Trờn cơ sở vector trung gian pRTRA7/3 đó đƣợc thiết kế chứa gen
cryIA(c), đoạn Sus1 promoter đƣợc phõn lập trong nghiờn cứu này đƣợc chuyển
vào để thay thế 35S promoter. Trong vector trung gian đó cú mang kết cấu biểu hiện chứa cỏc vựng trỡnh tự nhƣ 35S promoter, signal peptide hƣớng protein vào lƣới nội chất, gen cryIA(c), vựng mó húa cho chuỗi peptide cmyc - KDEL liền kề với vựng terminator [1].
Chỳng tụi đó thiết kế thờm một cặp primer cú treo cỏc điểm cắt của enzyme PstI và NcoI là Zsus - PstIFvà Zsus - NcoIR để thớch hợp cho việc chuyển vào vector trung gian pRTRA7/3 đó đƣợc thiết kế chứa gen cryIA(c) và thay thế 35S promoter. Cỏc
bƣớc tiến hành thớ nghiệm đƣợc thực hiện theo sơ đồ thiết kế ở Phụ lục 1.
Trƣớc tiờn, đoạn Sus1 promoter đƣợc PCR lại với cặp mồi Zsus - PstIF và
Zsus - NcoIR từ khuụn là vector pJet1.2 tỏi tổ hợp. Sản phẩm PCR và vector
pRTRA7/3 chứa gen cryIA(c) đƣợc cắt bằng PstI và NcoI và tinh sạch qua cột. Sau đú, tiến hành ghộp nối hai sản phẩm cắt này với nhau trong phản ứng lai dƣới sự xỳc tỏc của T4 DNA ligase. Bƣớc này nhằm mục đớch loại bỏ đoạn 35S promoter và gắn đoạn Sus1 vào vector pRTRA7/3 chứa gen cryIA(c).
Sản phẩm tỏch plasmid đƣợc chọn dũng trong vector pJET1.2/blunt chỳng tụi tiến hành cắt lƣợng lớn (50μl) bằng PstI và NcoI. Tinh sạch thu đoạn 1,2 kb, lai với vector pRTRA biến nạp vào E.coli DH5α và tiến hành chọn dũng.
Cỏc tế bào này sau đú đƣợc nuụi cấy trờn mụi trƣờng LB đặc cú bổ sung Amp (50ng/ml) ở 37oC qua đờm. Kết quả chỳng tụi thu một số khuẩn lạc là dũng tế bào cú vi khuẩn cú mang plasmid. Để xỏc định plasmid cú mang đoạn Sus1 cần chọn dũng trong vector trung gian chỳng tụi tiến hành tỏch chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra.
Sau khi tỏch plasmid chỳng tụi điện di kiểm tra trờn gel agarose nồng độ 0,8%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện ở (hỡnh 3.8).
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Đ/C 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Hỡnh 3.8: Ảnh điện di đồ cỏc plasmid tỏi tổ hợp trong vector pRTRA7/3
Đ/C: Đối chứng; 1 - 16: Cỏc dũng plasmid
Theo lý thuyết, cỏc plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ cú kớch thƣớc lớn hơn plasmid đối chứng (khụng đƣợc chốn thờm đoạn DNA). Do vậy độ cao thấp của cỏc băng so với đối chứng là cơ sở dự đoỏn dũng nào đó đƣợc chốn đoạn DNA ngoại lai. Kết quả trờn hỡnh cho thấy chỉ cú dũng số 4 cao hơn đối chứng. Nhƣ vậy cú thể kết luận sơ bộ là cỏc dũng này đó chốn thờm đoạn DNA ngoại lai.
Để khẳng định Sus1 promoter đó gắn vào pRTRA7/3 chỳng tụi tiến hành PCR dũng số 4 bằng cặp mồi ZSus - PstIF và ZSus - NcoIR. Kết quả PCR đƣợc
điện di kiểm tra trờn gel agarose 0,8% (hỡnh 3.9).
Hỡnh 3.9 : Sản phẩm PCR đoạn Sus1 promoter từ vector Prtra7/3
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn
Kết quả điện di sản phẩm cắt vector pRTRA7/3 bằng hai enzyme PstI. Để
kiểm tra kớch thƣớc thực tế của đoạn DNA đƣợc nối ghộp vào vector, chỳng tụi tiến hành phõn tớch cỏc mẫu DNA plasmid kể trờn bằng phƣơng phỏp xử lý với enzyme giới hạn. Vector pRTRA7/3 cú chứa đoạn nhận biết của enzyme PstI và NcoI ở phớa bờn của vị trớ ghộp nối. Kết quả phõn tớch trờn hỡnh cho thấy Hỡnh 3.7 đƣờng chạy số 1 cho thấy cú đoạn DNA 1,2 kb đó đƣợc tạo ra từ việc cắt với enzyme đó dựng để ghộp nối đoạn Sus1 promoter và vector pRTRA7/3 tỏi tổ hợp, đoạn DNA cú kớch thƣớc 4,7 kb là phần cũn lại của vector. Điều này chứng tỏ đoạn Sus1 promoter đó đƣợc chuyển vào vector pRTRA7/3 chứa gen cryIA(c). Nhƣ vậy, trong cấu trỳc này đó cú chứa Sus1 promoter và gen cryIA(c) trong kết cấu biểu hiện thể hiện ở sơ đồ thiết kế. Theo tớnh toỏn, đoạn kết cấu biểu hiện cú kớch thƣớc khoảng 3,3 kb bao gồm Sus1 promoter, đoạn signal peptide mó húa, gen cryIA(c) nối với đoạn mó húa cho
peptide cmyc - KDEL và vựng terminator (ký hiệu pRTRA + Sus1+ cryIA(c). Dũng plasmid trờn đó đƣợc xỏc định trỡnh tự nucleotide toàn bộ vựng kết cấu biểu hiện, kết quả cho thấy Sus1 promoter, trỡnh tự gen cryIA(c) nằm đỳng theo khung đọc và cỏc điểm kết nối vẫn đƣợc giữ nguyờn nờn chỳng tụi tiến hành chuyển đoạn kết cấu biểu hiện đú vào vector pCB301 (hỡnh 3.10).
Hỡnh 3.10:Kiểm tra plasmid trong vector pRTRA7/3 tỏi tổ hợp bằng enzyme PstI và NcoI
M: Marker 1kb; ĐC: Vector pRTRA7/3
+ gen cryIA(c) cắt với enzyme PstI và NcoI; 1: Vector pRTRA7/3 + gen cryIA(c) chứa Sus1 promoter cắt bằng enzyme PstI và NcoI
Số húa bởi Trung tõm Học liệu – Đại học Thỏi Nguyờn http://www.lrc-tnu.edu.vn