Nghiên cứu vai trò của gene ST3Gal I bằng kỹ thuật knock down với siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2012 NGUYỄN THỊ CÚC LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2012 25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. ĐỒ THỊ THẢO HÀ NỘI – 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của các thầy cô, sự giúp đỡ chân thành của các đồng nghiệp. Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn tới TS. Đỗ Thị Thảo - Phó trưởng Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình làm việc cũng như trong suốt quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn thành luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học của Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái nguyên và Phòng Thử nghiệm sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm các anh, chị đồng nghiệp phòng Thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình đã luôn ủng hộ và giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Cúc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC PHẦN I. MỞ ĐẦ U 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cƣ́ u của đề tài 2 PHẦN II. TỔ NG QUAN TÀ I LIỆ U 3 2.1. Ung thƣ 3 2.1.1. Tình hình bệnh ung thư trên thế giới và ở Việt Nam 3 2.1.2. Đc tính và nguyên nhân của ung thư 3 2.1.2.1. Các đc tnh ca bệnh ung thư 3 2.1.2.2. Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn 3 2.1.3. Phân loại ung thư 4 2.1.4. Tác nhân gây bệnh ung thư 4 2.1.4.1. Tác nhân hóa học 4 2.1.4.2. Tác nhân sinh học 5 2.1.5. Cơ chế di căn của tế bào ung thư 5 2.1.6. Dòng tế bào ung thư vú MCF7 6 2.2. Giới thiệu về RNAi 6 2.2.1. Dòng thông tin di truyền trong tế bào 6 2.2.2. Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào 7 2.2.2.1. Khái niệm 7 2.2.2.2. Vai trò ca RNAi 7 2.2.2.3. Thành phần RNAi 7 2.2.3. Lịch sử nghiên cứu siRNA 7 2.2.4. Cơ chế của RNAi 9 2.2.4.1. Cơ chế chống lại các virus và gene nhảy ca RNAi 9 2.2.4.2. Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA 9 2.2.5. Ứng dụng của việc nghiên cứu các RNAi 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.1. Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu ung thư 10 2.2.5.2. Ứng dụng RNAi trong việc tạo Hoa Hồng Xanh 10 2.2.5.3. Ứng dụng RNAi trong việc trừ sâu bệnh 11 2.2.5.4.Các ứng dụng khác ca RNAi 11 2.2.6. Ý nghĩa của RNAi 11 2.2.7. Khái niệm về knock-down gene 11 2.3. Những hiểu biết về Enzyme sialyltransferase (ST) 12 2.3.1. Enzyme sialyltransferase đối với sự di căn của tế bào ung thư 12 2.3.2. Khái niệm về Enzyme sialyltransferase ST3Gal-I 16 2.3.3. Phân loại các Enzyme sialyltransferase 17 2.3.4. Mô hình tác động của hệ Enzyme sialyltransferase 18 2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc thuộc lĩnh vực đề tài . 19 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 20 3.1.1. Vật liệu 20 3.1.2. Hoá chất 20 3.1.3. Thiết bị 21 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu. 21 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.3.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 21 3.3.2. Phương pháp knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA nhờ lipofectamin 22 3.3.3. Phân tích và so sánh hình thái tế bào sau khi bị knock-down 23 3.3.4. Xác định khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển nhiễm 23 3.3.5. Thu nhận RNA tổng số bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen 23 3.3.6. Kiểm tra hiệu quả knock-down gene bằng RT-PCR theo bộ kit của Applied Biosystem 23 3.3.7. Thu nhận Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.8. Phương pháp xác định hàm lượng Glycoprotein tổng số 25 3.3.9. Phương pháp điện di trên gel 25 3.3.10. Phƣơng pháp Western blot để xác định mức độ biểu hiện của các protein 26 3.3.11. Phương pháp nhuộm gel bằng siver staining 26 3.3.12. Phương pháp in-gel digestion 27 3.3.13. Phương pháp phân tích khối phổ 28 PHẦN IV. KẾ T QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1. Hình thái tế bào MCF7 sau khi knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA 29 4.2. Khả năng phát triển của tế bào MCF7 sau khi chuyển nhiễm siRNA 30 4.3. Hiệu quả knock-down gene 31 4.4. Biểu hiện của protein tổng số khi gene ST3Gal-I bị knock-down . 34 4.5. Biểu hiện của một số protein khi gene ST3Gal-I bị knock-down 35 4.6. Hàm lƣợng Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm 37 4.7. Nhuộm bạc 40 4.8. Phân tích khối phổ MALDI-TOF-MS 41 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 1. KẾT LUẬN 46 2. KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Giới thiệu một số dạng liên kết giữa phân tử amino acid với phân tử đường trong tự nhiên 13 Bảng 4.1 .Giá trị OD trung bình ở bước sóng 570 nm 29 Bảng 4.2. Hàm lượng RNA tổng số của các mẫu 30 Bảng 4.3. Hiệu quả knock-down gene ST3Gal-I sau khi chuyển nhiễm siRNA 32 Bảng 4.4. Hàm lượng Glycoprotein thu được từ tế bào chuyển nhiễm siRNA 37 Bảng 4.5 Kết quả phân tích khối phổ protein 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Vị trí của gene ST3Gal-I 16 Hình 2.2. Mô hình tác động của hệ enzyme ST trong đó có ST3Gal-I 18 Hình 4.1. Hình ảnh tế bào MCF7 sau 3 ngày chuyển nhiễm ở độ phóng đại 20 X gồm: (A) tế bào đối chứng (không chuyển nhiễm siRNA); (B) tế bào chuyển nhiễm siRNA 28 Hình 4.2. Sự sống sót và phát triển của các tế bào MCF7 sau khi chuyển nhiễm siRNA 30 Hình 4.3. Định lượng RNA tổng số của các mẫu thu được bằng hệ thống NanoDrop của Thermo Scientific 31 Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn về tương quan nồng độ BSA và giá trị OD thu được 33 Hình 4.5. Hình ảnh western-blot glycoprotein màng tổng số của mu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 35 Hình 4.6. Ảnh Western-blot các protein Actin, Akt, GSK, P42/44 và PODCL của mẫu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) . 37 Hình 4.7. Hình ảnh nhuộm bạc silver-staining các glycoprotein màng của mẫu đối chứng (SC) và knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Akt ANKRD46 bp cDNA DNA DMEM dsRNA EDTA FBS Gal Nac Hela S3 HT-29 NFkB-p65 MCF7 MDA-MB-231 miR 21 miRNA mRNA Neu5Ac PI3K RIPA rpm RISC RNA RNAi Protein Kinase B ankyrin repeat domain 46 Base pair Complementary Deoxyribonucleic acid Deoxyribonucleic acid Môi trường nuôi cấy tế bào RNA sợi đôi Ethylenediamintetraacetic acid Phosphate bufer saline (huyết thanh phôi bò) N-acetylgalactosamin Dòng tế bào ung thư vú Dòng tế bào ung thư ruột người nuclear factor kappa from B cells Dòng tế bào ung thư vú Dòng tế bào ung thư vú microRNA 21 Micro Ribonucleic acid RNA thông tin (Messenger Ribonucleic acid) N-acetylneuraminic acid Rapid Immunofilter Paper Assay Phosphatidylinositol 3-kinases Revolutions per minute RNA – incluced silencing complex Ribonucleic acid RNA can thiệp (Ribonucleic acid interference) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn RNAse III RT-PCR ser/ther siRNA ssRNA ST3Gal-I SW480 TBUT WHO Ribonuclease III phản ứng Real time Polymerase chain reaction serine/threonine Small interference RNA/short interference RNA Single strand RNA 2,3 Sialyltransferase galatose Dòng tế bào ung thư ruột kết người Tế bào ung thư Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization) [...]... hình tế bào ung thư vú MCF7 của ngư i, chúng t i mong muốn tìm hiểu m i liên quan giữa gene ST3Gal- I v i đặc tính di căn của các tế bào ung thư n i chung và của tế bào ung thư vú MCF7 n i riêng Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng t i đã tiến hành đề t i: ‘ Nghiên cứu vai trò của gene ST3Gal- I bằng kỹ thuật knock- down v i siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7 ’ 1.2 Mục tiêu nghiên cƣu của đề... cƣu của đề t i ́  Knock- down gene ST3Gal- I bằng siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7  Tìm hiểu m i liên quan của gene ST3Gal- I t i quá trình di căn của tế bào ung thư Số hóa b i Trung tâm Học liệu – Đ i học Th i Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PHẦN II TÔNG QUAN TAI LIÊU ̉ ̀ ̣ 2.1 Ung thƣ 2.1.1 Tình hình bệnh ung thư trên thế gi i va ơ Viêt Nam ́ ̀ ̉ ̣ Ung thư là một căn bệnh nguy hiểm và khó... nhân ung thư (Sproviero D et al., 2012) Các nghiên cứu trên cho thấy, sự biểu hiện quá mức của ST3Gal- I dường như là một phần của chuyển đ i gây ung thư Các nghiên cứu đều thực hiện trên các gene và các dòng tế bào ung thư khác nhau tuy nhiên Số hóa b i Trung tâm Học liệu – Đ i học Th i Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chưa có nghiên cứu nào thực hiện knock- down gene ST3Gal- I trên mô hình tế bào ung thư. .. nhiều bản sao trong cơ thể đa bào) 2.2.5 Ứng dụng của việc nghiên cứu các RNAi 2.2.5.1 Ứng dụng RNAi trong nghiên cứu ung thư Tế bào ung thư phát sinh từ sự tích lũy các đột biến liên tiếp có l i cho sự phân chia và tồn t i của chúng Những biến đ i vật chất di truyền (epigenetic) giúp tế bào ung thư vượt qua sự kiểm soát của hệ miễn dịch cơ thể và cơ chế chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)... thiết giữa các glycoprotein cũng như glycolipid thuộc bề mặt tế bào t i sự liên kết giữa tế bào v i tế bào, t i việc truyền tín hiệu giữa các tế bào trong cơ thể Sự sai khác xuất hiện trong quá trình glycosyl hóa các glycoprotein và glycolipid của màng sẽ khiến cho m i liên kết và quá trình truyền tín hiệu giữa tế bào bị sai lệch, dẫn t i nhiều căn bệnh của tế bào hoặc cơ thể, ví dụ như bệnh ung thư. .. nghiệm sinh ̀ học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà N i 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp nu i cấy tế bào in vitro Số hóa b i Trung tâm Học liệu – Đ i học Th i Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Tế bào ung thư vú MCF-7 được nu i cấy in vitro theo thư ng qui của Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC Tế bào được nu i trong m i trường DMEM v i. .. Sodium pyruvat và Insulin (Gibco) Tế bào được cấy chuyển liên tục 3 ngày/1 lần và được nu i trong tủ ấm 370C, 5%CO2 và độ ẩm 100% 3.3.2 Phương pháp knock- down gene ST3Gal- I bằng siRNA nhờ lipofectamin Tế bào MCF7 nu i trong m i trường không kháng sinh trong đĩa nu i cấy 100 mm v i tỉ lệ 1.5 x 106 tế bào/ giếng trong 24h trước khi chuyển nhiễm Quá trình chuyển nhiễm siRNA đặc hiệu gene ST3Gal- I (INVITROGEN... 24 giờ trước khi chuyển nhiễm, được thay m i trường bằng 10 ml m i trường DMEM đầy đủ (không kháng sinh) 5 Sau th i gian ủ, đưa hỗn hợp siRNA và RNAiMAX vào đĩa tế bào đã được thay m i trường và lắc nhẹ trong 1 phút 6 Ủ tế bào và siRNA trong 48 giờ tiếp theo (từ 24-72 giờ) ở 37oC, sau đó kiểm tra hình th i tế bào sau khi knock- down gene và thu hoạch tế bào cho các nghiên cứu tiếp theo Số hóa b i Trung... Genios t i các th i i m sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ  Thêm 50 l SDS 3% vào giếng tế bào để dừng phản ứng 3.3.5 Thu nhận RNA tổng số bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen Khi nồng độ tế bào đạt 0.5x106 thì tiến hành thu hoạch và phá vỡ tế bào Thu RNA tổng số của tế bào MCF7 sau khi knock- down bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất 3.3.6 Kiểm tra hiệu quả knock- down gene bằng. .. đó, nhiều nghiên cứu đã báo cáo về sự tăng cường hoạt động của enzyme ST3 beta-galactoside alpha2,3-sialyltransferase 1 hay còn g i là ST3Gal- I do gene ST3Gal- I mã hóa ở các bệnh nhân ung thư trong giai đoạn di căn nhưng l i rất ít hoặc hầu như không hoạt động ở ngư i bình thư ng hoặc ở bệnh nhân ung thư giai đoạn sớm Để nghiên cứu vai trò chức năng của một gene thì việc knock- down gene bằng siRNA là . cứu vai trò của gene ST3Gal-I bằng kỹ thuật knock-down với siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7 ’ 1.2. Mục tiêu nghiên cƣ́ u của đề tài  Knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA trên mô hình. HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm. ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC