Nghiên cứu vai trò của gene ST3Gal-I bằng kỹ thuật knock-down với siRNA trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS ĐỒ THỊ THẢO HÀ NỘI – 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, nhận bảo, hướng dẫn tận tình thầy cô, giúp đỡ chân thành đồng nghiệp Với tất lòng, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn tới TS Đỗ Thị Thảo - Phó trưởng Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, tận tình hướng dẫn suốt trình làm việc suốt trình nghiên cứu đề tài hoàn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Phòng Đào tạo sau đại học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Ban giám hiệu Trường Đại học Thái nguyên Phòng Thử nghiệm sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho học tập hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm anh, chị đồng nghiệp phòng Thử nghiệm sinh học - Viện Công nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ trình thực đề tài hoàn thành luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn tới gia đình ủng hộ giúp đỡ thời gian qua Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Cúc Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cƣ́u đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Ung thƣ 2.1.1 Tình hình bệnh ung thư giới Việt Nam 2.1.2 Đặc tính nguyên nhân ung thư 2.1.2.1 Các đặc tính của bệnh ung thư 2.1.2.2 Bệnh ung thư gồm nhiều giai đoạn 2.1.3 Phân loại ung thư 2.1.4 Tác nhân gây bệnh ung thư 2.1.4.1 Tác nhân hóa học 2.1.4.2 Tác nhân sinh học 2.1.5 Cơ chế di tế bào ung thư 2.1.6 Dòng tế bào ung thư vú MCF7 2.2 Giới thiệu RNAi 2.2.1 Dòng thông tin di truyền tế bào 2.2.2 Khái niệm vai trò RNAi tế bào 2.2.2.1 Khái niệm 2.2.2.2 Vai trò của RNAi 2.2.2.3 Thành phần RNAi 2.2.3 Lịch sử nghiên cứu siRNA 2.2.4 Cơ chế RNAi 2.2.4.1 Cơ chế chống lại virus gene nhảy của RNAi 2.2.4.2 Cơ chế làm tắt gene siRNA 2.2.5 Ứng dụng việc nghiên cứu RNAi 10 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.5.1 Ứng dụng RNAi nghiên cứu ung thư 10 2.2.5.2 Ứng dụng RNAi việc tạo Hoa Hồng Xanh 10 2.2.5.3 Ứng dụng RNAi việc trừ sâu bệnh 11 2.2.5.4.Các ứng dụng khác của RNAi 11 2.2.6 Ý nghĩa RNAi 11 2.2.7 Khái niệm knock-down gene 11 2.3 Những hiểu biết Enzyme sialyltransferase (ST) 12 2.3.1 Enzyme sialyltransferase di tế bào ung thư 12 2.3.2 Khái niệm Enzyme sialyltransferase ST3Gal-I 16 2.3.3 Phân loại Enzyme sialyltransferase 17 2.3.4 Mô hình tác động hệ Enzyme sialyltransferase 18 2.4 Tình hình nghiên cứu nƣớc thuộc lĩnh vực đề tài 19 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.1 Vật liệu, hoá chất thiết bị nghiên cứu 20 3.1.1 Vật liệu 20 3.1.2 Hoá chất 20 3.1.3 Thiết bị 21 3.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro 21 3.3.2 Phương pháp knock-down gene ST3Gal-I siRNA nhờ lipofectamin 22 3.3.3 Phân tích so sánh hình thái tế bào sau bị knock-down 23 3.3.4 Xác định khả sống sót tế bào sau chuyển nhiễm 23 3.3.5 Thu nhận RNA tổng số RNeasy Mini Kit Qiagen 23 3.3.6 Kiểm tra hiệu knock-down gene RT-PCR theo kit Applied Biosystem 23 3.3.7 Thu nhận Glycoprotein màng tế bào MCF7 24 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.8 Phương pháp xác định hàm lượng Glycoprotein tổng số 25 3.3.9 Phương pháp điện di gel 25 3.3.10 Phƣơng pháp Western blot để xác định mức độ biểu protein 26 3.3.11 Phương pháp nhuộm gel siver staining 26 3.3.12 Phương pháp in-gel digestion 27 3.3.13 Phương pháp phân tích khối phổ 28 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1 Hình thái tế bào MCF7 sau knock-down gene ST3Gal-I siRNA 29 4.2 Khả phát triển tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm siRNA 30 4.3 Hiệu knock-down gene 31 4.4 Biểu protein tổng số gene ST3Gal-I bị knock-down 34 4.5 Biểu số protein gene ST3Gal-I bị knock-down 35 4.6 Hàm lƣợng Glycoprotein màng tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm 37 4.7 Nhuộm bạc 40 4.8 Phân tích khối phổ MALDI-TOF-MS 41 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Giới thiệu số dạng liên kết phân tử amino acid với phân tử đường tự nhiên 13 Bảng 4.1 Giá trị OD trung bình bước sóng 570 nm 29 Bảng 4.2 Hàm lượng RNA tổng số mẫu 30 Bảng 4.3 Hiệu knock-down gene ST3Gal-I sau chuyển nhiễm siRNA 32 Bảng 4.4 Hàm lượng Glycoprotein thu từ tế bào chuyển nhiễm siRNA 37 Bảng 4.5 Kết phân tích khối phổ protein 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Vị trí gene ST3Gal-I 16 Hình 2.2 Mô hình tác động hệ enzyme ST có ST3Gal-I 18 Hình 4.1 Hình ảnh tế bào MCF7 sau ngày chuyển nhiễm độ phóng đại 20 X gồm: (A) tế bào đối chứng (không chuyển nhiễm siRNA); (B) tế bào chuyển nhiễm siRNA 28 Hình 4.2 Sự sống sót phát triển tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm siRNA 30 Hình 4.3 Định lượng RNA tổng số mẫu thu hệ thống NanoDrop Thermo Scientific 31 Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn đường chuẩn tương quan nồng độ BSA giá trị OD thu 33 Hình 4.5 Hình ảnh western-blot glycoprotein màng tổng số mu đối chứng (SC) knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 35 Hình 4.6 Ảnh Western-blot protein Actin, Akt, GSK, P42/44 PODCL mẫu đối chứng (SC) knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 37 Hình 4.7 Hình ảnh nhuộm bạc silver-staining glycoprotein màng mẫu đối chứng (SC) knock-down gene ST3Gal-I (ST3) 39 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Akt Protein Kinase B ANKRD46 ankyrin repeat domain 46 bp Base pair cDNA Complementary Deoxyribonucleic acid DNA Deoxyribonucleic acid DMEM Môi trường nuôi cấy tế bào dsRNA RNA sợi đôi EDTA Ethylenediamintetraacetic acid FBS Phosphate bufer saline (huyết phôi bò) Gal Nac N-acetylgalactosamin Hela S3 Dòng tế bào ung thư vú HT-29 Dòng tế bào ung thư ruột người NFkB-p65 nuclear factor kappa from B cells MCF7 Dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 Dòng tế bào ung thư vú miR 21 microRNA 21 miRNA Micro Ribonucleic acid mRNA RNA thông tin (Messenger Ribonucleic acid) Neu5Ac N-acetylneuraminic acid PI3K Rapid Immunofilter Paper Assay RIPA Phosphatidylinositol 3-kinases rpm Revolutions per minute RISC RNA – incluced silencing complex RNA Ribonucleic acid RNAi RNA can thiệp (Ribonucleic acid interference) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn RNAse III Ribonuclease III RT-PCR phản ứng Real time Polymerase chain reaction ser/ther serine/threonine siRNA Small interference RNA/short interference RNA ssRNA Single strand RNA ST3Gal-I 2,3 Sialyltransferase galatose SW480 Dòng tế bào ung thư ruột kết người TBUT Tế bào ung thư WHO Tổ chức Y tế Thế Giới (World Health Organization) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... VẬT TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ CÚC NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA GENE ST3GAL-I BẰNG KỸ THUẬT KNOCK-DOWN VỚI siRNA TRÊN MÔ HÌNH TẾ BÀO UNG THƢ VÚ MCF7 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số:... Dòng tế bào ung thư vú HT-29 Dòng tế bào ung thư ruột người NFkB-p65 nuclear factor kappa from B cells MCF7 Dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231 Dòng tế bào ung thư vú miR 21 microRNA 21 miRNA Micro... LUẬN 29 4.1 Hình thái tế bào MCF7 sau knock-down gene ST3Gal-I siRNA 29 4.2 Khả phát triển tế bào MCF7 sau chuyển nhiễm siRNA 30 4.3 Hiệu knock-down gene 31