Nhằm mục đớch tỏch dũng và xỏc định trỡnh tự đoạn Sus1 promoter, chỳng tụi đó tiến hành gắn sản phẩm PCR sau khi đó tinh sạch vào vector pJET/1.2. Sử dụng bộ húa chất GeneJET TM PCR cloning Kit. Ƣu điểm của việc sử dụng Kit này thao tỏc đơn giản, tiện lợi, nhanh và hiệu quả cao.
Vector pJET/1.2 cú chứa điểm khởi đầu sao chộp rep (pMB1) nờn cú khả năng sao chộp độc lập với hệ gen của tế bào chủ E.coli. Gen khỏng Amp cú trờn vector cho phộp chọn lọc những tế bào cú mang vector này trờn mụi trƣờng cú Amp. Ngoài ra, trờn vựng MCS cú chứa điểm nhận biết của cỏc enzyme giới hạn nhƣ:
XhoI, XbaI, BamHI…kế tiếp nhau giỳp dễ dàng thao tỏc lắp ghộp, thu lại và kiểm
tra đoạn chốn vào. Cuối cựng, hai trỡnh tự mồi pJET/1.2 xuụi và ngƣợc nằm về hai phớa của điểm gắn sản phẩm PCR tạo điều kiện thuận lợi cho việc xỏc định trỡnh tự gen. pJET/1.2 lại là vector tỏch dũng đầu bằng nờn cỏc sản phẩm PCR đầu bằng đƣợc loại đầu bằng trƣớc khi thực hiện phản ứng ghộp nối với vector pJET/1.2 bằng phản ứng:
Phản ứng loại đầu bằng: Sản phẩm PCR bổ sung 1 àl non purified PCR product sau đú vontex 3 - 5s. Đƣa vào mỏy PCR ủ ở nhiệt độ 70oC trong 10 - 15 phỳt.
Sau khi đó loại đầu bằng tiến hành phản ứng ghộp nối sản phẩm PCR vào 1àl vector pJET/1.2 và 1àl enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm của phản ứng nối ghộp sẽ đƣợc đem biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Cỏc tế bào này sau đú
đƣợc nuụi cấy trờn mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung Amp (50ng/ml) ở 37oC qua đờm. Kết quả chỳng tụi thu đƣợc rất nhiều khuẩn lạc là cỏc dũng tế bào vi khuẩn cú mang plasmid. Để xỏc định plasmid cú mang đoạn DNA cần tỏch dũng chỳng tụi tiến hành tỏch chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra.
Để tỏch chiết DNA plasmid, chỳng tụi tiến hành lựa chọn một số khuẩn lạc đơn cấy trong mụi trƣờng LB lỏng cú bổ sụng Amp (50ng/ml) ở nhiệt độ 37o
C trong 12 - 14 giờ. Cỏc tế bào trong dịch nuụi đƣợc thu nhận lại bằng cỏch li tõm thu tủa ở
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
6000v/p trong 8 phỳt. Sau đú đƣợc xử lý bằng dung dịch Sol I (cú tỏc dụng rửa sạch tế bào); tiếp đú là dung dịch Sol II cú chứa NaOH và SDS. Phỏ vỡ cấu trỳc tế bào cựng nhƣ cỏc liờn kết hydro trong phõn tử. SDS cựng với EDTA trong dung dịch Sol II cũn cú vai trũ ức chế cỏc nuclease do EDTA liờn kết với cỏc ion Mg2+ (yếu tố cần thiết cho hoạt động của cỏc nuclease) vỡ vậy ngăn khụng cho cỏc nuclease phõn giải DNA trong quỏ trỡnh tỏch chiết. Tế bào E.coli cú chứa hai dạng DNA: DNA
nhiễm sắc thể của E.coli và DNA plasmid nờn việc tỏch riờng làm sạch plasmid rất quan trọng. DNA plasmid đƣợc tỏch riờng dựa trờn sự khống chế thời gian xử lý cỏc dung dịch I, II, III. DNA nhiễm sắc thể cú kớch thƣớc phõn tử lớn lại liờn kết chặt chẽ với protein trong phức hợp nucleoprotein nờn khoảng thời gian ngắn khụng kịp thoỏt ra ngoài. Trong khi đú, cỏc phõn tử DNA plasmid mạch vũng đó đƣợc giải phúng vào mụi trƣờng. Khi mụi trƣờng đƣợc xử lý tiếp với dung dịch III thỡ pH mụi trƣờng trở về khoảng acid yếu gần với điểm đẳng điện của DNA. Vỡ vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và đƣợc tỏch ra một cỏch rễ dàng nhờ ly tõm. Sau đú cỏc sản phẩm DNA plasmid đƣợc kiểm tra kớch thƣớc sơ bộ bằng phƣơng phỏp điện di trờn gel agarose 0,8% (hỡnh 3.3).
ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Hỡnh 3.3. Điện di sản phẩm tỏch plasmid chọn dũng trong vector pJET 1.2/blunt
ĐC: Đối chứng; 1-16 cỏc dũng plasmid
Theo lý thuyết, cỏc plasmid mang đoạn đoạn gen ngoại lai sẽ cú kớch thƣớc lớn hơn plamid đối chứng (khụng đƣợc chốn thờm đoạn DNA). Do vậy độ cao thấp của cỏc băng so với đối chứng là cơ sở dự đoỏn dũng nào đó đƣợc chốn đoạn DNA
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
ngoại lai. Kết quả trờn hỡnh cho thấy dũng 4 và dũng 11 cao hơn đối chứng. Nhƣ vậy cú thể kết luận sơ bộ là cỏc dũng này đó chốn thờm đoạn DNA ngoại lai.
Để khẳng định chớnh xỏc dũng plasmid tỏi tổ hợp số 4 cú mang đoạn Sus1 prmoter hay khụng, chỳng tụi tiến hành sử dụng dũng plasmid tỏi tổ hợp 4 làm khuụn để nhõn đoạn Sus1 promoter với cặp mồi đặc hiệu Sus - F2 và Sus - R. Kết quả PCR đƣợc điện di kiểm tra trờn gel agarose 0,8%. Sản phẩm PCR xuất hiện băng với kớch thƣớc khoảng 1,2 kb đỳng với kớch thƣớc đoạn Sus1 promoter cần nhõn (hỡnh 3.4). M 1 6,0 3,0 2,0 1,0 1,2 kb A
Hỡnh 3.4 : Sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter từ vector pJET 1.2/blunt
M: Thang DNA chuẩn 1kb; 1: Sản phẩm PCR Sus1 promoter Sus1
Mặt khỏc, để kiểm tra kớch thƣớc thực tế của đoạn DNA đƣợc nối ghộp vào vector, chỳng tụi tiến hành phõn tớch cỏc mẫu DNA plasmid trờn bằng phƣơng phỏp xử lý với enzyme giới hạn. Vector pJET/1.2 cú chứa đoạn nhận biết của enzyme
PstI ở phớa bờn trỏi và điểm nhận biết enzyme NcoI ở phớa bờn phải của vị trị ghộp
nối gen. Mặt khỏc, bản đồ xử lý enzyme giới hạn của đoạn Sus 1 promoter đó đƣợc cụng bố. Kết quả phõn tớch trờn hỡnh cho thấy sản phẩm xử lý enzyme dũng 4 cú một băng kớch thƣớc xấp xỉ 3 kb (tƣơng đƣơng với kớch thƣớc vector pJET/1.2 và một băng cú kớch thƣớc xấp xỉ 1,2 kb (tƣơng đƣơng với kớch thƣớc sản phẩm PCR). Nhƣ vậy, chỳng tụi kết luận đó chọn đƣợc một dũng plasmid tỏi tổ hợp mang đoạn
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
gen phự hợp với kớch thƣớc của sản phẩm PCR Sus1 promoter của ngụ (Hỡnh 3.5). Dũng plasmid này đƣợc tinh sạch từ gel phục vụ cho việc xỏc định trỡnh tự.
Hỡnh 3.5: Kiểm tra cỏc plasmid trong vector chọn dũng pJET1.2/blunt tỏi tổ hợp chứa đoạn Sus1 promoter bằng enzyme PstI và NcoI
M: Thang DNA chuẩn 1kb, ĐC: pJET1.2 mở vũng, 1: pJET1.2 chứa đoạn Sus1 promoter. Nhƣ vậy, cú thể thấy rằng sản phẩm PCR nhõn đoạn Sus1 promoter đó đƣợc tỏch dũng trong vector pJet1.2/blunt.