bước đầu nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide trong lá mãng cầu xiêm (annona muricata) trồng tại huyện tân đông phú, tỉnh tiền giang

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌCKHOA HÓA HỌC  Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhđn Khoa học BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE TRONG LÁ MÃNG CẦU XIÊM ANNONA MURICATA TRỒNG TẠ

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

KHOA HÓA HỌC



Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhđn Khoa học

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE TRONG LÁ MÃNG CẦU

XIÊM (ANNONA MURICATA)

TRỒNG TẠI HUYỆN TÂN ĐÔNG PHÚ, TỈNH

TIỀN GIANG

Nguyễn Công Đức Khóa 2010- 2014

Huế, 6/2014

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

KHOA HÓA HỌC



Khóa luận Tốt nghiệp Cử nhđn Khoa học

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE TRONG LÁ MÃNG CẦU

XIÊM (ANNONA MURICATA)

TRỒNG TẠI HUYỆN TÂN ĐÔNG PHÚ, TỈNH

TIỀN GIANG

Chuyín ngănh: Hóa Hữu cơ

Sinh viín thực hiện: Nguyễn Công Đức

Giâo viín hướng dẫn: PGS.TS Trần Thị Văn Thi

Huế, 6/2014

Lời Cảm Ơn

Những lời đầu tiên trong bài khóa luận này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến giáo viên

hướng dẫn khoa học của tôi, cô PGS.TS Trần Thị Văn

Thi đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và những giúp đỡ

của cô về cả vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Th.S.

Lê Trung Hiếu đã tận tình chỉ bảo, giúp tôi nâng cao

tay nghề cũng như rèn luyện những kĩ năng cần thiết trong cuộc sống, giúp tôi ngày một hoàn thiện và trưởng thành hơn, đỡ bỡ ngỡ trước khi bước chặng

đường khó khăn phía trước

Tôi cũng xin gởi lời cảm ơn đến anh Nguyễn Ngọc

Hưng (CH K20), bạn Lý A Phồn (Hóa K34) và các em Hóa K35 đã đồng hành cùng tôi trong suốt khoảng thời

gian làm thực nghiệm vừa qua

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa,

bộ môn Hóa Hữu cơ, phòng thí nghiệm Hóa học Ứng dụng đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận.

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến tập thể Lớp Hóa K34 đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm khóa luận Cuối cùng xin được cảm ơn gia đình, thầy cô và bạn

bè đã đồng hành cùng tôi trong suốt quãng đời sinh viên.

Huế, ngày 05 tháng 06 năm

2014

Nguyễn Công Đức

TÓM TẮT

Trong khoá luận này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết, định tính và định lượng

một số thành phần có trong cao nước chiết từ lá mãng cầu xiêm (Annona muricata).

Khảo sát số lần tinh chế polysaccharide Tiến hành phân đoạn polysaccharide thànhhomo-PS và hetero-PS và hàm lượng PS và protein trong các cao Khả năng khángoxy hoá của các phân đoạn cao PS lá mãng cầu xiêm là cao hơn so với nấm linh chiPhú Lương Bước đầu nghiên cứu cấu trúc PS của phân đoạn homo-PS

Từ khoá: Annona muricata, kháng oxy hoá, polysaccharide, homo-PS,

hetero-PS, cấu trúc PS

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ NGỮ VIẾT TẮT

MỤC LỤC

Trang

LỜI CẢM ƠN I TÓM TẮT III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ NGỮ VIẾT TẮT IV MỤC LỤC V DANH MỤC CÁC BẢNG VIII DANH MỤC CÁC HÌNH X

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 2

TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về lá mãng cầu xiêm 2

1.1.1 Giới thiệu về lá mãng cầu xiêm [31] 2

1.1.2 Đặc điểm của mãng cầu xiêm [31] 2

1.1.3 Thành phần cơ bản trong lá mãng cầu xiêm 3

1.1.4 Công dụng [31] 3

1.1.5 Hoạt tính sinh học 3

1.2 Tổng quan về polysaccharide và cấu trúc của polysaccharide trong lá MCX 4

1.2.1 Tổng quan về polysaccharide [2] 4

1.2.3 Cấu trúc của polysaccharide mãng cầu xiêm 5

1.3 Phương pháp phân đoạn polysaccharide thô bằng amonium sulfate 6

1.4 Các phương pháp xác định cấu trúc polysaccharide lá MCX 6

1.4.1 Phân tích thành phần MS 6

1.4.2 Phương pháp phổ hồng ngoại 7

1.5 Tổng quan về gốc tự do và chất kháng oxy hóa 8

1.5.1 Gốc tự do [35] 8

1.5.2 Các chất kháng oxy hóa [35] 8

CHƯƠNG 2 12

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Đối tượng nghiên cứu 12

2.1.1 Nguyên liệu 12

2.1.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 12

2.3 Phương pháp nghiên cứu 12

2.3.1 Phương pháp thu hái, định danh và xử lý mẫu 12

2.3.2 Phương pháp khối lượng để xác định độ ẩm của mẫu lá khô [2] 13

2.3.3 Phương pháp định tính các nhóm hợp chất trong mẫu lá [22] 14

2.3.4 Phương pháp chiết rắn - lỏng và phương pháp chiết lỏng - lỏng 16

2.3.5 Phương pháp định lượng 17

2.3.6 Phương pháp phân đoạn PS-protein và PS-homo [30] 18

2.3.8 Phương pháp tạo dẫn xuất của monosaccharide và phân tích bằng GC-MS để xác định tỷ lệ thành phần các monosaccharide [1] 20

2.3.9 Phổ hồng ngoại IR 21

2.3.10 Phương pháp khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa tổng cộng (Total Antioxidant Capacity) [27] 21

2.3.11 Phương pháp xử lý số liệu 22

CHƯƠNG 3 24

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Độ ẩm của mẫu lá 24

3.2 Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ trong cao nước 24

3.3 Hàm lượng các hợp chất sơ cấp trong lá mãng cầu xiêm 28

3.3.1 Hàm lượng PS 28

3.3.2 Hàm lượng protein trong lá MCX 29

3.4 Khảo sát số lần tinh chế polysaccharide 31

3.4.1 Hàm lượng PS trong cao qua các lần tinh chế 31

3.4.2 Hàm lượng protein qua các lần tinh chế 32

3.5 Hàm lượng polysaccharide trong các cao hetero-PS và homo-PS 33

3.5.1 Hàm lượng homo-PS và hetero-PS 34

3.5.2 Hàm lượng PS trong cao homo-PS và hetero-PS 34

3.6 Đánh giá khả năng kháng oxi hóa của các cao PS 36

3.6.1 Xây dựng đường chuẩn 36

3.6.1 Tổng lực kháng oxi hóa của các cao PS 37

3.6.2 Lượng chất kháng oxi hóa trong các cao PS 38

3.7 Nghiên cứu cấu trúc polysaccharide tách chiết từ lá mãng cầu xiêm 39

3.7.1 Phổ hồng ngoại IR của PS-5 39

3.7.2 Thành phần monosaccharide của polysaccharide có trong cao homo-PS 40

3.7.3 Xác định vị trí liên kết glycoside 41

KẾT LUẬN 42

KIẾN NGHỊ 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

PHỤ LỤC 1

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

BẢNG 2.1 CHƯƠNG TRÌNH NHIỆT ĐỘ PHÂN TÍCH MẪU TRÊN THIẾT

BỊ SẮC KÝ GCMS-DB 20 BẢNG 3.1 ĐỘ ẨM CỦA MẪU LÁ MÃNG CẦU XIÊM (P= 0,95; N= 3).24

BẢNG 3.2 KẾT QUẢ ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO NƯỚC 27 BẢNG 3.3 MẬT ĐỘ QUANG CỦA DUNG DỊCH D-GLUCOSE CHUẨN 28

BẢNG 3.4 TỈ LỆ CÁC LOẠI CARBOHYDRATE TRONG MẪU LÁ MÃNG CẦU XIÊM (P= 0,95 ; N= 5) 28

BẢNG 3.5 MẬT ĐỘ QUANG CỦA DUNG DỊCH ALBUMIN CHUẨN Ở CÁC NỒNG ĐỘ KHÁC NHAU SAU KHI XỬ LÝ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY 30

BẢNG 3.6 HÀM LƯỢNG PROTEIN QUY TƯƠNG ĐƯƠNG ALBUMIN TRONG CAO PS THÔ VÀ TRONG LÁ MCX (P= 0,95; N=4) 30

BẢNG 3.7 HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE TRONG CÁC CAO PS (P

=0,95) 31

BẢNG 3.8 HÀM LƯỢNG PROTEIN QUY TƯƠNG ĐƯƠNG ALBUMIN TRONG QUA CÁC LẦN TINH CHẾ (P=0,95) 32 BẢNG 3.9 HÀM LƯỢNG CAO HOMO-PS VÀ CAO HETERO-PS 34

BẢNG 3.10 HÀM LƯỢNG PS CỦA CAO HOMO-PS VÀ CAO

HETERO-PS CÓ TRONG CAO HETERO-PS-5 (P=0,95; N=4) 34

BẢNG 3.11 HÀM LƯỢNG PS VÀ PROTEIN CÓ TRONG CÁC CAO PS ( P= 0,95; N=4) 35 BẢNG 3.12 MẬT ĐỘ QUANG CỦA DUNG DỊCH ACID ASCORBIC

CHUẨN 37

BẢNG 3.13 LƯỢNG CÁC CHẤT KHÁNG OXY HÓA QUY TƯƠNG

ĐƯƠNG CHẤT CHUẨN CÓ TRONG CAO PS THÔ, PS-5, HOMO-PS VÀ HETERO-PS (P=0,95; N=4) 39

BẢNG 3.15 CÁC DẪN XUẤT MONOSACCHARIDE THU ĐƯỢC TỪ HOMO-PS 40

BẢNG 3.16 TỶ LỆ THÀNH PHẦN CÁC DẪN XUẤT

MONOSACCHARIDE CỦA HOMO-PS 40

BẢNG 3.17 CÁC DẪN XUẤT METHYL ALDITOL ACETATE

MONOSACCHARIDE THU ĐƯỢC THEO KẾT QUẢ GC-MS VÀ LIÊN KẾT GLYCOSIDE TƯƠNG ỨNG 41 BẢNG 3.18 TỶ LỆ CÁC LOẠI LIÊN KẾT GLYCOSIDE CỦA CAO HOMO- PS 41

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

HÌNH 1.1 BỘ KHUNG GALACTOMANNAN TRONG HẠT MCX 5

HÌNH 1.2 SƠ ĐỒ PHÂN ĐOẠN CÁC PS TỪ PS THÔ [30] 6

HÌNH 1.3 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN MS THEO PHƯƠNG PHÁP HPAEC-PAD 6

HÌNH 1.4 QUY TRÌNH PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN MS THEO PHƯƠNG PHÁP GC-MS 7

HÌNH 1.5 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG CỦA CHẤT CHỐNG OXY HÓA 9

HÌNH 1.6 CÔNG THỨC CẤU TẠO CỦA ACID GALLIC 9

HÌNH 1.7 CÔNG THỨC CẤU TẠO CỦA BHT 10

HÌNH 1.8 CẤU TRÚC CỦA ACID L-ASCORBIC 11

HÌNH 2.1 LÁ CÂY MÃNG CẦU XIÊM 13

HÌNH 2.2 SƠ ĐỒ CHIẾT PS TRONG MẪU LÁ MÃNG CẦU XIÊM 16

HÌNH 2.3 SƠ ĐỒ TINH CHẾ POLYSACCHARIDE TRONG LÁ MÃNG CẦU XIÊM 17

HÌNH 2.4 SƠ ĐỒ PHÂN ĐOẠN CÁC LOẠI POLYSACCHARIDE TRONG CAO POLYSACCHARIDE 18

HÌNH 2.5 QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU ĐỂ PHÂN TÍCH GC – MS 19

HÌNH 2.6 QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU PHÂN TÍCH GC-MS ĐỂ XÁC ĐỊNH LIÊN KẾT GLYCOSIDE 21

HÌNH 3.1 HÌNH ẢNH ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO NƯỚC 27

HÌNH 3.2 ĐƯỜNG HỒI QUY TUYẾN TÍNH BIỂU DIỄN SỰ PHỤ THUỘC CỦA MẬT ĐỘ QUANG VÀO NỒNG ĐỘ D-GLUCOSE CHUẨN 28

HÌNH 3.3 HÀM LƯỢNG CÁC LOẠI CARBOHYDRATE TRONG MẪU LÁ 29

HÌNH 3.4 ĐƯỜNG HỒI QUY TUYẾN TÍNH BIỂU DIỄN SỰ PHỤ THUỘC CỦA MẬT ĐỘ QUANG VÀO NỒNG ĐỘ ALBUMIN CHUẨN 30

HÌNH 3.5 HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE TRONG CÁC CAO SAU KHI TINH CHẾ 31

HÌNH 3.6 HÀM LƯỢNG PROTEIN QUY TƯƠNG ĐƯƠNG ALBUMIN QUA CÁC LẦN TINH CHẾ 33

HÌNH 3.7 TỦA HETERO-PS VÀ DUNG DICH HOMO-PS SAU KHI XỬ LÝ BẰNG AMMONIUM SULFATE 34

HÌNH 3.8 HÀM LƯỢNG PS TINH KHIẾT TRONG CÁC CÁC CAO

HOMO-PS VÀ HETERO-HOMO-PS 35

HÌNH 3.9 HÀM LƯỢNG PS VÀ PROTEIN CÓ TRONG CÁC CAO

HOMO-PS VÀ HETERO-HOMO-PS 36

HÌNH 3.10 ĐƯỜNG HỒI QUY TUYẾN TÍNH BIỂU DIỄN SỰ PHỤ

THUỘC CỦA MẬT ĐỘ QUANG VÀO NỒNG ĐỘ ACID ASCORBIC

CHUẨN 37

HÌNH 3.11 TỔNG LỰC KHÁNG OXY HÓA CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN PS TÁCH CHIẾT TỪ LÁ MÃNG CẦU XIÊM, PS NẤM LINH CHI PHÚ LƯƠNG

VÀ CHẤT CHUẨN 38 HÌNH 3.12 PHỔ IR CỦA PS-5 39

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, dược thảo thiên nhiên ngày càng đóng vai trò quantrọng trong phòng bệnh, chữa bệnh và nâng cao sức khỏe Một trong những loài câyđang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm và nghiên cứu trong những năm

gần đây là cây mãng cầu xiêm Annona muricata.

Mãng cầu xiêm được biết đến từ lâu đời với vai trò làm thực phẩm và một sốbài thuốc dân gian có khả năng chữa một số bệnh như: trị cảm, xổ mũi, tiêu chảy, tim,

…

Hóa dược hiện đại cho thấy lá mãng cầu xiêm có khả năng chữa các bệnh nhưkháng nấm, kháng khuẩn, ức chế tế bào ung thư, kháng oxi hóa,… hoạt chất tạo nênhoạt tính sinh học kỳ diệu của cây mãng cầu xiêm là polyphenol, flavonoid, alkaloid,polysaccharide, acetogennins,…[16], [17], [24], [15], [7]

Tuy nhiên, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hoạt chấttrong cây mãng cầu xiêm vẫn chưa đươc nghiên cứu nhiều Trong các thành phần đó,polysaccharide là các polymer thiên nhiên, có cấu trúc đa dạng, phức tạp và đã đượcchứng minh là có nhiều hoạt tính sinh học quý giá

Ở Việt Nam, số công trình nghiên cứu về polysaccharide trong lá mãng cầuxiêm còn rất ít Qua các tài liệu mà chúng tôi tham khảo được: chỉ tìm thấy tài liệu củaNguyễn Minh Nhung đã nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính kháng oxy hóacủa lá mãng cầu xiêm [3], trong đó có polysaccharide Tuy nhiên, chưa tìm thấy côngtrình nào nghiên cứu về cấu trúc của polysacharide trong lá mãng cầu xiêm Vì vậy,việc nghiên cứu cấu trúc của PS trong lá mãng cầu xiêm là một vấn đề không chỉ có ýnghĩa quan trọng về mặt khoa học mà còn đáp ứng nhu cầu cấp thiết về việc ứng dụng

lá mãng cầu xiêm hiện nay của xã hội

Xuất phát từ những yếu tố đó, chúng tôi chọn đề tài: “Bước đầu nghiên cứu

cấu trúc của polysaccharide trong lá mãng cầu xiêm (Annona muricata) trồng tại

huyện Tân Đông Phú, tỉnh Tiền Giang”

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về lá mãng cầu xiêm

1.1.1 Giới thiệu về lá mãng cầu xiêm [31]

Mãng cầu xiêm (danh pháp khoa học: Annona muricata) thuộc Loài A.

muricata, Chi Annona, Họ Annonaceae, Bộ Magnoliales, Giới Plantae

Các tên thông thường: Soursop (Anh-Mỹ), Guanabana, Graviola, Paw Paw(Brazilian), Corossolier (Pháp), Guanavana, Durian benggala Nangka londa

Mãng cầu xiêm là một loài cây nhiệt đới rất thường gặp trong vùng Nam Mỹ và Đông

Ấn Đây cũng là một trong những cây đầu tiên được đưa từ châu Mỹ về lục địa ‘Cựu ThếGiới’- châu Âu chúng được di thực và được trồng rộng rãi suốt từ khu vực Đông Nam TrungHoa sang đến Úc và những vùng bình nguyên tại Đông và Tây Phi châu

Ở Việt Nam, cây mãng cầu xiêm chủ yếu được trồng ở Nam Bộ và rãi rác ởNam Trung Bộ Đặc biệt được trồng nhiều tại tỉnh Tiền Giang

1.1.2 Đặc điểm của mãng cầu xiêm [31]

Mãng cầu xiêm thuộc loại tiểu mộc, cao 6- 8 m, là loại cây rất dễ trồng, có thể pháttriển được ở cả vùng nước ngọt lẫn nước lợ và cho quả sau 3 năm Mãng cầu xiêm cho trái

rộ nhất vào mùa mưa kéo dài đến tết âm lịch (từ tháng 9 đến tháng 2 năm sau)

Về hình dạng cây có các đặc điểm sau:

- Vỏ thân có nhiều lỗ nhỏ màu nâu

- Lá hình trái xoan, thuôn thành ngọn giáo, mọc so le Phiến lá có 7- 9 cặp gân phụ

- Hoa mọc đơn độc ở thân hay nhánh già, hoa có ba lá đài nhỏ màu xanh, bacánh ngoài màu xanh- vàng và ba cánh trong màu vàng Nhị và nhụy hoa tạo thành 1khối tròn

- Trái thuộc loại trái mọng kép, lớn, hình trứng phình dài 20- 25 cm, màu xanhlục hay vàng xanh, khi chín quá mức sẽ đổi sang vàng Trái có thể kết tại nhiều vị trí khácnhau trên thân, cành hay nhánh con, và có thể cân nặng đến 5 kg Vỏ rất mỏng, bên ngoài

có những nốt phù thành những múi nhỏ nhọn hay cong, chứa nhiều hạt màu đen

1.1.3 Thành phần cơ bản trong lá mãng cầu xiêm

Trong lá mãng cầu xiêm có nhiều thành phần quan trong:

- Mãng cầu xiêm được dùng làm thực phẩm tại nhiều nơi trên thế giới

- Mãng cầu xiêm (lá, rễ và hạt) được dùng làm thuốc tại rất nhiều nơi trên thếgiới, nhất là tại những quốc gia Nam Mỹ:

+ Tại Peru: lá mãng cầu xiêm được dùng làm thuốc trị cảm, xổ mũi, hạt nghiềnnát làm thuốc trừ sâu bọ, trong vùng Amazon, vỏ cây và lá dùng trị tiểu đường, giảmđau, chống co giật

+ Tại Guyana: lá và vỏ cây, điều chế thành trà giúp trị đau và bổ tim

+ Tại Ba Tây: lá nấu thành trà trị bệnh gan, dầu ép từ lá và trái còn non, trộnvới dầu olive làm thuốc thoa bên ngoài trị thấp khớp, đau sưng gân cốt

+ Tại Jamaica, Haiti và West Indies: trái hay nước ép từ trái dùng trị nóng sốt, giúpsinh sữa và trị tiêu chảy, vỏ thân cây và lá dùng trị đau nhức, chống co giật, ho, suyển

+ Tại Ấn Độ, cây được gọi theo tiếng Tamilnadu là mullu- chitta: quả dùngchống thiếu vitamin C (scorbut), hạt chống nôn mửa và làm se da

+ Tại Việt Nam: hạt nghiền nát trong nước, lấy nước gội đầu để trị chí rận Mộtphương thuốc Nam khá phổ biến để trị huyết áp cao là dùng vỏ trái hay lá mãng cầuxiêm, sắc chung với rễ nhàu và rau cần thành nước uống (bỏ bã) mỗi ngày

1.1.5 Hoạt tính sinh học

- Tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn, kháng nấm

- Hạ huyết áp, làm giãn nở mạch máu

- Gây độc tế bào và chống tế bào ung thư: Cassady (1990), Chang và cộng sự(1993) [23].

- Thuốc chống co giật: N'Gouemo và cộng sự (1997), González-Trujano vàcộng sự (1998, 2001, 2006a) [23]

- Thuốc chống côn trùng: Sookvanichsilp và cộng sự (1994)

- Thuốc chống ký sinh trùng: Bories và cộng sự (1991), Waechteret và cộng sự(1997) [23]

- Chống viêm: Orlando Vieira de Sousa và cộng sự (2010) [8]

1.2 Tổng quan về polysaccharide và cấu trúc của polysaccharide trong lá MCX

1.2.1 Tổng quan về polysaccharide [2]

1.2.1.1 Khái niệm

- Là polymer thiên nhiên thuộc nhóm carbohydrate được cấu tạo từ nhiềumonosaccharide kết hợp lại với nhau, dạng bột

- Có khối lượng phân tử lớn

- Cho màu xanh lục khi tác dụng với anthrone- acid sulfuric, và cho màu vàng

da cam khi tác dụng với phenol- acid sulfuric [5], [10]

PS được chia làm 2 loại:

1.2.1.2 PS thuần (homopolysaccharide)

PS thuần (homopolysaccharide) bao gồm 2 loại:

- Polyhomosaccharide (glycan): đây là loại PS chỉ gồm 1 loại đường đơn trongphân tử

- Polyheterosaccharide (heteroglycan): đây là loại PS được cấu tạo từ nhiều loạiđường đơn khác nhau

1.2.1.3 PS tạp (heteropolysaccharide)

PS tạp (heteropolysaccharide) bao gồm 2 loại:

- N- heteropolysaccharide: đây là loại PS hỗn tạp giữa hợp chất của đường vàcác hợp chất của nitơ

- S- heteropolysaccharide: đây là loại PS hỗn tạp giữa hợp chất của đường vàcác hợp chất của lưu huỳnh

1.2.2 Hoạt tính sinh học của polysaccharide

1.2.2.1 Hoạt tính của PS-homo

Những hợp chất có hoạt tính kháng ung thư như heteroglycan, thường là các

hợp chất tan trong nước [25]

Trong các hợp chất thiên nhiên thì polysaccharide chiết xuất từ sinh vật là cácpolymer thiên nhiên, có cấu trúc rất đa dạng, phức tạp và đã được nghiên cứu rất nhiềutrên thế giới cũng như trong nước bởi các hoạt tính sinh học quý giá của chúng như:khả năng chống ung thư, tăng tính miễn dịch, hạ đường huyết, tăng tổng hợp protein,tăng chuyển hoá acid nucleic chống oxy hóa, bảo vệ gan, chống đông cục máu, khángkhuẩn, kháng virut (kể cả virut HIV), chống nghẽn tĩnh mạch [1], [2],…

Mặc dù, polysaccharide có hoạt tính có lợi cho sức khỏe con người nhưng nếu

sử dụng với nồng độ cao có thể dẫn đến ức chế hệ thống miễn dịch của cơ thể [25]

1.2.2.2 Hoạt tính của hetero-PS

Các nhà khoa học đã chứng minh được rằng, nếu trong phân tử polysaccharide cóthêm một hoặc nhiều nhánh của protein hay sulfat thì hoạt tính sinh học của nó có thể bịthay đổi, có nhiều hoạt tính mà PS-homo không có, nhưng hetero-PS thì lại xuất hiện

PS-protein được biết đến với khả năng chống lại sự hình thành các khối u, gâyđộc cho các tế bào ung thu vú của con người ở nồng độ 200 và 100 g/mL [21], khảnăng kháng oxi hóa [6], kháng ung thư [25]

PS-sulfat có thể chữa bệnh do vius herpes gây ra-anti-HSV, [13], tăng hoạtđộng miễn dịch [11], tác dụng ức chế tế bào ung thư [26], kháng khuẩn, kháng vius, kể

cả virus HIV [4], [20], chống đông máu, chống oxi hóa [28]…

1.2.3 Cấu trúc của polysaccharide mãng cầu xiêm

Cấu trúc PS của các loại thực vật nói chung và cây mãng cầu xiêm nói riêngthuộc vào rất nhiều yếu tố: giống, điều kiện sinh trưởng và phát triển, thời gian thuhoạch, điều kiện tách chiết

Theo nghiên cứu trước đây về hạt của cây mãng cầu xiêm, cấu trúc PS hạtMCX có bộ khung galactomannan Các phân tử có chuỗi mạch chính là (1-4)-α-D-mannopyranose, các nhánh bên là các chuỗi (1-6)-α-D-galactopyranose với các tỷ lệkhác nhau Khối lượng phân tử được tìm thấy thay đổi từ 6000-17000 [14]

Hình 1.1 Bộ khung galactomannan trong hạt MCX

Các nghiên cứu gần đây cho thấy, trong lá của cây MCX cũng có chứa thànhphần polysaccharide, và nó hoạt tính sinh học [3] Hoạt tính sinh học của PS phần lớnphụ thuộc vào cấu trúc của nó Tuy nhiên, vẫn chưa tìm thấy các tài liệu nghiên cứu vềcấu trúc PS trong lá MCX.

1.3 Phương pháp phân đoạn polysaccharide thô bằng amonium sulfate

Hình 1.2 Sơ đồ phân đoạn các PS từ PS thô [30]

1.4 Các phương pháp xác định cấu trúc polysaccharide lá MCX

1.4.1 Phân tích thành phần MS

Quá trình phân tích thành phần MS được thực hiện như sau: PS trongGanoderma được thuỷ phân thành các MS, các MS được xác định trực tiếp bằngHPAEC-PAD hay gián tiếp thông qua việc xác định các dẫn xuất của nó (GC-MS)

(a) Phương pháp HPAEC-PAD [19]

Hình 1.3 Quy trình phân tích thành phần MS theo phương pháp HPAEC-PAD

2 Để qua đêm ở 25 0C

5 mg PS

2 mL TFA 2 N, 100 0C, 8 giờ

MS + TFA dưMS

H2O, bay hơi nước ở áp suất thấp

Phân tích HPAEC-PAD

- TFA được dùng để thuỷ phân PS thành các MS H2O được cho vào để loạiTFA dư.

- MS được xác định trực tiếp bằng hệ thống HPAEC-PAD

- Dùng NaBH4 để khử MS thành alditol Cho HCl vào để trung hoà NaBH4, sau

đó cho MeOH vào để loại hỗn hợp sản phẩm phụ

- Dùng (CH3CO)2O để chuyển các alditol thành dẫn xuất bay hơi Các dẫn xuấtnày được chiết ra bằng CHCl3 và phân tích bằng GC-MS

1.4.2 Phương pháp phổ hồng ngoại

Phép phân tích phổ hồng ngoại FTIR là phương pháp đơn giản cho phép xácđịnh nhanh sự có mặt của các nhóm chức hóa học cấu tạo nên phân tử hợp chất Bằngcác peak đặc trưng trên phổ hồng ngoại cho phép xác định các liên kết hóa học của cácnguyên tố trong polysaccharide

50 mg PS

TFA 4 N, 121 0C, 4 giờMono + TFA

dư

MonoMeOH 50%, sấy khô ở áp suất thấp

1 80 mg NaBH4 trong MeOH, để yên 30 phút

2 Rửa bằng HCl và MeOH, sấy áp suất thấp

Alditol

Dịch CHCl3

1 (CH3CO)2O:pyridine = 1:2, 80 0C, 2 giờ

2 Giữ ở 25 0C, 16 giờAlditol peracetate

1 Chiết bằng CHCl3:HCl = 2:1

2 NaHCO3 bão hoà

Phân tích GC-MSDịch NaHCO3

Cô đuổi dung môi

1.5 Tổng quan về gốc tự do và chất kháng oxy hóa

1.5.1 Gốc tự do [35]

Gốc tự do được khái niệm là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hoặc phân tử

ở lớp ngoài cùng có những electron không ghép đôi Gốc tự do có thể tồn tại độclập, tuy nhiên thời gian tồn tại của các gốc tự do thường rất ngắn (khoảng một phầntriệu đến một phần nghìn giây) Các electron này có năng lượng cao, rất kém bềnnên dễ dàng tham gia vào nhiều phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa – khử,phản ứng polymer hóa…

Về bản chất, gốc tự do là một electron độc thân Các gốc tự do rất không ổnđịnh và nhạy cảm Chúng tìm kiếm những electron khác để hình thành một cặpelectron mới Các gốc tự do gây hại khi chúng kéo những electron từ các tế bàobình thường

1.5.2 Các chất kháng oxy hóa [35]

1.5.2.1 Khái niệm

Chất kháng oxy hóa là những chất có khả năng ngăn ngừa, chống lại và loại bỏtác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp Chất kháng oxyhóa có thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động để tạo ra những gốc tự domới kém hoạt động hơn, từ đó có thể ngăn cản chuỗi phản ứng dây chuyền được khơimào bởi các gốc tự do

Chất kháng oxy hóa cũng có thể gián tiếp tạo phức với các ion kim loại chuyểntiếp trong phản ứng Fenton hoặc ức chế các enzyme xúc tác cho các quá trình sinh ragốc tự do nhằm ngăn cản sự hình thành gốc tự do trong cơ thể

1.5.2.2 Cơ chế hoạt động của chất kháng oxy hóa

Chất kháng oxy hóa Gốc tự do

Electron lẻ

Trao đổi điện tử

Hình 1.5 Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa

Chất kháng oxy hóa có thể chuyển một nguyên tử hydro hoặc một electron đếngốc tự do Khi phân tử gốc tự do nhận H hoặc e từ chất kháng oxy hóa thì trở nên ổnđịnh và không còn khả năng gây ra hại nữa Ngoài ra chất kháng oxy hóa còn giúp hạnchế sự phân hủy các hydroperoxide

1.5.2.4 Một số chất kháng oxy hóa hay sử dụng

(a) Acid gallic [32], [35]

Acid gallic là một acid hữu cơ, danh pháp là acid 3,4,5-trihydroxylbenzoic, cótrong lá chè và nhiều loại thực vật khác Acid gallic có thể tồn tại ở dạng tự do hay làmột phần của tannin

Hình 1.6 Công thức cấu tạo của acid gallic

Acid gallic là tên thông dụng trong ngành công nghiệp dược Nó được sử dụnglàm chất chuẩn để xác định hàm lượng phenol trong một số phép phân tích sử dụngthuốc thử Folin-Ciocalteu

Acid gallic có tính kháng nấm và kháng khuẩn Acid gallic hoạt động như mộtchất chống oxy hóa và giúp bảo vệ các tế bào khỏi nguy cơ bị oxy hóa Nó cũng có khảnăng kháng các tế bào ung thư mà không gây hại đến các tế bào khỏe mạnh

(b) BHT (Butylated hydroxyl toluene) [32], [34]

BHT có danh pháp hóa học là bis (1,1-dimethylethyl)-4-methylphenol; di-tert-butyl-p-cresol; 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol BHT được tạo thành phản ứng

2,6-của para–cresol (4-methylphenol) với isobutylen (2-methylpropene) xúc tác bởi acidsulfuric, có công thức phân tử là C15H24O.

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của BHT

BHT hoạt động tương tự như là một vitamin E tổng hợp, chủ yếu hoạt động nhưmột chất ngăn chặn quá trình oxy hoá, một quá trình không bão hòa Trong đó, thường

là các hợp chất hữu cơ bị tấn công bởi oxy trong khí quyển BHT chống oxy hoá xúctác phản ứng bằng cách chuyển đổi các gốc tự do peroxy trong liên kếthydroperoxides Điều này tác động đến chức năng chống oxi hoá bằng cách nó sẽquyên góp một nguyên tử hydro:

RO2 + ArOH → ROOH + ArO

(c) Acid L-ascorbic (Vitamin C) [33]

Acid L-ascorbic được tìm thấy nhiều trong thực phẩm tươi, rau quả và trái cây

Nó đóng một vai trò hết sức quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể

Hình 1.8 Cấu trúc của acid L-ascorbic

Vitamin C là giúp làm lành vết thương, tăng sức đề kháng cho cơ thể, chúngcũng là một chất kháng oxy hóa rất quan trọng Vitamin C cũng có hoạt động cùngvới các chất kháng oxy hóa khác Hơn nữa, vì vitamin C phục hồi và tái tạo vitamin

E từ dạng bị oxy hóa trong cơ thể, nên nó tăng cường hiệu lực chống oxy hóa củavitamin E:

Gốc tocopherol (TO) + Vitamin C (AscH-) → tocopherol (TOH) + gốc ascorbyl (Asc-).Tuy nhiên, trong vài trường hợp, vitamin C gây hại cho cơ thể vì nó có thể đóngvai trò là một chất tiền oxy hóa Đặc biệt là khi nó ở nồng độc cao và có sự hiện diệncủa các ion kim loại chuyển tiếp (Fe3+, Cu2+) Khi đó, vitamin C sẽ đóng vai trò là chấttiền oxy hóa xúc tác phản ứng Fenton tạo các gốc tự do O2•-, HO• và H2O2 [32]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là lá của loài mãng cầu xiêm chi Annona

được thu mua tại huyện Tân Đông Phú, tỉnh Tiền Giang

2.1.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

Hóa chất: D-glucose, CH3COOH, EtOH tuyệt đối, methanol, acid ascorbic,ammonium molybdate (NH4)2MoO4, sodium phosphate (NaH2PO4), H2SO4 đậm đặc,phenol, ethanol 96o, n-butanol, CHCl3, (CH3CO)2O, BaCl2, AlCl3, FeCl3, NaOH,NaNO2, NH3 đậm đặc, (CH3)2SO4 , NaBH4 (Merck), trifluoroacetic acid (TFA), dimethylsulfoxide (DMSO), ammonium sulfate (NH4)2SO4…`

Dụng cụ: máy đo quang T80, V630, cân điện tử hiện số Satorius (độ chính xác

10-2 g), cân điện tử hiện số Satorius (độ chính xác 10-4 g), tử sấy, máy ly tâm R320, cốccác loại, bình tam giác các loại, phễu chiết, phễu lọc

2.2 Nội dung nghiên cứu

1 Tách chiết, định tính và định lượng polysaccaride tan trong nước

2 Nghiên cứu và đánh giá khả năng kháng oxy hóa của cao PS

3 Nghiên cứu cấu trúc PS tan trong nước chiết từ lá mãng cầu xiêm

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp thu hái, định danh và xử lý mẫu

Hình 2.1 Lá cây mãng cầu xiêm

- Xác định độ ẩm tương đối của nguyên liệu theo công thức sau:

Trong đó:

mo: khối lượng cốc cân đã sấy khô đến khối lượng không đổi

m : khối lượng cốc và mẫu lá trước khi sấy

m’: khối lượng cốc và mẫu lá sau khi sấy đến khối lượng không đổi

Độ ẩm (%) = m - m

’

m - mo * 100

2.3.3 Phương pháp định tính các nhóm hợp chất trong mẫu lá [22]

2.3.3.1 Định tính phenolic trong mẫu nguyên liệu

Lấy 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm từng giọt dung dịch FeCl3 0,1%nếu dung dịch xuất hiện kết tủa màu xanh nâu: phản ứng dương tính

2.3.2.2 Định tính nhóm chất flavonoid trong mẫu nguyên liệu

(a) Phản ứng Shinoda

Cho 1 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg hoặc Zn và vài giọtHCl đậm đặc rồi đun cách thủy, khoảng vài phút sau nếu dung dịch đổi sang màu hồngthì kết luận: phản ứng dương tính

(b) Phản ứng với dung dịch FeCl 3 5%

Cho 1 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vài giọt FeCl3 5%, nếu dung dịchxuất hiện kết tủa màu xanh nâu thì kết luận: phản ứng dương tính

(c) Phản ứng với thuốc thử KOH/ cồn

Thuốc thử KOH/ cồn: bao gồm ethanol 50% được trộn với KOH 50%

Lấy 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm từng giọt dungdịch thuốc thử Nếu dung dịch đổi sang màu vàng chứng tỏ có flavonoid

2.3.2.3 Định tính nhóm chất alkaloid trong mẫu nguyên liệu

Chuẩn bị thuốc thử Dragendorff Thuốc thử Dragendorff được pha từ hai dungdịch sau:

- Dung dịch 1: Hòa tan 8,0 g Bi(NO3)3 trong 20 mL HNO2

- Dung dịch 2: Lấy 27,2 g KI hòa tan trong 50 mL nước cất

Cho hai dung dịch trên trộn lẫn vào nhau và định mức bằng nước cất đến 100

mL thu được thuốc thử Dragendorff

Cho 1 mL dịch chiết tác dụng với thuốc thử Dragendorff, nếu thấy kết tủa đỏ dacam thì kết luận: phản ứng dương tính

2.3.2.4 Định tính nhóm chất steroid trong mẫu nguyên liệu

Lấy 1 g cao hòa tan trong 10 mL CHCl3, lọc lấy phần dịch

Pha thuốc thử Liebermann – Burchard: anhydride acetic (1 mL), CHCl3 (1 mL),làm lạnh ống nghiệm rồi thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc

Tiến hành: lấy 1 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm Sau đó, thêm tiếp thuốcthử vào ống nghiệm trên, lắc đều trong 5 phút, để ổn định trong 20 phút Quan sát sự

thay đổi màu và cường độ màu Nếu xuất hiện các màu xanh nhạt, lục, hồng, cam hoặc

đỏ, các màu này bền vững trong một thời gian thì kết luận: phản ứng dương tính

2.3.2.5 Định tính nhóm chất terpenoid trong mẫu nguyên liệu

Lấy 5 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm 2 mL CHCl3 và 3

mL dung dịch H2SO4 đậm đặc Nếu dung dịch xuất hiện màu nâu đỏ thì kết luận: phản ứngdương tính

2.3.2.6 Định tính saponin trong mẫu nguyên liệu

Dùng pipet lấy 2 mL dịch nước cho vào ống nghiệm, bịt miệng ống nghiệm, lắcmạnh trong 1 phút, để yên một lúc rồi quan sát cột bọt trong ống Nếu cột bọt bềnvững thì kết luận: phản ứng dương tính

2.3.2.7 Định tính glycoside tim trong mẫu nguyên liệu

Phản ứng với thuốc thử Baljet

Thuốc thử Baljet: pha 1 thể tích dung dịch acid pycric 1% với 9 thể tích dungdịch NaOH 10%

Cho 2 mL dịch chiết vào ống nghiệm, thêm vào ống nghiệm từng giọt thuốcthử, nếu dung dịch xuất hiện màu hồng thì kết luận: phản ứng dương tính

2.3.2.8 Định tính nhóm chất carotenoid trong mẫu nguyên liệu

Lấy 2 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ, đun cách thủy thành cao, chothêm 2 giọt H2SO4 đậm đặc vào thấy màu dung dịch chuyển sang màu lục thì kết luận:phản ứng dương tính

2.3.2.9 Định tính acid hữu cơ

Lấy 5 mL dịch chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một ít tinh thểNaHCO3, nếu thấy bọt khí xuất hiện thì kết luận: phản ứng dương tính

2.3.2.10 Định tính carbohydrate

Lấy 1 mL dịch chiết nước, thêm vào đó 1 mL phenol 5%, rồi thêm tiếp 5 mL

H2SO4 đậm đặc Phản ứng thấy màu vàng da cam xuất hiện thì kết luận: phản ứngdương tính

2.3.2.11 Định tính đường khử trong mẫu nguyên liệu

Lấy 4 – 5 mL dịch chiết cho vào 4 – 5 mL thuốc thử Fehling, đun cách thủy 2 –

3 phút, có kết tủa màu đỏ gạch thì kết luận: phản ứng dương tính

Cao PS thô

Hòa tan bằng lượng nước cất vừa đủDịch nước

1 Lắc qua butanol: chloroform (4:1),

2 Thu phân lớp nước

3 Tủa bằng EtOH 960, – 4 0C, để qua đêm

4 Cất đuổi dung môi

PS tinh khiết

2.3.2.12 Định tính protein

Lấy 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 1,4 mL dung dịch Lowry, lắc nhẹ và

để trong bóng tối 20 phút Thêm 0,2 mL Folin – ciocalteu (pha loãng 2 lần) rồi ủ trongbóng tối 30 phút Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh thì kết luận: phản ứng dươngtính

2.3.4 Phương pháp chiết rắn - lỏng và phương pháp chiết lỏng - lỏng

2.3.4.1 Phương pháp tách chiết PS

Hình 2.2 Sơ đồ chiết PS trong mẫu lá mãng cầu xiêm

2.3.4.2 Phương pháp tinh chế PS

- Sơ đồ chiết loại protein trong cao PS thô [2]

3 (g) mẫu lá mãng cầu xiêm

Hình 2.3 Sơ đồ tinh chế polysaccharide trong lá mãng cầu xiêm

b) Cách tiến hành

Quá trình phản ứng màu: 1 mL mẫu dịch nước, thêm mỗi ống nghiệm 1 mLdung dịch phenol 5%, 5 mL H2SO4 đậm đặc, lắc đều các ống nghiệm, sau đó đun cáchthủy trong 2 phút Làm lạnh các ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 30 phút

Độ hấp thụ của dung dịch phản ứng là được đo ở bước sóng 490 nm

D-glucose được sử dụng làm chất chuẩn

2.3.5.2 Phương pháp Lowry để xác định hàm lượng protein [1]

a) Nguyên tắc

- Protein phản ứng với ion đồng trong môi trường kiềm

- Acid phosphomolypdatephosphotungstic trong thuốc thử Folin– ciocalteu sẽ bịkhử thành heteropolymolybdeum nhờ quá trình oxy hóa sử dụng xúc tác đồng của cácaminoacid thơm Sản phẩm tạo thành có màu xanh hấp thụ cực đại tại bước sóng 750 nm

b) Cách tiến hành

- Chuyển 0,5 mL mẫu hay chất chuẩn vào các ống nghiệm 10 mL

- Sau đó thêm vào mỗi ống 0,7 mL dung dịch Lowry, đậy nắp ống nghiệm vàlắc nhẹ nhàng để hỗn hợp trong ống nghiệm được trộn đều

- Ủ mẫu trong bóng tối ở nhiệt độ phòng trong 20 phút

- Thêm tiếp 0,1 mL thuốc thử Folin - ciocalteu (pha loãng 2 lần) vào mỗi ốngnghiệm

- Khuấy, tiếp tục bảo quản 30 phút trong bóng tối tại nhiệt độ phòng

- Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 750 nm

- Vẽ đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn

- Đo mẫu thực Từ đồ thị suy ra hàm lượng protein trong mẫu

- Albumin được sử dụng làm chất chuẩn.

2.3.6 Phương pháp phân đoạn PS-protein và PS-homo [30]

Việc tách các polymer protein phụ thuộc vào phân tử lượng polymer, pH vànồng độ các muối vô cơ của dung dịch Ở đây, chúng tôi sử dụng muối (NH4)2SO4 làmcác hetero-PS chứa protein kết tủa và tách thành hai pha

Hình 2.4 Sơ đồ phân đoạn các loại polysaccharide trong cao polysaccharide 2.3.7 Phương pháp tạo dẫn xuất của monosaccharide và phân tích bằng GC-MS để xác định tỷ lệ thành phần các monosaccharide [1]

Cao hetero-PS Cao homo-PS