Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β galactosidase từ bacillus subtilis VTCC DVN 12 01 phân lập ở việt nam bằng kỹ thuật ep RCA và đột biến điểm định hướng tt

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA β-GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2017 Công trình hoàn thành tại: Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Quyền Đình Thi Viện Công nghệ sinh học Phản biện 1: ……………………………………… Phản biện 2: ……………………………………… Phản biện 3: ……………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án phiên thức Họp tại: Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội Vào hồi , ngày tháng năm 201 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Viện Công nghệ sinh học - Webside: http://luanvan.moet.gov.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề β-Galactosidase (hay gọi lactase), thuộc nhóm enzyme chuyển hóa saccharide, cắt gốc β-D-galactose từ đầu không khử β-galactoside galactoside poly- oligosaccharide sản phẩm chuyển hóa bậc hai Enzyme phổ biến tự nhiên tìm thấy vi sinh vật, thực vật, động vật người Trong đó, β-galactosidase sinh tổng hợp chủ yếu từ vi sinh vật nấm men, nấm mốc vi khuẩn nguồn enzyme có giá trị thương mại so với từ thực vật động vật dễ thao tác, tốc độ sinh trưởng nhanh suất tổng hợp cao β-Galactosidase ứng dụng nhiều y dược, môi trường, công nghệ sinh học đặc biệt công nghiệp chế biến sữa Với 75% dân số giới thiếu hụt enzyme lactase để phân giải lactose sữa, nên xem ứng dụng quan trọng β-galactosidase ngành công nghiệp Ngoài βgalactosidase bổ sung vào trình lên men bơ sữa để tránh kết tinh lactose nhiệt độ thấp tăng độ cho sản phẩm Đặc biệt gần đây, β-galactosidase khai thác mạnh vào việc sản xuất thực phẩm chức tổng hợp galacto-oligosaccharide (GOS) nhờ hoạt tính chuyển gốc glycosyl trình thủy phân lactose sữa để tạo thành oligosaccharide GOS sử dụng nguồn thức ăn không tiêu hóa (prebiotic) để kích thích hệ vi khuẩn hữu ích diện đường ruột Để đáp ứng nhu cầu ngành công nghiệp này, β-galactosidase từ nhiều nguồn vi sinh vật nghiên cứu khai thác Trong số β-galactosidase từ B subtilis ý khả hoạt động tối ưu khoảng pH 6-7, bền nhiệt độ 30-40°C thích hợp cho ứng dụng thủy phân lactose sữa sản phẩm chế biến khác từ sữa Đây enzyme có tiềm để ứng dụng số lĩnh vực khác B subtilis biết chủng an toàn sử dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm Bên cạnh đó, để chủ động việc ứng dụng lĩnh vực ứng dụng, bên cạnh việc sàng lọc tuyển chọn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme có hiệu suất xúc tác cao tính chất mong đợi, phát triển công nghệ DNA cho phép chủ động việc cải biến protein/enzyme để nâng cao hiệu suất xúc tác phát triển tính chất enzyme Phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên in vitro in vivo với việc lựa chọn di truyền với phương pháp sàng lọc nhanh, công cụ mạnh để phát triển enzyme với đặc tính so với ban đầu Từ lí trên, tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu vai trò số gốc axit amin tính chất β-galactosidase từ Bacillus subtilis VTCCDVN-12-01 phân lập Việt Nam kỹ thuật ep-RCA đột biến điểm định hướng” Mục đích nghiên cứu - Xác định vai trò số axit amin quan trọng β-galactosidase (LacA) từ B subtilis VTCC-DVN-12-01 - Tìm LacA đột biến có tính chất so với enzyme ban đầu Nội dung nghiên cứu - Tạo đột biến ngẫu nhiên gen (lacA) mã hóa β-galactosidase từ B subtilis VTCC-DVN-12-01 phương pháp chép lỗi DNA vòng (error prone rolling circle amplification, ep-RCA) sàng lọc dòng mang gen lacA đột biến có hoạt tính tăng có tính chất nhiệt độ hoạt động, độ bền nhiệt độ so với LacA ban đầu - Sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc protein/enzyme, kết hợp với so sánh trình tự axit amin với β-galactosidase họ xác định cấu trúc để dự đoán số axit amin quan trọng tham gia trực tiếp trình thủy phân chất LacA để từ tạo đột biến điểm định hướng nhằm tạo LacA có tính chất so với enzyme ban đầu Những đóng góp luận án (i) Xây dựng thư viện đột biến ngẫu nhiên gen lacA mã hóa β-galactosidase B subtilis VTCC-DVN-12-01 phương pháp ep-RCA với tần suất đột biến đạt 2,7 đột biến/kb (ii) Xác định sáu vị trí axit amin định đến hoạt tính LacA gồm Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372 His374 (iii) Xác định số thay đổi axit amin vị trí Ala301, Phe361 làm tăng độ bền LacA số thay đổi vị trí Leu373 làm tăng nhiệt độ hoạt động LacA Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Về khoa học: Kết nghiên cứu luận án cung cấp dẫn liệu khoa học phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên gen phương pháp lỗi DNA vòng, đột biến điểm suy biến Kết cung cấp thông tin vai trò quan trọng số axit amin β-galactosidase từ B subtilis VTCC DVN-12-01 ảnh hưởng đến hoạt tính tính chất enzyme Về ý nghĩa thực tiễn: Những kết thu áp dụng để cải biến β-galactosidase khác họ enzyme thủy phân liên kết glycoside GHF-42 (Glycoside Hydrolase Family 42) nhằm thay đổi hoạt tính phát triển tính chất enzyme * Cấu trúc luận án: Luận án gồm 130 trang (cả tài liệu tham khảo), 21 bảng 28 hình chia thành chương, phần: Mở đầu (3 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu 31 trang; Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (18 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (44 trang); Chương 4: Bàn luận (15 trang); Kết luận đề nghị (1 trang); Tóm tắt tiếng Anh (7 trang); Các công trình công bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (10 trang, gồm tài liệu tiếng Việt 119 tài liệu tiếng Anh); Phụ lục (23 trang) CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tài liệu tiếng Việt 119 tài liệu tiếng Anh để tổng kết nội dung có liên quan, bao gồm: (1) Thông tin chung β-galactosidase; (Nguồn gốc phân loại, Cấu trúc, Cơ chế phản ứng); (2) Ứng dụng; (3) Tình hình nghiên cứu trong, nước hướng nghiên cứu đề tài β-Galactosidase (β-D-galactohydrolase, E.C.3.2.1.23), thuộc nhóm enzyme chuyển hóa saccharide họ enzyme thủy phân, cắt gốc β-Dgalactose từ đầu không khử β-galactoside (CAZy, http://www.cazy.org/) Ngoài ra, β-galactosidase gọi enzyme tiêu hóa lactose hay lactase có mặt ruột non hầu hết động vật có vú giúp thủy phân lactose Enzyme ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực như: công nghiệp chế biến sữa, xử lý whey (một chất thải công nghiệp sản xuất bơ với thành phần lactose) để sản xuất ethanol, tổng hợp oligo-saccharide (GOS), công nghệ sinh học y dược Trong năm gần đây, β-galactosidase nghiên cứu tập trung vào ba hướng tìm kiếm β-galactosidase có đặc tính mới, tạo enzyme tái tổ hợp, cố định enzyme để nâng cao độ bền hướng quan tâm cải biến enzyme để tạo tính Feng CS (2005) cải biến β-glycosidase từ Thermus thermophilus đột biến ngẫu nhiên (error prone PCR) kết hợp với đột biến điểm định hướng suy biến (site-saturation mutagenesis) làm tăng hiệu suất tổng hợp trisaccharide lên 50 74%, enzyme ban đầu tổng hợp không 8% Placier CS (2009) tạo đột biến gen mã hóa β-galactosidase (BgaB) từ Geobacillus stearothermophilus KVE39 làm tăng hiệu suất tổng hợp trisaccharide 5-11 lần so với ban đầu Dong CS (2011) gây đột biến BgaB từ G stearothermophilus số axit amin tham gia liên kết trực tiếp với chất tìm thấy đột biến thay Glu thành Tyr vị trí 351 BgaB làm tăng hoạt tính thủy phân lên 3,5 lần với chất oNPG Cho đến nay, Việt Nam có số công trình nghiên cứu β-galactosidase vi vinh vật tập trung chủ yếu theo hướng thu nhận enzyme tự nhiên tái tổ hợp Năm 2007, Đặng Thị Thu CS tuyển chọn ba chủng Asperillus oryzae sinh tổng hợp β-galactosidase nội bào suất tổng hợp cao đạt 1325,6 mU/g tế bào sau tối ưu Nguyễn Thị Vân Linh CS (2012) nghiên cứu thu nhận tinh β-galactosidase từ Lactobacillus acidophilus có khối lượng phân tử 40 kDa với hiệu suất thu hồi đạt 89,9% Năm 2003, Trương Nam Hải CS lần nghiên cứu tạo chủng giống kỹ thuật di truyền để sinh tổng hiểu β-galactosidase tái tổ hợp Escherichia coli ATTC 1105 có hiệu suất cao để ứng dụng thực phẩm Nguyễn Quỳnh Uyên CS (2012) nghiên cứu biểu thành công β-galactosidase tái tổ hợp B subtilis PY79 điều khiển promoter PrrnO-RBS Gen mã hóa β-galactosidase cài vào genome B subtilis cách thay gen mã hóa amylase vật chủ Để phát triển hướng nghiên cứu với β-galactosidase Việt Nam, đề tài ứng dụng kỹ thuật chép lỗi vòng DNA đột biến điểm định hướng số vị trí axit amin dự đoán liên kết với chất nhằm tạo tính chất LacA từ B subtilis VTCC-DVN-12-01 phân lập Việt Nam Trong nghiên cứu trước LacA tái tổ hợp E coli BL21, Quyền Đình Thi CS (2011) cho thấy LacA có nhiệt độ hoạt động tối ưu 50°C hoạt động tốt nhiệt độ thấp, hoạt tính đạt 60% so với nhiệt độ tối ưu 20-25°C Bên cạnh LacA hoạt động tối ưu khoảng pH trung tính 6-7,0 bền nhiệt độ 30-40°C Đây enzyme tiềm cho ứng dụng thủy phân lactose sữa sản phẩm chế biến khác từ sữa CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.1Vật liệu hóa chất nghiên cứu Gen lacA (2061 bp, mã số EU585783) mã hóa cho β-galactosidase (LacA) từ B subtilis VTCC-DVN-12-01 (B subtilis G1) đưa vào pET22b(+) BamHI NotI tạo thành plasmid tái tổ hợp pElacA tạo theo nghiên cứu trước Plasmid pElacA sử dụng để tạo thể đột biến LacA chép lỗi DNA vòng Chủng Escherichia coli JM109(DE3) [endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk-, mk ), relA1, supE44, λ-, ∆(lac-proAB), [F’, traD36, proAB, lacIqZ∆M15], IDE3] (Promega Corp, Madison, WI) dùng để biểu LacA ban đầu LacA đột biến + Hóa chất thí nghiệm dạng tinh khiết mua từ hãng hóa chất có uy tín Sigma, Invitrogen, Thermo (Mỹ), Qiagen, Bio basic (Canada), Merck (Đức) Các dung dịch đệm dùng cho thí nghiệm pha theo hướng dẫn thí nghiệm chuẩn Các thiết bị sử dụng làm thí nghiệm có độ xác cao thuộc Phòng Công nghệ sinh học Enzyme Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam 1.2Phương pháp nghiên cứu 1.2.1 Phương pháp vi sinh vật Thư viện dòng E coli mang gen lacA đột biến tạo dòng môi trường LB có bổ sung 50 µg/ml ampicillin; Dòng E coli tái tổ hợp mang gen lacA lacA đột biến nuôi cấy biểu LB có bổ sung 50 µg/ml ampicillin cảm ứng mM IPTG 1.2.2 Phương pháp hóa sinh Tinh LacA-WT LacA đột biến sắc ký lực qua cột ProBond resin (Invitrogen); Chạy điện di gel polyacrylamide (SDS-PAGE) theo phương pháp Lemmli (1970); Điện di agarose; Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford (1975); Xác định hoạt tính β-galactosidase theo phương pháp Miller (1959); Nghiên cứu đặc điểm LacA-WT LacA đột biến (Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến hoạt tính enzyme; Ảnh hưởng nhiệt độ pH đến độ bền enzyme; Ảnh hưởng nồng độ chất đến độ bền enzyme; Động học phản ứng enzyme); Đánh giá khả chuyển hóa glycoside LacA sắc ký lớp mỏng TLC 1.2.3 Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp chép lỗi vòng DNA ep-RCA sử dụng để tạo đột biến ngẫu nhiên gen lacA phản ứng RCA có bổ sung Mn2+ để làm giảm tính đặc hiệu DNA polymerase Phản ứng RCA thực kit amplification TempliPhi 100 (Healthecare) Đột biến điểm định hướng sử dụng cặp mồi có ba suy biến nucleotide ‘NNK’ vị trí cần gây đột biến phản ứng PCR Các phương pháp sinh học phân tử khác tách chiết, tinh plasmid; Biến nạp plasmid hóa học, biến nạp xung điện; Các kỹ thuật cắt, nối DNA; tham khảo theo Sambrook Ruessell (2001) Giải trình tự phân tích gen theo Sanger (1975) 1.2.4 Phương pháp phân tích số liệu Phần mềm Microsoft Excel xử dụng để xử lý số liệu thu trình thực nghiệm, tính giá trị tham số thống kê Phần mềm Dolphin 1D dùng để phân tích đánh giá mức độ biểu tinh Chương trình DNA star dùng để phân tích so sánh trình tự nucleotide chủng βgalactosidase tự nhiên đột biến Chương trình Phyre2 (Kelley et al., 2015) dùng để phân tích cấu trúc 3DligandSite (Wass et al., 2010) phân tích mối tương tác vùng xúc tác LacA LacA đột biến CHƯƠNG KẾT QUẢ 1.3Tạo đột biến ngẫu nhiên 1.3.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên gen lacA Gen lacA mã hóa β-galactosidase (LacA) từ B subtilis VTCC-DVN-12-01 đưa vào plasmid pET22b(+) tạo thành plasmid tái tổ hợp pELacA biểu dạng thể tan E coli BL21 nghiên cứu trước (Quyen et al., 2011) Trong nghiên cứu này, plasmid pELacA dùng làm khuôn để tạo đột biến ngẫu nhiên gen lacA phản ứng ep-RCA có tham gia Φ29 polymerase ion Mn2+ (yếu tố tạo đột biến) Mn2+ bổ sung vào phản ứng với nồng độ 0,5; 1,0; 1,5 mM Sản phẩm ep-RCA tạo phản ứng có bổ sung MnCl2 nồng độ từ 0,5-1,5 mM Sản phẩm khuếch đại nằm vùng có kích thước từ 1000 đến 10.000 bp, chủ yếu tập chung thành băng có kích thước lớn 10.000 bp (Hình 3.1, 1-3) Những đoạn DNA có hai nhiều trình tự pELacA lặp lại (multimer) Nồng độ Mn 2+ tăng sản phẩm ep-RCA giảm nồng độ mM, Φ29 polymerase bị ức chế hoàn toàn nên sản phẩm ep-RCA không tạo (Hình 3.1, 4) Sau 24 ủ 30°C, 25 pg khuôn pELacA ban đầu khuếch đại có hàm lượng từ 52,3-25,5 ng/µl tương ứng với nồng độ 0,5-1,5 mM MnCl bổ sung phản ứng bp 10.000 → M Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm plasmid pELacA sau phản ứng ep-RCA Phản ứng ep-RCA bổ sung 0,5 mM Mn2+ (làn 1); mM (làn 2) 1,5 mM (làn 3); thang DNA chuẩn (M) 1000 → Tần suất xuất đột biến gen lacA cao nồng độ 1,5 mM MnCl 2, đạt 2,7 ± 2,1 đột biến/kb Trong có hai dạng đột biến đột biến thay 11 Kết xác định hoạt tính riêng với chất oNPG 50°C đệm 0,1 M Naphosphate pH 7,0 LacA-WT LacA đột biến điểm sau tinh xác định đột biến Ala301Val dòng 2.461 làm giảm hoạt tính 23,69% Phe361Tyr dòng 3.259 làm giảm hoạt tính 44,42% so với ban đầu Hai vị trí đồng thời làm tăng độ bền nhiệt LacA Ala301Val giữ 25,57% Phe361Tyr giữ 90,02% hoạt tính so với trước ủ 50°C Như vậy, hai vị trí axit amin Ala301 Phe361 có vai trò quan trọng với LacA 1.4Tạo đột biến điểm suy biến Để đánh giá mức độ ảnh hưởng axit amin vị trí Ala301, Phe361 đến hoạt tính thủy phân LacA, hai vị trí tạo đột biến thay axit amin khác cặp mồi suy biến có ba nucleotide “NNK” vị trí cần tạo đột biến Bên cạnh đó, axit amin tham gia liên kết trực tiếp với chất trình thủy phân LacA xác định để tạo đột biến suy biến nhằm tìm kiếm đột biến làm tăng hoạt tính làm thay đổi tính chất LacA 1.4.1 Xác định vùng liên kết chất LacA Dựa vào chương trình Phyre2, cấu trúc LacA xác định xác định (Kelley et al., 2015) Trong vùng xúc tác, axit amin Arg120, Asn158, Glu159, Trp331, Phe361 Glu371 dự đoán liên kết với chất chương trình 3DLigandSite (Wass et al., 2010) Các axit amin tạo hai liên kết với galactose, 11 liên kết với phân tử glucose hai liên kết với ion canxi Trong vị trí Arg120, Glu159 Phe361 dự đoán liên kết trực tiếp với chất Các vị trí lại tương tác với chất qua liên kết khác ion, Val-der-Waal Kết dự đoán cho thấy vị trí Phe361 xác định ảnh hưởng đến hoạt tính độ bền nhiệt LacA vị trí dự đoán có liên kết với chất Mặt khác, sử dụng công cụ dự đoán cấu trúc SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive), kết hợp với ClustalX (version 1.81; Thompson et al., 2008) so sánh nhiều trình tự protein β-galactosidase thuộc họ GHF-42 so sánh với β-galactosidase biết cấu trúc tinh thể Thermus thermophilus A4 (Hidaka et al., 2002) để định hướng xác định axit amin Glu159 Glu323 trung tâm hoạt động, axit amin Arg120, Asn158, Glu159, Trp331, Glu323 vùng gồm bốn axit amin Glu371, Lys372, Leu373, His374 tham gia liên kết với chất Kết dự đoán có bốn vị trí Arg120, Asn158, Trp331 Glu323 trùng với kết dự đoán chương trình 3DLigandSite 12 Như vậy, tám axit amin xác định liên kết với chất Arg120, Asn158, Trp331, Phe361, Glu371, Lys372, Leu373, His374 với axit amin Ala301 xác định ảnh hưởng đến hoạt tính thủy phân độ bền nhiệt LacA thu tạo đột biến ngẫu nhiên sử dụng để tạo đột biến điểm suy biến cho vị trí nhằm đánh giá sâu vai trò chúng trình thủy phân chất ảnh hưởng đến tính chất enzyme 1.4.2 Tạo thư viện đột biến điểm suy biến Từ vị trí axit amin xác định có vai trò quan trọng với LacA Ala301, Arg120, Asn158, Trp331, Phe 361, Glu371, Lys372, Leu373 His374, chín thư viện đột biến điểm suy biến tạo Khuôn plasmid pELacA dùng làm khuôn để khuếch đại toàn khuôn pELacA với cặp mồi thiết kế với ba nucleotide “NNK” vị trí cần gây đột biến bp p 10000→ 6000→ M bp M 10000→ 6000→ Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại khuôn pElacA với cặp mồi đột biến Ala301X (1), Phe361X (2), His374X (3), Arg120X (4), Asn158X (5), Trp331X (6), Glu371X (7), Lys372X (8), Leu373X (9); thang DNA chuẩn (M) Sản phẩm PCR với cặp mồi đột biến vị trí khuếch đại đặc hiệu với băng có kích thước khoảng 7500 bp, tương ứng kích thước plasmid tái tổ hợp pELacA (Hình 3.9) Sản phẩm PCR sau đóng vòng trở lại với T4 ligase biến nạp vào E coli JM109(DE3), chọn lọc môi trường LB có bổ sung 100 µg/ml ampicillin tạo thành thư viện đột biến điểm suy biến 1.4.3 Sàng lọc hoạt tính, chọn dòng phân tích trình tự lacA đột biến điểm suy biến Khoảng 1000-1200 dòng mang gen lacA đột biến từ thư viện đột biến chọn ngẫu nhiên để sàng lọc hoạt tính thủy phân với chất oNPG đĩa 96 giếng Kết sàng lọc hoạt tính dòng từ thư viện đột biến Phe361 cho thấy 98,04% dòng hoạt tính, 0,3% dòng giảm hoạt tính 1,66% dòng có hoạt tính ngang với ban đầu Một điều đáng ý vị trí Phe361 phân tích trình tự gen lacA dòng đột biến có hoạt tính giảm 40-55% so với chủng ban đầu cho thấy Phe thay Tyr Như vậy, vị trí Phe thay axit amin (ngoại trừ Tyr) làm 13 hoạt tính LacA Với thư viện đột biến Ala301, tỉ lệ dòng hoạt tính chiếm 15,4 phần lớn dòng bị giảm hoạt tính so với ban đầu (chiếm 83,2%) Kết chứng tỏ việc thay Ala vị trí 301 ảnh hưởng làm giảm hoạt tính mà không làm hoàn toàn hoạt tính thủy phân LacA Phân tích trình tự ngẫu nhiên hai dòng giảm hoạt tính 36-45% so với chủng ban đầu, tìm thấy thêm thay Ala thành Glu Tyr (Hình 3.9) ↑ Ala524 Wild-type ↑ Ala301Tyr ↑ Hình 3.9 Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Ala301 LacA-WT LacA đột biến Ala301Glu Hình 3.10 Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Leu373 LacA-WT LacA đột biến 14 Tại vị trí Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372, Leu373, His374 chothấy việc tạo đột biến thay axit amin vị trí ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính thủy phân LacA Các đột biến thay axit amin vị trí Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372, His374 làm hoàn toàn hoạt tính Phân tích ngẫu nhiên số dòng hoạt tính vị trí cho thấy có đột biến thay Arg120Phe, Arg120Thr, Arg120Val, Trp331Val, Glu371Trp, His374Pro Riêng vị trí Leu373, tìm thấy hai thay đổi axit amin Leu thành Cys Met làm giảm hoạt tính thủy phân xuống 75 38% so với LacA-WT (Hình 3.10) 1.4.4 Tinh xác định hoạt tính riêng LacA đột biến điểm suy biến Để đánh giá xác đột biến Ala301Glu, Ala301Tyr, Arg120Phe, Arg120Thr, Arg120Val, Trp331Val, Glu371Trp, Leu373Cys, Leu373Met His374Pro ảnh hưởng đến hoạt tính LacA, LacA đột biến tinh để xác định hoạt tính riêng Kết kiểm tra protein tổng số tế bào dòng đột biến cho thấy đột biến không ảnh hưởng đến mức độ biểu LacA Mức độ biểu LacA dòng đạt 14,23% - 15,34% protein tổng số tế bào Các LacAWT đột biến tinh 4,05-5,35 lần qua cột sắc ký lực Ni 2+ với hiệu suất thu hồi đạt 66,23-76,34%và có độ 98% phân tích phần mềm Dolphin 1D Sản phẩmtinh cho băng có khối lượng khoảng 70 kDa (Hình 3.12) kDa 116 → 66 → 45 → 35 → 25 → 18 → M kDa 116 → ← 66 → M 10 11 ← 45 → 35 → 25 → 18 → Hình 3.12 SDS-PAGE LacA tinh từ số dòng đột biến điểm Ala301Glu (1), Ala301Tyr (2), Arg120Phe (3), Arg120Thr (4), Arg120Val (5), Trp331Val (6), Glu371Trp (7), Leu373Met (8), Leu373Cys (9) His374Pro (10), Wild-type (11); thang protein chuẩn (M) LacA-WT LacA đột biến sau tinh xác định hoạt tính với chất oNPG kết cho thấy đột biến Ala301Glu Ala301Tyr làm giảm 15 hoạt tính xuống 51,1 50,4% so với ban đầu, giảm so với đột biến A301V (23,69%) (Bảng 3.12) Các đột biến Arg120Phe, Arg120Thr, Arg120Val, Glu371Trp His374Pro làm LacA gần hoạt tính, giống với kết sàng lọc hoạt tính dòng đột biến Hai đột biến vị trí Leu373 Leu373Met L373Cys hoạt tính giảm 72,79% 29,66% so với ban đầu Bảng 3.12 Hoạt tính đặc hiệu LacA ban đầu LacA đột biến với chất oNPG Enzyme Hoạt tính riêng (IU/mg) % Hoạt tính so với ban đầu LacA-WT 2,45 ± 0,045 100 Phe361Tyr 0,59 ± 0,014 44,42 Ala301Val 1,11 ± 0,075 23,69 Ala301Glu 1,25 ± 0,015 51,1 Ala301Tyr 1,23 ± 0,02 50,4 Arg120Phe 0,073 ± 0,003 2,98 Arg120Thr 0,117 ± 0,005 4,77 Arg120Val 0,063 ± 0,003 2,57 Trp331Val 0,229 ± 0,002 9,34 Glu371Trp 0,141 ± 0,011 5,75 Leu373Cys 0,727 ± 0,022 29,66 Leu373Met 1,784 ± 0,044 72,79 His374Pro 0,166 ± 0,003 6,77 1.5Đánh giá tính chất lý hóa LacA đột biến Từ kết tạo đột biến thu trên, dòng đột biến giữ phần hoạt tính Phe361Tyr (44,42%), Ala301Val (23,69%), Ala301Glu (51,1%), Ala301Tyr (51,1%), Leu373Cys (29,66%) Leu373Met (72,79%) tiếp tục xác định tính chất lý hóa để đánh giá thêm tác động axit amin thay đến tính chất enzyme 1.5.1 Nhiệt độ pH hoạt động tối ưu Nhìn chung, LacA-WT LacA đột biến khác biệt nhiều nhiệt độ hoạt động tối ưu, LacA hoạt động tốt khoảng nhiệt độ 50-55°C hoạt động tối ưu 55°C Tuy nhiên 60°C, hoạt tính bắt đầu giảm mạnh LacA-WT LacA-361Tyr, hoạt tính tương ứng 33% (8,47 IU/mg) 36,8% (0,39 IU/mg) so với nhiệt độ tối ưu đột biến thay Ala301 Val, Glu Tyr có hoạt tính 71,98, 57,4 48,4% so với nhiệt độ tối ưu (Hình 3.13) Đặc biệt LacA-373Cys hoạt động tốt, hoạt tính đạt 0,81 ± 0,002 IU/mg tương đương 98,7% so với nhiệt độ tối ưu 55°C ngang với LacA-WT 16 (0,85 ± 0,006 IU/mg) (Hình 3.13) LacA-373Met đạt 1,4 ± 0,047 IU/mg, 70,5% so với nhiệt độ tối ưu cao 1,65 lần so với LacA-WT Sự thay đổi axit amin vị trí Ala301, Phe361 Leu373 không làm ảnh hưởng đến pH hoạt động tối ưu LacA LacA-WT đột biến hoạt động tốt khoảng pH 6-7 đạt cực đại pH 6,5 Hình 3.13 Nhiệt độ hoạt động tối ưu LacA-WT LacA đột biến 1.5.2 Ảnh hưởng pH đến độ bền LacA tự nhiên đột biến Kết xác định hoạt tính lại LacA-WT LacA đột biến Ala301Glu, Ala301Val, Ala301Tyr, Phe361Tyr, Leu373Cys Leu373Met thời điểm khác 72 cho thấy độ bền pH 4-9 LacA-WT LacA đột biến nhiều khác biệt Các enzyme bền pH 5-9, giữ 90% hoạt tính so với ban đầu sau 72 ủ 30°C Ở pH 4, hoạt tính LacA-WT LacA đột biến giảm nhanh, 41,52-57% so với ban đầu sau 16,21-32,62% sau 72 ủ 1.5.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền LacA tự nhiên đột biến 3.3.3.1 Độ bền nhiệt độ LacA-WT LacA đột biến dung dịch đệm LacA-WT LacA đột biến ủ đệm 0,1 M Na-photphate pH 7,0 nhiệt độ từ 30-50°C Hoạt tính lại enzyme sau ủ 30 40°C từ 6-72 cho thấy LacA-WT LacA đột biến Ala301Val, Al301Glu, Ala301Tyr, Phe361Tyr, Leu373Cys Leu373Met bền nhiệt độ 30 40°C, hoạt tính lại sau 72 ủ giữ từ 92-98% Khi tăng nhiệt độ ủ lên 45 50°C, độ bền LacA đột biến LacA tự nhiên có khác biệt Ở 45°C, LacA đột biến bền so với LacA-WT (Hình 3.16A) LacA-WT hoạt tính sau 12 ủ 45°C, LacA đột biến Ala301Val, Ala301Glu, Ala301Tyr, Leu373Cys, Leu373Met giữ 16,15%-50,41% thời điểm Đặc biệt đột biến thay Phe Tyr vị trí 361 làm tăng rõ rệt độ bền LacA 45°C với thời gian bán hủy 83,89 ± 0,78 giờ, cao gấp 26,8 lần so với LacA ban đầu (3,13 ± 0,14 giờ) Thời gian bán 17 hủy LacA đột biến Ala301Val, Ala301Glu, Ala301Tyr, Leu373Cys cao từ 1,32 đến 2,4 lần so với LacA-WT (Bảng 3.14) Với nhiệt độ ủ 50°C, LacA-361Tyr cho thấy độ bền tốt so với LacA-WT LacA đột biến khác, LacA-373Cys bền nhiệt độ (Hình 3.16B) Thời gian bán sống LacA-361Tyr LacA-373Cys 5,42 1,39 giờ, gấp 12,9 3,31 lần so với LacA-WT (0,42 giờ) (Bảng 3.14) Khi tăng nhiệt độ ủ lên 55°C, hoạt tính thủy phân LacA-WT LacA đột biến bị nhanh, hoạt tính hoàn toàn sau 20 phút ủ A B Hình 3.16 Độ bền LacA-WT LacA đột biến 45°C (A) 50°C (B) 3.3.3.2 Độ bền nhiệt độ LacA-WT LacA đột biến điều kiện có chất Cũng 45 50°C đệm có bổ sung chất oNPG nồng độ 5-15%, LacA-WT LacA đột biến Leu373Cys Leu373Met có độ bền tăng mạnh so với ủ đệm tăng cao nồng độ 5% chất Thời gian bán sống LacA-373Cys LacA-373Met tăng 1,38-10,94 lần 45°C 1,2-5,6 lần 50°C có mặt chất Trong đáng ý, 45°C điều kiện có chất đệm ủ, thời gian bán sống LacA-373Met cao gấp 1,4-2,04 lần so với LacA-WT cao gấp 1,7-2,3 lần LacA-373Cys (Bảng 3.14) Trong đó, đột biến Phe361Tyr tăng nhẹ đột biến vị trí Ala301 không thay đổi (Bảng 3.14) Tuy nhiên đệm bổ sung 5% chất, thời gian bán sống Phe61Tyr gấp 3,4 lần LacA-WT 45°C 1,6 lần 50°C 18 19 1.5.4 Động học LacA tự nhiên đột biến Động học LacA với chất oNPG xác định dựa vào phương trình tuyến tính với dải nồng độ chất 1- mg/ml Tất LacA đột biến có số Michaelis (Km) giảm so với LacA-WT, nhiên mức giảm không đáng kể Như đột biến vị trí Ala301, Phe361 Leu373 làm tăng lực LacA với chất oNPG Mặc dù vậy, tốc độ quay vòng (K cat) thủy phân chất oNPG LacA đột biến giảm dẫn đến hiệu suất xúc tác (K cat/Km) giảm so với LacA-WT (Bảng 3.15) Bảng 15 Các thông số động học LacA-WT đột biến với chất oNPG Enzyme Vmax (IU/mg) Km (mM) Kcat (s-1) Kcat/Km s-1 mM-1 Kcat/Km (%) LacA-WT 2,61 ± 0,12 9,28 ± 0,72 21,74 ± 0,99 2,35 ± 0,08 100 LacA-301Val 0,76 ± 0,02 5,57 ± 0,56 3,72 ± 0,09 0,67 ± 0,08 28,65 LacA-301Glu 0,89 ± 0,02 7,49 ± 0,71 7,40 ± 0,17 0,99 ± 0,02 42,08 LacA-301Tyr 1,01 ± 0,07 7,48 ± 0,19 9,14 ± 1,88 1,22 ± 0,22 51,90 LacA-361Tyr 1,03 ± 0,03 8,02 ± 0,27 8,56 ± 0,24 1,07 ± 0,01 45,50 LacA-373Cys 0,89 ± 0,07 7,81 ± 1,25 7,38 ± 0,60 0,95 ± 0,07 40,56 LacA-373Met 1,61 ± 0,07 7,27 ± 0,6 13,39 ± 0,61 1,85 ± 0,07 78,56 1.5.5 Ảnh hưởng đột biến đến khả tạo oligosaccharide β-Galactosidase xúc tác thủy phân chất qua hai giai đoạn với kiểu phản ứng thủy phân chuyển gốc galactosyl Để đánh giá thêm ảnh hưởng đột biến đến tính chất enzyme bước phản ứng chuyển phần galactosyl từ sản phẩm trung gian đến chất nhận chứa nhóm hydroxyl, 0,25 IU LacA-WT LacA đột biến bổ sung vào phản ứng chuyển hóa chất oNPG với chất nhận cellobiose để kiểm tra khả tạo sản phẩm chuyển hóa LacA Phản ứng thực 40°C (nhiệt độ bền cho LacA-WT LacA đột biến) C ← oNPG ← Galactose ← Cellobiose ← Sản phẩm chuyển hóa giờ Hình 3.17A Sắc ký mỏng sản phẩm chuyển hóa LacA-WT LacA đột biến vị trí 301 Hỗn hợp chất oNPG cellobiose (C); Ala301Val (1, 4), Ala301Glu (2, 5), Ala301Tyr (3, 6) 20 C1 ← oNPG ← Galactose ← Cellobiose ← Galactose ← Cellobiose ← Sản phẩm chuyển hóa ← Sản phẩm chuyển hóa C2 ← oNPG Hình 3.17B Sắc ký mỏng sản phẩm chuyển hóa LacA-WT LacA đột biến vị trí Phe361 Leu373 Hỗn hợp chất oNPG cellobiose (C1), cellobiose (C2); WT (1, 7), Phe361Tyr (2, 8), Leu373Cys (3, 5) Leu373Met (4, 6) Kết cho thấy điều kiện nồng độ chất oNPG cao, với số đơn vị hoạt độ (0,25 IU) sản phẩm chuyển hóa tạo từ phản ứng LacA301Glu, LacA-301Val LacA-301Tyr sau ủ (Hình 3.18A, 1-3 46) thấp so với LacA-WT LacA đột biến Phe361Tyr, Leu373Cys, Leu373Met (Hình 3.18B, 1-4 6-8) Sản phẩm chuyển hóa LacA đột biến Phe361Tyr, Leu373Cys, Leu373Met sau tương đương tương đương với LacA-WT Hầu hết galactose từ oNPG chuyển đến chất nhận cellobiose để tạo thành sản phẩm chuyển hóa galactose-cellobiose 1.6Phân tích ảnh hưởng đột biến đến cấu trúc LacA Theo kết sàng lọc hoạt tính từ thư viện đột biến cho thấy hầu hết vị trí Ala301, Arg120, Asn158, Trp331, Phe361, Glu371, His372, Leu373 His374 cho thấy hầu hết vị trí làm hoạt tính LacA bị thay axit amin khác Chỉ có ba vị trí Ala301, Phe361 Leu373 tìm đột biến làm giảm mà không làm hoàn toàn hoạt tính có số thay đổi tính chất LacA Do LacA đột biến ba vị trí tiếp tục phân tích cấu trúc chương trình Phyre2 3DLigandSite để thấy rõ ảnh hưởng đột biến đễn cấu trúc mối tương tác với chất vùng xúc tác 1.6.1 Ảnh hưởng Ala301 đến cấu trúc LacA Kết phân tích cấu trúc bậc hai cho thấy axit amin Glu, Tyr Val thay cho Ala vị trí 301 làm thay đổi xoắn anpha vị trí 96-97, 196-197, 463-464 cấu trúc bậc hai LacA, dẫn đến thay đổi mối tương tác, số liên kết khoảng cách liên kết axit amin với chất vùng trung tâm xúc tác (Hình 3.20) 21 Ca LacA-WT Ca Ca Ala301Glu Zn Ca Ala301Tyr Ala301Val Hình 3.20 Mối tương tác với chất vùng trung tâm LacA-WT đột biến Ala301 Mối liên kết axit amin vùng trung tâm dự đoán liên kết với chất có màu xanh lam Trong liên kết với galactose xây dựng dựa cấu trúc βgalactosidase (1kwk_A) T thermophilus 1xc6_A Penicillium sp.; liên kết với glucose dựa beta-amylase (1j18_A, 1veo_A) từ B cereus, 1j18_A B cereus var mycoides Các liên kết axit amin khác với ion Ca, glucose, galactose (màu xanh lục, vàng) dự đoán dựa vào endoglucanase 1qhz_ A 1qi0_A từ Bacillus agaradhaerens 1.6.2 Ảnh hưởng Phe361 đến cấu trúc LacA Ca LacA-WT Ca Phe361Tyr Hình 3.23 Phân tích mối tương tác với chất vùng trung tâm LacA-WT LacA-361Tyr Các mối tương tác (màu xanh lam) vùng trung tâm hoạt động LacA-WT LacA-361Tyr xác định chương trình 3DLigandSite Các liên kết vị trí 361 nằm khoanh màu đỏ 22 Tại vị trí Phe361, thay Tyr cho Phe làm thay đổi xoắn anpha vị trí 96-97, 196-197, 463-464 478-479 cấu trúc bậc hai LacA, dẫn đến làm thay đổi cấu trúc không gian ba chiều LacA vùng nối phần tận đầu C mối tương tác khác vùng liên kết chất, số liên kết khoảng cách liên kết axit amin với chất vùng trung tâm xúc tác (Hình 3.23) Kết phân tích liên kết Tyr thay Phe vị trí 361 cho thấy đột biến làm giảm liên kết với glucose so với tổng số 11 liên kết LacA-WT 1.6.3 Ảnh hưởng Leu373 đến cấu trúc LacA Khi phân tích cấu trúc LacA đột biến vị trí Leu373 cho thấy đột biến thay Cys Met cho Leu làm thay đổi số xoắn anpha vị trí 96-97, 196-197 xoắn beta vị trí 377-378 cấu trúc bậc hai LacA liên kết vùng trung tâm xúc tác (Hình 3.25) dẫn đến làm giảm số liên kết với chất Zn Ca Ca LacA-373Cys LacA-WT Zn Ca LacA-373Met Hình 3.25 Kết phân tích mối tương tác với chất vùng trung tâm LacA-WT LacA đột biến Leu373 Vùng trung tâm hoạt động LacA với mối tương tác axit amin dự đoán liên kết với chất trình thủy phân (màu xanh lam); mối tương tác axit amin khác phân tử LacA, ion Ca, Zn glucose, galactose (màu xanh lục, hồng, vàng) CHƯƠNG THẢO LUẬN Tạo đột biến ngẫu nhiên phương pháp ep-RCA, đột biến điểm định hướng với phân tích mô hình phân tử 3D công cụ mạnh để nghiên 23 cứu phát triển tính chất enzyme Việc sử dụng kết hợp công cụ nghiên cứu cải biến β-galactosidase thuộc họ GHF-42 từ B subtilis VTCC DVN- 01-12 phân lập Việt Nam tìm số axit amin quan trọng làm thay đổi tính chất enzyme Qua kết tạo đột biến ngẫu nhiên, đột biến điểm định hướng dự đoán số vị trí liên kết với chất LacA, axit amin Ala301, Arg120, Asn158, Trp331, Phe361, Glu371, Lys372, Leu373 His374 xác định có vai trò quan trọng với LacA Trong vị trí Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372 His374 quan trọng thay axit amin vị trí làm hoàn toàn hoạt tính thủy phân LacA Các vị trí cho thấy tính bảo thủ cao β-galactosidase họ GHF-42 Chính vậy, việc thay axit amin khác vị trí làm đứt gãy liên kết hydro enzyme chất nên tác động mạnh đến hoạt tính enzyme Kết tương tự với số công bố nghiên cứu cải biến β-galactosidase thuộc họ GHF-42 Các vị trí Ala301, Phe361 Leu373 ảnh hưởng mạnh đến hoạt tính LacA vị trí tìm thấy đột biến thay không làm hoàn toàn hoạt tính mà làm giảm phần hoạt tính đồng thời làm thay đổi số tính chất LacA Axit amin Ala301 không dự đoán vị trí liên kết với chất trình thủy phân, thay axit amin khác Glu, Tyr, Val vị trí làm giảm hoạt tính LacA đột biến làm thay đổi số xoắn anpha cấu trúc bậc hai LacA dẫn đến thay đổi mối tương tác, số liên kết khoảng cách liên kết axit amin vùng xúc tác với chất Tuy nhiên đột biến lại làm tăng khả hoạt động LacA 60°C làm tăng độ bền nhiệt enzyme Hai vị trí Phe361 Leu373 dự đoán liên kết trực tiếp với chất trình thủy phân, đột biến thay hai vị trí làm thay đổi số xoắn anpha beta cấu trúc bậc hai dẫn đến thay đổi mối tương tác khác vùng liên kết chất, làm giảm số liên kết với chất dẫn đến làm giảm hoạt tính LacA Tuy nhiên đột biến Phe361Tyr làm tăng mạnh độ bền nhiệt enzyme 45-50°C đệm 0,1 M Na-phosphate pH 7,0, thời gian bán sống cao gấp 26,8 12,7 lần so với LacA ban đầu Tyr có thêm nhóm hydroxyl vị trí C4 so với Phe tương tác với nhóm carboxyl phân tử LacA làm tăng độ bền LacA-361Y Trong đó, đột biến thay Leu Cys Met vị trí 373 làm tăng hoạt động LacA 60 °C, độ bền nhiệt điều kiện có mặt chất khả tổng hợp sản phẩm chuyển hóa oligo-saccharide 24 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Xây dựng thư viện đột biến ngẫu nhiên gen mã hóa β-galactosidase (lacA) từ B subtilis VTCC-DVN-01-12 phương pháp epRCA với tần suất tạo đột biến cao đạt 2,7 ± 2,1 đột biến/kb nồng độ 1,5 mM Mn2+ Trong số axit amin dự đoán liên kết với chất (Arg120, Asn158, Trp331, Phe361, Glu371, Lys372, Leu373 His374) có vị trí ảnh hưởng định đến hoạt tính LacA gồm Arg120, Asn158, Trp331, Glu371, Lys372 His374 Các đột biến thay vị trí làm hoạt tính LacA Một số thay đổi axit amin vị trí Ala301, Phe361 làm tăng độ bền LacA Các đột biến thay Ala Glu, Tyr, Val vị trí 301 làm giảm hoạt tính thủy phân 23,69-51,1% làm tăng độ bền nhiệt LacA với thời gian bán hủy tăng 1,3-2,4 lần 45-50°C so với LacA-WT Đột biến thay Phe361Tyr làm giảm hoạt tính 44,42% làm tăng mạnh độ bền nhiệt với thời gian bán hủy tăng 26,8 lần 45°C 12,7 lần 50°C Một số thay đổi axit amin vị trí Leu373 làm tăng nhiệt độ hoạt động LacA Các đột biến thay Leu373Cys Leu373Met làm giảm hoạt tính 29,66% 72,79% làm tăng khả hoạt động nhiệt độ cao Hoạt tính LacA-373Cys với LacA-WT LacA-373Met tăng 1,65 lần so với LacAWT 60°C Kiến nghị Nghiên cứu kết hợp đồng thời đột biến hai hay nhiều vị trí để tìm đột biến làm tăng hoạt tính LacA đột biến tạo tính chất enzyme Sàng lọc LacA đột biến vị trí Ala301, Phe361 Leu373 với số chất khác để tìm kiếm khả thủy phân chất enzyme đột biến CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Thao Thi Nguyen, Hanh Van Vu, Nhung Thi Hong Nguyen, Tuyen Thi Do and Thanh Sy Le Nguyen (2016) Effect of mutations to axit amin A301 and F361 in thermostability and catalytic activity of the β-galactosidase from Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 BMC Biochemistry, 17:15, SCIE Nguyễn Thị Thảo, Vũ Văn Hạnh, Lã Thị Là, Quyền Đình Thi (2011) Nâng cao hoạt tính beta-galactosidase từ Bacillus subtilis G1 kỹ thuật chép lỗi vòng DNA Tạp chí công nghệ sinh học, 9(4A): p 699-704 Nguyễn Thị Hồng Nhung, Nguyễn Thị Thảo, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi, Vũ Đình Hòa, Nguyễn Hữu Đức (2013) Đánh giá ảnh hưởng số axit amin vùng liên kết chất đến hoạt tính β-galactosidase từ Bacillus subtilis G1 Tạp chí Khoa học Phát triển, 6(11): 850-856 ... số gốc axit amin tính chất β- galactosidase từ Bacillus subtilis VTCCDVN -12- 01 phân lập Việt Nam kỹ thuật ep- RCA đột biến điểm định hướng Mục đích nghiên cứu - Xác định vai trò số axit amin quan... dụng kỹ thuật chép lỗi vòng DNA đột biến điểm định hướng số vị trí axit amin dự đoán liên kết với chất nhằm tạo tính chất LacA từ B subtilis VTCC- DVN- 12- 01 phân lập Việt Nam Trong nghiên cứu trước... biến β- galactosidase thuộc họ GHF-42 từ B subtilis VTCC DVN- 01 -12 phân lập Việt Nam tìm số axit amin quan trọng làm thay đổi tính chất enzyme Qua kết tạo đột biến ngẫu nhiên, đột biến điểm định