Nghiên cứu vai trò vi khuẩn lactic trong quá trình lên men tạo hương cà phê hạt tươi

Header Page of 133 -1- -2- BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG - MỞ ĐẦU Lý lựa chọn ñề tài Hiện nay, “cà phê chồn” loại cà phê ñắt giá ñược ưa chuộng giới hương vị Tuy nhiên, loại cà phê hiếm, người ta thu ñược khoảng 224kg năm Vậy ñiều ñã khiến cho loại cà phê chồn có giá trị sử dụng cao vậy? HOÀNG THỊ HỒNG ÁNH Chính hệ vi sinh vật yếm khí ñường ruột chồn ñã tạo hương vị ñặc biệt cà phê Quả cà phê tươi sau thu hoạch có vị dịu màu ñỏ NGHIÊN CỨU VAI TRÒ VI KHUẨN LACTIC TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN TẠO HƯƠNG CÀ PHÊ HẠT TƯƠI phần vỏ ngoài, hoàn toàn hương thơm Hương màu sắc hạt cà phê cảm nhận ñược hình thành sau “ủ” Ủ trình lên men yếm khí nhờ hệ vi sinh vật tự nhiên bao gồm: nấm men, nấm mốc vi khuẩn Trong ñó, nấm men vi khuẩn Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Mã số: 60.54.02 lactic hai tác nhân vi sinh vật có vai trò quan trọng ñịnh ñến tiêu chất lượng hương vị hạt cà phê sau lên men Nhiều nghiên cứu khẳng ñịnh có mặt nấm mốc, nấm men, vi khuẩn (lactic, axetic, coliform) số vi khuẩn gram âm Trong ñó, nhiều chủng vi khuẩn lactic khối hạt ủ ñược phân lập ñịnh tên TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Xuất phát từ chất trình lên men yếm khí cà phê tươi xảy hệ thống tiêu hóa chồn, chọn vi khuẩn lactic làm ñối tượng nghiên cứu trình lên men cà phê tươi sau thu hoạch, nhằm góp phần “công nghiệp hóa” giai ñoạn lên men, cải thiện chất lượng hương vị thay lên men cà phê thóc Vì mục ñích ñó, chọn ñề tài: Đà Nẵng, năm 2010 “Nghiên cứu vai trò vi khuẩn lactic trình lên men tạo hương cà phê hạt tươi” Footer Page of 133 Header Page of 133 -3- Mục ñích nghiên cứu -4- 5.2 Ý nghĩa thực tiễn - Nghiên cứu vai trò vi khuẩn lactic tham gia vào - Ứng dụng vi khuẩn lactic lên men cà phê tươi tận dụng trình tạo hương dựa khả chuyển hoá ñường tạo thành ñược nguồn dinh dưỡng có vỏ chuyển hóa thành chất axit hữu Sản phẩm axit hữu tham gia phản ứng este với rượu – tạo hương nhằm chủ ñộng nâng cao chất lượng hương cà phê sản phẩm tạo hương cho cà phê nhân - Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic có khả chuyển hóa ñường mạnh ñể ứng dụng cho trình lên men cà phê hạt tươi - Từ kết ứng dụng, ñề xuất quy trình lên men thay - Ứng dụng kết nghiên cứu vào giai ñoạn ủ cà phê tươi huyện EaH’leo, Daklak Cấu trúc luận văn Luận văn gồm phần: quy trình lên men thóc ứng dụng vào giai ñoạn Mở ñầu lên men huyện EaH’leo – Daklak Chương 1: Tổng quan tài liệu Đối tượng phạm vi nghiên cứu Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu - Quả cà phê Robusta thu hái huyện EaH’leo, tỉnh Daklak Chương 3: Kết thảo luận - Các vi khuẩn lactic ñược tuyển chọn trình lên men Kết luận kiến nghị tự nhiên cà phê - Nấm men rượu vang từ sưu tập giống viện Công nghệ sinh học Việt Nam Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp vi sinh vật - Phương pháp hóa lý - Phương pháp hóa học - Phương pháp xử lý số liệu Ý nghĩa khoa học thực tiễn ñề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học - Phân lập tuyển chọn ñược chủng vi khuẩn lactic sinh axit lactic cao - Xác ñịnh vai trò tạo hương cho hạt cà phê vi khuẩn lactic thực nghiệm tiêu xác ñịnh Footer Page of 133 Tài liệu tham khảo Phụ lục Header Page of 133 -5- -61.4.2 Nuôi cấy hỗn hợp chủng giống Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.5 Sinh tổng hợp hương cà phê 1.1 Tổng quan cà phê 1.5.1 Khả tạo hương vi khuẩn lactic 1.1.1 Nguồn gốc 1.5.2 Một số hợp chất tạo hương cà phê 1.1.2 Các giống cà phê 1.6 Quy trình lên men cà phê thóc 1.1.2.1 Cà phê chè (coffea Arabica L) 1.7 Tình hình nghiên cứu nước thuộc lĩnh 1.1.2.2 Cà phê vối (Coffea Robusta) vực ñề tài 1.1.2.3 Cà phê mít (Coffea Excelsa Chev) 1.7.1 Những nghiên cứu nước 1.1.3 Cấu tạo, thành phần hóa học cà phê nhân 1.7.2 Những nghiên cứu nước 1.1.3.1 Cấu tạo hạt cà phê 1.1.3.2 Thành phần hóa học hạt cà phê 1.2 Hệ vi sinh vật tham gia trình lên men hạt cà phê 1.2.1 Nấm men 1.2.1.1 Sự tạo thành rượu etylic môi trường axit (pH = 4,5) ñiều kiện yếm khí 1.2.1.2 Sự tạo thành glycerin môi trường kiềm 1.2.1.3 Sự tạo thành rượu cao ñiều kiện thành phần dinh dưỡng môi trường lên men có chứa nhiều axit amin khác 1.2.2 Vi khuẩn lactic 1.2.2.1 Đặc ñiểm vi khuẩn lactic 1.2.2.2 Môi trường sống 1.2.2.3 Các trình trao ñổi chất vi khuẩn lactic 1.3 Môi trường dinh dưỡng môi trường thực nghiệm nuôi cấy chủng giống 1.3.1 Môi trường dinh dưỡng 1.3.2 Môi trường thực nghiệm nuôi cấy chủng giống 1.4 Nuôi cấy chủng hỗn hợp giống 1.4.1 Nuôi cấy chủng giống Footer Page of 133 Header Page of 133 -7- -8- Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2.1 Đối tượng nghiên cứu 3.1 Kết lựa chọn môi trường 2.1.1 Nguyên liệu hệ vi sinh vật Phương pháp thực theo mục…, tất khuẩn lạc nghi Quả cà phê chín ñược thu hái vườn cà phê thuộc huyện EaH’leo, tỉnh Daklak, chủ yếu giống Robusta - Vi khuẩn lactic ñược phân lập tuyển chọn từ khối cà phê lên men tự nhiên - Nấm men rượu ñược sử dụng từ sưu tập viện Công nghệ sinh học Quốc gia ngờ vi khuẩn lactic hình dáng khuẩn lạc tròn, nhỏ, màu trắng hay vàng ngà mọc ñĩa petri có chứa môi trường MRS II, MRS III, MRS IV, MRS V ñược phân lập chủng Các chủng ñược ñem nuôi cấy môi trường MRS lỏng có bổ sung nước vắt tiến hành ño OD sau 48h Ký hiệu khuẩn lạc C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 Kết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1: Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng 2.1.2 Các môi trường phân lập, nhân giống vi khuẩn phát triển vi sinh vật 2.1.3 Hóa chất thí nghiệm 2.1.4 Phương tiện thí nghiệm: Stt Chủng MRS I MRS II MRS III 2.2.1 Chuẩn bị môi trường C1 314 290 301 287 282 2.2.2 Phân lập chủng chủng lactic C2 299 276 287 272 266 2.2.3 Phương pháp quan sát hình thái khuẩn lạc tế bào vi C3 311 284 260 244 215 2.2 Phương pháp nghiên cứu khuẩn MRS VI MRS V C4 314 274 282 259 223 2.2.4 Đặc tính sinh lý, sinh hóa C5 373 273 284 246 236 2.2.5 Phương pháp xác ñịnh khả sinh trưởng, phát C6 287 263 283 239 233 C7 321 291 310 287 270 C8 310 289 300 276 270 C9 293 261 254 233 231 10 C10 303 280 291 289 277 11 C11 288 270 275 261 254 12 C12 305 289 295 269 260 triển vi khuẩn lactic 2.2.6 Phương pháp xác ñịnh số lượng tế bào sống/1ml canh trường 2.2.7 Phương pháp xác ñịnh số este 2.2.8 Phương pháp phân tích phương sai Footer Page of 133 Header Page of 133 13 C13 -9- 320 295 - 10 308 289 251 ñồng Đánh giá kết phát triển chủng vi sinh vật môi trường cho thấy: môi trường dinh dưỡng MRS I không bổ C5 sung thêm nước vắt cà phê tất chủng phát triển mạnh Tiếp C6 ñó môi trường MRS III; MRS II; MRS VI; MRS V Do ñó, chọn môi trường III làm môi trường giữ giống C7 nuôi vi khuẩn cho trình nghiên cứu Các chủng nghi ngờ vi khuẩn lactic tiếp tục ñược giữ giống nuôi cấy môi trường MRS III ñể tiến hành xác ñịnh C8 hình thái ñịnh tính C9 3.2 Kết xác ñịnh hình thái vi khuẩn Trắng sữa, tròn, mép Hình que phẳng ngắn Tròn, bề mặt trơn, mép Hình que cưa ngắn Trắng trong, mép nhẵn, bề mặt lồi Trắng sữa, bề mặt xù xì, mép lượn sóng + - + - Hình chuỗi - + Hình chuỗi + + + - Trắng sữa, nhân vàng, Que ngắn, cấu trúc ñồng mảnh Các chủng C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 ñược thử catalase, nhuộm màu Gram quan sát hình dạng tế bào C10 Trắng ñục, ñều, không lồi Hình que + + theo phương pháp mục 2.2.3 chương Kết ñược trình bày C11 Trắng ñục, ñều, lồi Hình oval + + C12 Vàng nhạt, tròn ñều, lồi + - C13 Trắng ñục, mép cưa + - bảng sau: Bảng 3.2: Đặc ñiểm hình thái chủng vi khuẩn phân lập từ cà phê lên men Hình dạng Chủng Hình thái khuẩn lạc tế bào C1 C2 C3 C4 Màu trắng sữa, tròn, lồi, mép phẳng Màu trắng trong, tròn, dẹt, nhỏ Gram Catalase ngắn Hình que ngắn Kết bảng (3.2) cho thấy có chủng vi khuẩn lactic, C3, C4, C5, C6, C9, C12, C13 (Catalase ( - ); gram (+)) Hình oval + + Các chủng ñược thử khả chuyển hóa ñường thành axit lactic, từ ñó lựa chọn chủng có khả chuyển hóa ñường Hình que dài Trắng trong, mép phẳng, Hình que khuẩn lạc to ngắn Trắng sữa, dẹt, cấu trúc Hình cầu Footer Page of 133 Nhuộm Hình que + + cao 3.3 Khả chuyển hóa ñường thành axit lactic khảo + - + - sát ñộng thái sinh trưởng chủng vi khuẩn 3.3.1 Kết ñịnh tính khả sinh axit lactic Header Page of 133 - 11 - - 12 - Kết cho thấy tất chủng phân lập C3, C4, C5, C6, C9, C12, C13 có khả tạo axit lactic (làm chuyển màu tím dung Từ bảng kết thực nghiệm, nhận thấy chủng dịch thuốc thử sang màu vàng chanh mẫu ñối chứng) Xin xem C5, C12 có khả sinh axit lactic cao nhất, vậy, chọn kết bảng 3.3 chủng ñó ñể tiếp tục khảo sát ñộng thái sinh trưởng Bảng 3.3 Định tính khả sinh axit lactic chủng vi khuẩn lựa chọn Kết C3 + C4 + 400 C5 + 350 C6 + 300 C9 + 250 C12 + C13 + OD386nm Chủng khảo sát Ghi +: Sinh axit lactic Lượng axit tạo thành (mg/l) Tên Chủng 24h 48h 72h 200 150 100 3.3.2 Kết ñịnh lượng axit lactic chủng vi khuẩn Bảng3.4 : Lượng axit lactic tạo thành chủng vi khuẩn Stt 3.3.3 Khảo sát ñộng thái sinh trưởng chủng vi khuẩn 96h 50 0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h C5 11 172 276 310 320 332 337 C12 165 293 325 336 343 345 C3 34,78 88,39 82,80 64,42 C4 89,47 120,63 115,80 114,87 Trong khoảng thời gian từ – 36h mật ñộ tế bào tăng lên rõ rệt C5 112,72 142,74 158,80 146,86 ñây giai ñoạn chủng vi khuẩn lactic giai ñoạn thích C6 63,57 117,31 111,70 105,91 ứng sinh trưởng, phát triển sinh khối, nên giá trị OD620nm ño C9 101,62 155,72 148,10 151,04 ñược giá trị sinh khối tích lũy ñược thời gian 36h nuôi C12 117,99 162,88 165,10 144,17 C13 55,99 120,90 120,30 118,88 Hình 3.3 Động thái sinh trưởng chủng C5 C12 cấy Khoảng thời gian từ 48 – 72h, giá trị sinh khối hai chủng C5, C12 có tăng không ñáng kể, ñiều ñó thể chủng vi khuẩn lactic bước qua giai ñoạn phát triển cân chuyển dần qua giai ñoạn suy vong Footer Page of 133 Header Page of 133 - 13 - - 14 - Dựa vào kết ño ñược, khẳng ñịnh 36h mốc 229.75a thời gian hai chủng C5 C12 phát triển mạnh thời ñiểm 230 ñó, xác ñịnh lượng tế bào sống/ml canh trường theo 225 phương pháp 2.4, phụ lục Kết trình bày bảng 3.5 220 Chỉ số este 222.08b Bảng 3.5 : Số tế bào sống/ml canh trường (CFU/ml) tương ứng với ñộ pha loãng thập phân C5 Chủng vi khuẩn Độ pha loãng Số lượng khuẩn lạc ñĩa C12 10-6 11 18 10-7 31 10-8 42 210 205 10-7 212.38c 215 16 200 M1 23 M2 MĐC Mẫu lên men Số vi khuẩn/1ml canh trường 18 x 107 51 x 108 (CFU/ml) Vậy, sau 36h nuôi cấy môi trường MRS III, sinh khối vi sinh vật ñạt giá trị cao thời ñiểm ñó, chủng C5 tương ứng số tế bào 18x107 C12 51x108 Chúng chọn thời ñiểm bổ sung vào khối lên men cà phê hạt Hình 3.5 Khả lên men tạo este chủng vi khuẩn So sánh số este hai mẫu có bổ sung vi khuẩn với mẫu ñối chứng (ĐC) cho thấy, số este hai mẫu cao so với mẫu ñối chứng Qua bảng biểu cho thấy mẫu bổ sung chủng C5 có số este cao hai mẫu lại Nhằm thử khả lên men chuyển 3.4 Nghiên cứu khả tạo este chủng giống hóa ñường hai chủng C5 C12 nuôi cấy hỗn hợp 3.4.1 Nuôi cấy chủng nào, ñã tiến hành lên men hỗn hợp hai chủng so 3.4.1.1 Bố trí thí nghiệm sánh với mẫu ñối chứng mẫu không bổ sung vi khuẩn - Mẫu M1, M2 mẫu cà phê có bổ sung vi khuẩn tương ứng C5, C12 Mẫu ñối chứng mẫu không bổ sung vi khuẩn 3.4.1.2 Kết 3.4.2 Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn C5, C12 3.4.2.1 Bố trí thí nghiệm M1: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn C5 : C12 (1:1) M2: Mẫu ñối chứng mẫu không bổ sung vi khuẩn 3.4.2.2 Kết Footer Page of 133 Header Page of 133 - 15 - - 16 - 239.86 Trong ñó: M1: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn C5 + C12 (mẫu ñối chứng) M2: mẫu bổ sung hỗn hợp vi khuẩn C5 + C12 nấm men 240 3.4.3.2 Kết Chỉ số este 230 208.15 220 380.11 210 190 M3 MĐC Chỉ số este 200 Hình 3.7 Khả tạo este hỗn hợp chủng vi khuẩn C5 C12 Dựa vào bảng kết thấy, bổ sung hỗn hợp hai 400 350 300 250 200 150 100 50 243.56 chủng giống C5 C12 vào khối lên men, số este (239,86) cao M4 M5 Mẫu Hìn lên men so với mẫu ñối chứng (208,15) mẫu bổ sung giống chủng(229,75) Như ñã biết, vi khuẩn lactic lên men dị hình sản phẩm chủ yếu tạo axit lactic Theo lý thuyết, phản ứng este xảy có mặt axit rượu Do ñó, ñể có ñược lượng rượu cao phân tử cao trình lên men có ñịnh hướng, sử dụng phương án sử dụng hỗn hợp hai chủng vi khuẩn C5 C12 với nấm men rượu vang (từ sưu tập giống viện Công nghệ sinh học quốc gia) ñể ñánh giá khả tạo este Quá trình thực nghiệm kết ñược trình bày hình 3.8 3.9 3.4.3 Nuôi cấy hỗn hợp chủng vi khuẩn C5, C12 với nấm men 3.4.3.1 Bố trí thí nghiệm Footer Page of 133 Hình 3.9: Khả tạo este hỗn hợp vi khuẩn nấm men Kết cho thấy, mẫu bổ sung nấm men có số este cao mẫu không bổ sung (380,11>243,56) Chúng chọn mô hình ñể nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng ñến số este 3.5 Nghiên cứu số yếu tố ảnh hưởng ñến số este 3.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ hỗn hợp vi khuẩn bổ sung lên men ñến số este Để xác ñịnh tỷ lệ vi khuẩn thích hợp cho hạt cà phê sau lên men có hàm lượng este cao, tiến hành bổ sung hỗn hợp vi khuẩn/khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với tỷ lệ 2%, 4%, 6%, 8% 3.5.1.1 Bố trí thí nghiệm Header Page of 133 - 17 - - 18 - Để xác ñịnh tỷ lệ vi khuẩn thích hợp cho hạt cà phê sau lên men có hàm lượng este cao, tiến hành bổ sung hỗn hợp vi lượng este cao, tiến hành bổ sung nấm men/ khối lượng hạt cà phê ứng với tỷ lệ 2%, 4%, 6%(v/w) khuẩn/khối lượng cà phê hạt tươi lên men ứng với tỷ lệ 2%, 4%, 3.5.2.2 Kết 6%, 8% Mẫu hạt cà phê sau lên men ñược ñem phân tích, kết 3.5.1.2 trình bày hình 3.13 Kết 600 356,38b 311,05d 528,12a 453,52b 500 340,47c Chỉ số este Chỉ số este 369,72a 370 360 350 340 330 320 310 300 290 280 418,26c 371,22d 400 300 200 100 Kết thể hình 3.11 cho thấy bổ sung 6% tỷ lệ hỗn hợp vi khuẩn số este cao 369,72; thấp bổ sung tỷ lệ 2% 311,05 Tỷ lệ nấm men bổ sung (%) Tỷ lệ vi khuẩn (%) Hình 3.11 Ảnh hưởng tỷ lệ vi khuẩn bổ sung ñến số este Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ nấm men bổ sung hỗn hợp vi khuẩn ñến số este Qua biểu ñồ, ta nhận thấy, tăng tỷ lệ nấm men bổ sung, số este giảm Chúng lựa chọn tỷ lệ bổ sung vi khuẩn/khối lượng hạt cà Dựa vào kết thực nghiệm, chọn tỷ lệ bổ sung phê tươi thích hợp 6% (v/w) ñể tiến hành nghiên cứu tiếp nấm men 2%, ñó số este ñạt giá trị cao (528,12) ñể theo tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men ñến số este 3.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng tỷ lệ nấm men bổ sung ñến số este 3.5.2.1 Chuẩn bị mẫu Để xác ñịnh tỷ lệ nấm men thích hợp bổ sung vào khối lên men cà phê kết hợp với hỗn hợp vi khuẩn lactic cho hạt cà phê có hàm Footer Page of 133 3.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian lên men ñến số este hạt cà phê sau lên men 3.5.3.1 Bố trí thí nghiệm Header Page 10 of 133 - 19 - - 20 - Để khảo sát ảnh hưởng thời gian lên men ñến số este tiến hành lấy mẫu phân tích sau 3, ngày lên men Kết phân tích ñược thể hình 3.15 M2: mẫu lên men cà phê hạt tươi có bổ sung hỗn hợp vi khuẩn nấm men 3.6.2 Kết Sau ngày lên men, lấy mẫu hạt ñem rửa tiến hành 3.5.3.2 Kết phân tích số este Kết thể hình 3.17 531,23a 540 520 510 565,11 501,11b 600 489,17c 500 490 480 470 Chỉ số este Chỉ số este 530 500 400 211,15 300 200 460 100 Thời gian lên men (ngày) M17 M18 Mẫu lên men Hình 3.15 Ảnh hưởng thời gian lên men ñến số este Từ kết thu ñược nhận thấy, sau ngày lên men số este ñạt cao (531,23) khoảng thời gian khảo sát Hình 3.17 Chỉ số este theo hai phương pháp lên men Sau ngày, số este có giá trị thấp (489,17) Chính vậy, Kết bảng biểu thể số este phương pháp lên chọn thời ñiểm dừng trình lên men sau ngày 3.6 So sánh hiệu lên men tạo hương cà phê hạt tươi với cà phê thóc men cà phê thóc thấp nhiều so với lên men cà phê hạt tươi (211,15