adh – 1promoter sequences control anaerobic regulation: addition of upstream promoter elements from constitutive genes is necessary for expression in tobacco”, EMBO J6: 11- 16.
31.Ferres J., Van Rie J.(2002), “Biachemistry and genetics of insect resistance to Bacillus thuringiensis”, Annu Rev Entomol, 47, pp. 501- 533.
32.Fluhr R., Kuhlemeier C., Nagy F., Chua N.H. (1986), “Organ specific and light – induced expression of plant genes”, Science 232: 1106 – 1112.
33. Geiser, M., Weck, E., Doring, H. P., Werr, W., Courage-Tebbe, U., Tillmann, E., and Starlinger, P. (1982). Genomic clones of a wild-type allele and a transposable element-induced mutant allele of the sucrose synthase gene of Zea
mays L. EMBO J. 1, 1455-1460.
34.Gustavo A., Cabrera J., (1998b) “The Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, Plant Cell Report (26), pp. 1-11
35. Heinlein, M. and Starlinger, P. (1989). Tissue- and cell-specific expression of the two sucrose synthase isozymes in developing maize kernels. Mol. Gene Gene. 215, 441-446.
36. Holtgraewe, D.L., Scholz, A., Altmann, B.And Winter, H. (2002). Zeo mays
sucrose synthase 3 mRNA, complete cds.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/Nucleotide, last accessed June 15, 2004.
37. Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. (1992) “Agrobacterium and plant genetic
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
38. Huang, X. F., Nguyen-Quoc, B., Chourey, P. S., and Yelle, S. (1994). Complete nucleotide sequence of the sucrose synthase 2 cDNA of maize. GenBank Accession Number L22296.
39.Ishida K, Nakayama T and Hara Y. 1996. Taxonomic studies on the Chlorarachniophyta. II. Generic delimitation of the chlorarachniophytes and description of Gymnochlora stellata gen. et sp. nov. and Lotharella gen. nov.
Phycological Research 44(1), pp.37-45.
40. Khanna H., Becker D., Kleidon J., Dale J., (2004), “Centrifugation assisted
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (CAAT) of embryogenic
cell suspensions of banana“, Molecular Breeding 14(3): pp. 239-252
41. Koch, K.E., Xu, J., Duke, E.R., McCarty, D.R., Yuan, C-X., Tan, B.-C., and Avigne, W.T. (1995). Sucrose provides a long distance signal for coarse control of genes affecting its metabolism. In: H.G. Pontis, G. Salerno and E. Echeverria (Eds.) Sucrose Metabolism, Biochemistry, Physiology, and Molecular Biology, American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, pp. 266–277.
42. Koch, K. E., Wu, Y., and Xu, J. (1996). Sugar and metabolic regulation of genes for sucrose metabolism: potential influence of maize sucrose synthase and soluble invertase responses on carbon partitioning and sugar sensing. J. Exp. Bot. 47, 11791185.
43.Koch, K.E., Zeng, Y. Wu, Y., and Avigne, W.T (2000). Multiple paths of sugar- sensing and a sugar/oxygen overlap for genes of sucrose and ethanol metabolism. J. Exp. Bot. 51, 417-427.
44. Komatsu, A., Moriguchi, T., Koyama, K., Omura, M., and Akihama T. (2002). Analysis of sucrose synthase genes in citrus suggests different roles and phylogenetic relationships. J. Exp. Bot. 53, 61-71.
45.Le Thi Thu Hien, Lam Dai Nhan, Kieu Huu Anh, Nong Van Hai, Le Tran Binh (2002), “Construction of Agrobacterium tumefaciens strỏin carrying Bt
pesticidal genes”, Adv Nat Sci, 32(2),pp.175 – 180.
46.Lee M.K., Walters F.S., Hart H., Palerkar N., Chen J.S.(2003), “The mode of action of the Bacillus thuringgenesis vegetative insecticidal protein Vip3A
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
differs from that of CryIAb delta – endotoxin”, Appl Environ Mỉcobiol, 68 (8), pp.4648 – 4657.
47.Lewin B,(2004), Gene VIII, Oxford Univerity Pres, Oxford – New York – Tokyo.
48.Maqbool S.B, Riazuddin S, Loc N.T, Gatehouse A.M, Gatehouse J.A., Christou P.(2001), “Expression of multiple ensecticidal genes confers broad resistance against a range of different rice pets”, Mol Breed, 7(1),pp.85 – 93.
49. Marana C, Gracia-Olmedo, F, and Carbonero, P. (1988). Linked sucrose synthase genes in group - 7 chromosomes in hexaploid wheat (Triticum aestivum
L.). Gene 63, 253-260.
50. Marana, C, Garcia-Olmedo, F, and Carbonero, P. (1990). Differential expression of two types of sucrose synthase - encoding genes in wheat in response to anaerobiosis, cold shock and light. Gene 88, 167 - 172.
51. McCarty, D. R., Shaw, J. R., and Hannah, L. C. (1986). The cloning, genetic mapping, and expression of the constitutive sucrose synthase locus of maize. Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 9099 - 9103.
52. McClintock, B. (1931). The order of the genes C, Sh and Wx in Zea mays with reference to a cytologically known point in the chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 17, 485-491.
53. McClintock, B. (1956) Mutation in maize. Carnegie Institute of Washington Yearbook. 55, 323 - 332.
54. McCormick, S., Mauvais, J., and Fedoroff, N. (1982). Evidence that the two sucrose synthetase genes in maize are related. Mol. Gen. Genet. 187, 494 - 500.
55.Narasimhulu SB, Deng XB, Sarria R, Gelvin SB. 1996. Early transcription of
Agrobacterium T-DNA genes in tobacco and maize. Plant Cell 8: pp. 873–886
56.Negrotto D, Jolley M, Beer S, Wenck AR, Hansen G. 2000. The use of phosphomannose-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation. Plant Cell Rep 19: pp. 798 – 803.
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
57. Nolte, K. D, Hendrix, D. L, Radin, J. W, and Koch, K. E. (1995). Sucrose synthase localization during initiation of seed development and trichome differentiation in cotton ovules. Plant Physiol. 109, 1258-1293.