Là phƣơng phỏp tổng hợp lƣợng lớn ADN in vitro trờn cơ sở mẫu khuụn. Quỏ trỡnh tổng hợp DNA kộo dài mồi dựa trờn nguyờn tắc bắt cặp đặc hiệu của cỏc đoạn DNA cú trỡnh tự bổ sung và khả năng kộo dài chuỗi của enzyme bền nhiệt (phổ biến là Taq polymerase – phõn lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus). PCR gồm một chuỗi nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ cú ba bƣớc: biến tớnh, gắn mồi, kộo dài chuỗi. Kết quả, sau khoảng 2 - 3 giờ, lƣợng ADN sẽ khuếch đại lờn khoảng 200 – 500 lần.
PCR tự mồi: Là một trong cỏc kỹ thuật phỏt triển từ PCR. Đõy là phản ứng sử
dụng cặp mồi dài cú trỡnh tự DNA gối lờn nhau để tiến hành tổng hợp kộo dài về hai
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
nhằm tạo điều kiện cho cặp mồi bắt cặp chộo với nhau và kộo dài. Sự bắt cặp chộo tƣơng đồng và kộo dài của cỏc đoạn đƣợc tiếp tục diễn ra ở cỏc chu kỳ sau: Sản phẩm của lần PCR tự mồi này đƣợc dựng làm khuụn cho phản ứng PCR tiếp theo nhằm tăng số bản sao mong muốn. Toàn bộ quỏ trỡnh cú thể lặp lại cho đến khi đạt đƣợc kết quả tốt nhất.
Thành phần phản ứng:
Một mẫu phản ứng PCR đƣợc tiến hành trong tổng thể tớch 25àl gồm cỏc thành
phần nhƣ sau:
Nhõn gen bằng kỹ thuật PCR sử dụng khuụn là sản phẩm của phản ứng của phản ứng PCR. Giai đoạn này gồm 30 chu kỳ trải qua cỏc bƣớc sau:
Bƣớc 1: Biến tớnh sợi DNA khuụn ở 940
C trong 4 phỳt (cắt đức liờn kết hydro
làm ruỗi hai mạch kộp).
Bƣớc 2: Biến tớnh DNA, tỏch thành hai sợi đơn ở 940C trong 30 giõy. Bƣớc 3: Gắn mồi trờn sợi khuụn ở 640C trong 40 giõy
Bƣớc 4: Tổng hợp, kộo dài chuỗi ở 720
C trong 30 giõy.
Bƣớc 5: Lặp lại 30 lần từ bƣớc 2 - 4.
Phản ứng kết thỳc ở 720C trong 7 phỳt và ủ mẫu ở 40C.