Nghiên cứu vai trò của một số gốc axit amin đối với tính chất của β galactosidase từ bacillus subtilis VTCC DVN 12 01 phân lập ở việt nam bằng kỹ thuật ep RCA và đột biến điểm định hướng

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THẢO NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA -GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC-DVN-12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - 2017 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA -GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC-DVN12-01 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM BẰNG KỸ THUẬT ep-RCA VÀ ĐỘT BIẾN ĐIỂM ĐỊNH HƯỚNG Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Quyền Đình Thi Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới cố PGS TS Quyền Đình Thi, nguyên Trưởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, nguyên Phó Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, biên tập thảo báo tạo điều kiện hóa chất, thiết bị kinh phí để hoàn thành Luận án Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh, Trưởng phòng Các chất chức sinh học, Viện Công nghệ sinh học sửa thảo báo cho sử dụng số liệu khuôn khổ đề tài “Nâng cao hoạt tính xúc tác enzyme tái tổ hợp β-galactosidase kỹ thuật chép lỗi DNA vòng đột biến điểm trực tiếp” thuộc đề tài Nghiên cứu 2011-2012 Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ Quốc gia TS làm chủ nhiệm Tôi xin cảm ơn GS TS Trương Nam Hải, nguyên Trưởng phòng Kỹ thuật di truyền, nguyên Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học giúp đỡ hướng dẫn phân tích cấu trúc enzyme Tôi xin cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, phụ trách phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Viện Công nghệ sinh học giúp hoàn thành thủ tục để bảo vệ Luận án cấp Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng CNSH Enzyme, tạo điều kiện thời gian, chia sẻ chuyên môn giúp đỡ tận tình suốt trình thực Luận án Tôi xin cảm ơn Phòng quản lý tổng hợp, Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, cán sở đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi sở vật chất, máy móc giúp đỡ hoàn thành thủ tục cần thiết trình làm nghiên cứu Cuối xin cảm ơn người thân gia đình bạn bè giúp đỡ, tạo điều kiện động viên suốt thời gian học tập Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017 Tác giả Nguyễn Thị Thảo i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây công trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác; Các số liệu kết trình bày luận văn án trung thực, phần công bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả; Phần lại chưa công bố công trình khác Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm 2017 Tác giả Nguyễn Thị Thảo ii CÁC TỪ VIẾT TẮT bp BOD BSA cfu COD CS DNA ep-RCA Gal Glc GHF GOS IPTG kb kDa M PCR oNP oNPG pNPG/pNP-gal pNP-fuc rpm SDS-PAGE SOC TIM TLC TE TBE TEMED v/v w/v WT Base pair (cặp bazơ) Biochemical oxygen demand (Nhu cầu oxy sinh hóa) Bovine serum albumin (Albumin huyết bò) Colony forming unit (Đơn vị xác định số lượng tế bào riêng rẽ vi khuẩn nấm) Chemical oxygen demand (Nhu cầu oxy hóa học) Cộng Deoxyribonucleic acid (Axit deoxyribonucleic) Error prone rolling circle amplification (Sao chép vòng tạo lỗi) Galactose (đường galactozơ) Glucose (đường glucozơ) Glycoside hydrolase family (Họ enzym thủy phân liên kết glycozit) Galactose-oligossacharide Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside Kilo base (Đơn vị đo kích thước phân tử ADN) Kilo Dalton (Đơn vị đo khối lượng phân tử protein) Marker (Thang chuẩn) Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Ortho-Nitrophenyl Ortho-Nitrophenyl--D-galactopyranoside para-Nitrophenyl--D-galactopyranoside para-Nitrophenyl--D-fucopyranoside Round per minute (Vòng/phút) Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Điện di gel polyacrylamit có bổ sung sodium dodecyl sulfate) Super optimal broth (Môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn) Triose-phosphate isomerase Thin-layer chromatography (Sắc ký mỏng) Tris EDTA Tris boric acid EDTA N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamine Volume/volume (Thể tích/thể tích) Weight/volume (Trọng lượng/thể tích) Wild type (Dạng ban đầu) iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i LỜI CAM ĐOAN ii CÁC TỪ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC BẢNG ix DANH MỤC PHỤ LỤC xi MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thông tin chung -galactosidase 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Nguồn gốc phân loại 1.1.3 Cấu trúc 1.1.4 Cơ chế phản ứng 15 1.2 Ứng dụng 18 1.2.1 Trong công nghiệp chế biến sữa 19 1.2.2 Trong xử lý whey 20 1.2.3 Trong y dược 23 1.2.4 Một số ứng dụng khác 24 1.3 Tình hình nghiên cứu β-galactosidase nước 25 1.3.1 Các hướng nghiên cứu giới 25 1.3.2 Các nghiên cứu nước 31 1.3.3 Hướng nghiên cứu đề tài 32 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu hóa chất 35 2.1.1 Vật liệu 35 2.1.2 Hóa chất dung dịch 36 2.1.3 Thiết bị thí nghiệm 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu 38 iv 2.2.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên gen lacA 38 2.2.2 Xây dựng thư viện dòng mang gen lacA đột biến 41 2.2.3 Tạo đột biến điểm đột biến điểm suy biến 42 2.2.4 Xây dựng phân tích cấu trúc enzyme 43 2.2.5 Sàng lọc hoạt tính -galactosidase từ dòng mang gen lacA đột biến 43 2.2.6 Tách DNA plasmid 44 2.2.7 Cắt plasmid enzyme giới hạn 45 2.2.8 Điện di agarose 45 2.2.9 Xác định trình tự DNA 45 2.2.10 Biểu tinh LacA tái tổ hợp 45 2.2.11 Điện di SDS-PAGE 46 2.2.12 Xác định hàm lượng protein 47 2.2.13 Xác định hoạt tính thủy phân -galactosidase 48 2.2.14 Xác định khả chuyển hóa glycoside -galactosidase 49 2.2.15 Đặc điểm LacA tự nhiên đột biến 50 2.2.16 Xử lý số liệu 52 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53 3.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên 54 3.1.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên gen lacA 54 3.1.2 Tạo thư viện dòng mang gen lacA đột biến sàng lọc hoạt tính 57 3.1.3 Phân tích trình tự dòng đột biến 59 3.1.4 Xác định điểm đột biến làm thay đổi hoạt tính LacA 60 3.2 Tạo đột biến điểm suy biến 66 3.2.1 Xác định vùng liên kết chất LacA 67 3.2.2 Tạo thư viện đột biến điểm suy biến 68 3.2.3 Sàng lọc hoạt tính chọn dòng 69 3.2.4 Phân tích trình tự dòng đột biến 69 3.2.5 Tinh xác định hoạt tính riêng LacA đột biến điểm suy biến 72 3.3 Đánh giá tính chất lý hóa LacA đột biến 77 3.3.1 Nhiệt độ hoạt động tối ưu 78 3.3.2 pH hoạt động tối ưu 79 3.3.3 Ảnh hưởng pH đến độ bền LacA tự nhiên đột biến 80 v 3.3.4 Ảnh hưởng nhiệt độ đến độ bền LacA tự nhiên đột biến 81 3.3.5 Động học LacA tự nhiên đột biến 85 3.3.6 Ảnh hưởng đột biến đến khả tạo oligosaccharide 86 3.4 Phân tích ảnh hưởng đột biến đến cấu trúc LacA 88 3.4.1 Ảnh hưởng vị trí Ala301 đến cấu trúc LacA 88 3.4.2 Ảnh hưởng vị trí Phe361 đến cấu trúc LacA 91 3.4.3 Ảnh hưởng vị trí Leu373 đến cấu trúc LacA 93 CHƯƠNG THẢO LUẬN 97 4.1 Tạo đột biến ngẫu nhiên gen lacA 97 4.2 Đánh giá ảnh hưởng vị trí đột biến tìm LacA 98 4.2.1 Ảnh hưởng axit amin Ala301 99 4.2.2 Ảnh hưởng axit amin dự đoán liên kết với chất 103 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 112 CÁC CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 113 THESIS ABSTRACT 114 TÀI LỆU THAM KHẢO 121 PHỤ LỤC vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 10 Cấu trúc -galactosidase E coli thuộc họ GHF-2 Hình 1.2 10 Cấu trúc -galactosidase từ K lactis Hình 1.3 11 So sánh cấu trúc -galactosidase từ người với số vi sinh vật khác Hình 1.4 12 Cấu trúc -galactosidase từ B circulans ATCC 31382 Hình 1.5 Cấu trúc không gian chiều vùng trung tâm hoạt động LacA 14 Hình 1.6 16 Động học phản ứng thủy phân lactose -galactosidase Hình 1.7 Động học phản ứng thủy phân lactose -galactosidase với hai axit glutamic 17 trung tâm hoạt động Hình 1.8 Sự tổng hợp oligosaccharide .22 Hình 1.9 Sơ đồ so sánh phương pháp error prone-RCA với phương pháp đột biến ngẫu nhiên khác 33 Hình 2.1 Cơ chế tạo đột biến ngẫu nhiên chép lỗi vòng DNA 40 Hình 2.2 Các bước trình tạo đột biến định hướng 42 Hình 2.3 Đường chuẩn hàm lượng albumin huyết bò theo Bradford 48 Hình 2.4 49 Sự thủy phân oNPG -galactosidase Hình 2.5 Đồ thị Lineawever-Burk 51 Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm plasmid pELacA sau phản ứng ep-RCA 55 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid pELacA từ dòng thư viện đột biến ngẫu nhiên BamHI NotI 57 Hình 3.3 Điện di đồ sản phẩm PCR khuôn pELacA với cặp mồi đột biến 60 Hình 3.4A Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Glu62 LacA 61 Hình 3.4B Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Arg77 LacA 61 Hình 3.4C Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Ala191 LacA 62 Hình 3.4D 62 Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin A301 LacA Hình 3.4E Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Phe361 LacA 62 Hình 3.4F Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Ala429 LacA 63 Hình 3.4G Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Ala524 LacA 63 Hình 3.5 SDS-PAGE protein tổng số dòng đột biến điểm biểu LacA 64 Hình 3.6 SDS-PAGE LacA tinh từ dòng đột biến điểm 64 Hình 3.7 Kết dự đoán vị trí axit amin tương tác với chất theo chương trình 67 SWISS-MODEL Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại khuôn pElacA với cặp mồi đột biến 68 vii Hình 3.9 Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Ala301 LacA-WT LacA đột biến 70 Hình 3.10 Trình tự ba nucleotide vị trí mã hóa cho axit amin Leu373 LacA-WT 72 LacA đột biến Hình 3.11 SDS-PAGE protein tổng số số dòng đột biến điểm biểu LacA 73 Hình 3.12 SDS-PAGE LacA tinh từ số dòng đột biến điểm 74 Hình 3.13 Nhiệt độ hoạt động tối ưu LacA-WT LacA đột biến 78 Hình 3.14 pH hoạt động tối ưu LacA-WT LacA đột biến 79 Hình 3.15 Ảnh hưởng pH đến độ bền LacA-WT LacA đột biến pH 81 Hình 3.16 82 Độ bền LacA-WT LacA đột biến 45 50C Hình 3.17 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính LacA đột biến 85 Hình 3.18A Sắc ký mỏng sản phẩm chuyển hóa LacA-WT LacA đột biến vị trí 301 87 Hình 3.18B Sắc ký mỏng sản phẩm chuyển hóa LacA-WT LacA đột biến 88 vị trí Phe361 Leu373 Hình 3.19 Một phần cấu trúc bậc hai LacA-WT LacA đột biến vị trí Ala301 89 Hình 3.20 Mối tương tác với chất vùng xúc tác LacA-WT đột biến 90 Ala301 Hình 3.21 Một phần cấu trúc bậc hai LacA-WT LacA đột biến Phe361Tyr 91 Hình 3.22 Kết phân tích cấu trúc 3D LacA-WT LacA-361Tyr 92 Hình 3.23 Kết phân tích mối tương tác với chất vùng trung tâm LacA-WT LacA-361Tyr 92 Hình 3.24 Một phần cấu trúc bậc hai LacA-WT LacA đột biến Leu373 94 Hình 3.25 Kết phân tích mối tương tác với chất vùng trung tâm LacA-WT LacA đột biến Leu373 95 Hình 4.1 Sự phân bố đột biến nucleotide gen lacA 97 Hình 4.2 100 Trình tự phần -galactosidase thuộc họ 42 từ loài khác viii Phụ lục 14 Độ bền pH LacA đột biến Leu373Met Thời pH gian (giờ) Hoạt tính LacA-373Met (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính lại (%) 1,84 1,81 1,87 100 0,88 0,89 0,95 12 0,78 0,81 24 0,44 48 pH Hoạt tính LacA-373Met (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính lại (%) 1,85 1,87 1,90 100 49,6  2,1 1,78 1,75 1,72 95,8  1,7 0,80 42,3  0,9 1,81 1,78 1,75 94,9  1,7 0,51 0,56 26,0  3,1 1,82 1,79 1,76 92,4  1,7 0,39 0,42 0,41 22,9  0,8 1,69 1,61 1,69 93,7  2,4 72 0,37 0,36 0,42 21,6  2,0 1,59 1,64 1,51 89,0  3,5 1,83 1,77 1,80 100 1,77 1,83 1,87 100 1,68 1,61 1,64 90,2  2,0 1,69 1,73 1,71 93,8 1,1 12 1,71 1,67 1,64 89,2  1,9 1,78 1,78 1,71 93,7  2,3 24 1,79 1,75 1,71 90,4  1,9 1,76 1,79 1,75 91,2  1,2 48 1,64 1,53 1,58 89,4  3,0 1,65 1,56 1,59 90,2  2,8 72 1,55 1,51 1,53 86,1  1,2 1,47 1,52 1,54 85,0  1,9 1,93 1,81 1,80 100 1,88 1,85 1,91 100 1,75 1,71 1,68 93,8  2,0 1,67 1,64 1,69 91,1  1,5 12 1,78 1,74 1,72 93,0  1,7 1,72 1,61 1,71 89,5  3,3 24 1,81 1,77 1,75 91,5  1,6 1,68 1,70 1,78 88,7  2,7 48 1,65 1,55 1,58 89,8  2,8 1,65 1,56 1,56 89,5  3,1 72 1,52 1,55 1,51 86,0  1,0 1,45 1,53 1,54 84,8  2,7 11 Phụ lục 15 Độ bền nhiệt LacA-WT LacA đột biến 30 40C Mẫu 30C Thời gian Lần Lần (giờ) Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) WT 2,67 2,64 2,75 100 2,67 2,64 2,75 100 2,57 2,52 2,63 96,1  2,1 2,57 2,55 2,68 96,9  2,6 12 2,47 2,44 2,59 93,3  3,1 2,42 2,47 2,51 92,2  1,6 24 2,50 2,43 2,39 94,6  2,3 2,34 2,30 2,20 88,4  2,9 48 2,46 2,61 2,44 92,2  3,4 2,34 2,27 2,23 83,9  2,1 72 2,37 2,27 2,53 90,1  5,0 2,19 2,14 2,08 80,5  2,1 0,87 0,88 0,90 100 0,87 0,88 0,90 100 0,87 0,84 0,85 95,1  2,1 0,82 0,86 0,87 95,0  3,2 12 0,84 0,82 0,84 96,0  1,1 0,80 0,82 0,83 94,0  1,8 24 0,77 0,80 0,83 94,7  3,6 0,79 0,78 0,81 93,3  2,0 48 0,85 0,81 0,82 94,1  2,4 0,79 0,77 0,80 89,5  1,7 72 0,75 0,71 0,73 92,9  2,5 0,68 0,65 0,67 84,8  2,1 1,57 1,63 1,50 100 1,57 1,63 1,50 100 16 1,24 1,28 1,36 92,7  4,2 1,31 1,37 1,26 93,9  4,1 12 1,51 1,38 1,46 91,1  4,0 1,52 1,42 1,49 92,7  3,2 24 1,41 1,46 1,37 91,6  2,9 1,33 1,40 1,27 86,4  4,1 48 1,54 1,37 1,42 87,1  5,1 1,42 1,32 1,38 83,0  3,1 72 1,31 1,36 1,23 88,2  4,3 1,24 1,13 1,17 80,2  4,0 1,57 1,53 1,46 100 1,57 1,53 1,46 100 1,43 1,38 1,40 92,6  1,8 1,42 1,36 1,46 93,5  3,4 12 1,50 1,39 1,44 93,3  3,5 1,45 1,49 1,38 93,1  3,3 24 1,45 1,42 1,47 90,8  1,5 1,37 1,30 1,38 84,8  3,0 48 1,41 1,26 1,43 90,7  6,3 1,32 1,22 1,27 84,3  3,4 72 1,39 1,30 1,37 86,0  3,0 1,30 1,32 1,23 81,7  2,9 1,34 1,41 1,36 100 1,34 1,41 1,36 100 1,27 1,28 1,35 96,3  3,1 1,24 1,31 1,27 94,4  2,4 Ala301 Val Ala301 Glu Ala301 Tyr Fhe361 Tyr 40C 12 12 1,30 1,39 1,35 93,4  3,3 1,30 1,35 1,38 93,1  3,1 24 1,26 1,29 1,32 94,0  1,9 1,25 1,26 1,32 93,2  2,8 48 1,24 1,32 1,24 93,6  3,5 1,24 1,18 1,20 89,0  2,3 72 1,24 1,26 1,32 93,5  3,2 1,19 1,18 1,13 85,5  2,2 0,98 0,96 0,95 100 0,98 0,96 0,95 100 0,92 0,91 0,94 94,3  1,4 0,95 0,92 0,91 94,9  2,1 12 0,89 0,91 0,87 94,9  1,7 0,90 0,88 0,86 93,9  1,9 24 0,90 0,88 0,92 93,1  2,3 0,89 0,90 0,86 91,5  2,1 48 0,86 0,79 0,83 90,2  3,4 0,80 0,76 0,75 84,1  3,2 72 0,83 0,80 0,85 89,3  2,9 0,75 0,72 0,79 81,4  3,9 1,85 1,87 1,90 100 1,85 1,87 1,90 100 1,78 1,75 1,72 95,8  1,7 1,79 1,77 1,74 96,8  1,5 12 1,81 1,78 1,75 94,9  1,7 1,79 1,70 1,75 93,0  2,3 24 1,82 1,79 1,76 92,4  1,7 1,75 1,71 1,61 87,3  3,6 48 72 1,69 1,61 1,69 93,7  2,4 1,55 1,46 1,48 84,5  2,7 1,59 1,64 1,51 89,0  3,5 1,38 1,41 1,46 79,9  2,1 Leu373 Cys Leu373 Met 13 Phụ lục 16 Độ bền nhiệt LacA-WT nồng độ chất khác Nồng độ chất (%) Thời gian (giờ) 0 45C 50C Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) 2,65 2,55 2,59 2,596  0,05 2,55 2,53 2,47 2,52  0,04 2,16 2,17 2,13 2,16  0,02 1,73 1,65 1,64 1,68  0,05 1,01 1,00 1,03 1,01  0,02 2,78 2,85 3,16 2,93  0,20 2,37 2,40 2,39 2,39  0,01 1,95 1,90 1,92 1,92  0,03 1,52 1,53 1,54 1,53  0,01 2,65 2,40 2,59 2,55  0,13 2,16 2,17 2,13 2,156  0,02 1,73 1,65 1,64 1,676  0,05 1,01 1,00 1,03 1,010  0,02 1,89 1,96 2,27 2,04  0,21 1,52 1,48 1,50 1,50  0,01 0,93 0,96 0,94 0,94  0,03 0,49 0,51 0,52 0,51  0,01 1,80 1,86 1,87 1,844  0,04 10 15 0,7 0,64 0,71 0,683  0,04 2,74 2,81 2,86 2,80  0,06 2,27 2,25 2,24 2,253  0,02 24 48 1,82 1,74 1,82 1,793  0,05 0,91 0,91 0,89 0,904  0,01 2,32 2,56 2,86 2,58  0,27 1,85 1,82 1,74 1,80  0,06 24 48 0,83 1,01 0,93 0,92  0,09 0,35 0,31 0,32 0,33  0,02 1,89 1,96 2,27 2,041  0,20 1,41 1,52 1,48 1,470  0,06 24 48 0,68 0,65 0,56 0,634  0,06 0,12 0,15 0,14 0,136  0,01 14 Phụ lục 17 Độ bền nhiệt LacA-301Glu nồng độ chất khác Nồng độ chất (%) Thời gian (giờ) 0 45C 50C Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) 1,05 0,99 0,97 1,00  0,04 0,96 1,05 1,01 1,01  0,05 0,35 0,33 0,34 0,17  0,01 10 15 0,73 0,80 0,79 0,78  0,04 0,10 0,09 0,09 0,05  0,00 0,44 0,51 0,43 0,46  0,05 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 12 0,20 0,21 0,19 0,20  0,01 18 0,08 0,09 0,10 0,09  0,01 1,05 0,99 1,08 1,04  0,05 1,24 1,26 1,22 1,24  0,02 0,51 0,49 0,50 0,50  0,01 0,14 0,12 0,13 0,13  0,01 1,24 1,26 1,22 1,24  0,02 0,48 0,49 0,47 0,48  0,01 0,11 0,12 0,11 0,11  0,00 1,24 1,26 1,22 1,24  0,02 0,41 0,42 0,44 0,42  0,01 0,08 0,08 0,07 0,08  0,00 0,63 0,67 0,62 0,64  0,02 24 0,12 0,10 0,12 0,11  0,01 48 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 1,00 1,03 1,00 1,01  0,02 0,54 0,58 0,53 0,55  0,02 24 0,09 0,08 0,10 0,09  0,01 48 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 0,91 1,12 1,09 1,04  0,11 0,63 0,67 0,53 0,61  0,07 24 0,08 0,07 0,08 0,08  0,00 48 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 15 Phụ lục 18 Độ bền nhiệt LacA-301Val nồng độ chất khác Nồng độ chất (%) Thời gian (giờ) 0 45C 50C Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) 0,53 0,51 0,44 0,49  0,05 0,50 0,50 0,53 0,51  0,01 0,16 0,15 0,15 0,15  0,01 0,44 0,45 0,45 0,44  0,01 0,04 0,05 0,03 0,04  0,01 0,29 0,31 0,30 0,30  0,01 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 12 0,19 0,19 0,20 0,19  0,00 18 0,09 0,08 0,08 0,08  0,00 0,64 0,71 0,60 0,65  0,06 0,31 0,30 0,36 0,32  0,03 0,15 0,13 0,15 0,14  0,01 0,03 0,02 0,03 0,02  0,00 0,56 0,63 0,67 0,62  0,06 0,22 0,28 0,25 0,25  0,03 0,11 0,13 0,10 0,11  0,01 0,02 0,02 0,02 0,02  0,00 0,67 0,69 0,49 0,62  0,11 0,22 0,19 0,21 0,21  0,02 0,09 0,08 0,08 0,08  0,00 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 0,54 0,51 0,56 0,54  0,03 10 0,42 0,41 0,44 0,42  0,01 24 0,05 0,05 0,05 0,05  0,00 0,69 0,73 0,74 0,72  0,03 0,59 0,56 0,60 0,58  0,02 15 0,48 0,47 0,47 0,47  0,00 24 0,08 0,08 0,07 0,08  0,00 0,81 0,76 0,78 0,78  0,03 0,57 0,59 0,63 0,60  0,03 0,51 0,49 0,50 0,50  0,01 24 0,07 0,07 0,07 0,07  0,00 16 Phụ lục 19 Độ bền nhiệt LacA-301Tyr nồng độ chất khác Nồng độ chất (%) Thời gian (giờ) 0 45C 50C Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) 0,80 0,91 1,08 0,93  0,14 0,36 0,40 0,41 0,39  0,03 0,18 0,17 0,17 0,18  0,01 10 15 0,79 0,72 0,72 0,74  0,04 0,09 0,08 0,08 0,09  0,01 0,35 0,37 0,36 0,36  0,01 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 12 0,12 0,12 0,12 0,12  0,00 18 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 0,50 0,52 0,50 0,51  0,01 1,02 0,98 0,97 0,99  0,03 0,55 0,54 0,57 0,55  0,02 0,27 0,26 0,27 0,26  0,01 1,02 0,97 0,96 0,98  0,03 0,46 0,47 0,48 0,47  0,01 0,15 0,16 0,16 0,16  0,01 0,96 0,94 0,99 0,96  0,03 0,44 0,45 0,46 0,45  0,01 0,16 0,15 0,16 0,16  0,00 0,36 0,33 0,31 0,33  0,02 24 0,03 0,03 0,03 0,03  0,00 48 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,52 0,49 0,54 0,52  0,02 0,32 0,30 0,31 0,31  0,01 24 0,03 0,02 0,03 0,03  0,00 48 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,48 0,50 0,45 0,47  0,02 0,31 0,30 0,31 0,31  0,01 24 0,02 0,02 0,02 0,02  0,00 48 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 17 Phụ lục 20 Độ bền nhiệt LacA đột biến Phe361Tyr nồng độ chất khác Nồng độ chất (%) Thời gian (giờ) 0 10 45C 50C Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) 0,98 1,11 1,16 1,09  0,09 1,05 0,99 1,12 1,05  0,06 0,93 0,93 0,92 0,93  0,01 0,76 0,80 0,81 0,79  0,03 0,94 1,00 1,01 0,99  0,05 0,62 0,60 0,59 0,60  0,02 12 1,06 1,10 1,04 1,07  0,03 0,28 0,30 0,29 0,29  0,01 24 1,13 1,09 1,19 1,12  0,02 48 1,01 1,01 0,96 0,99  0,03 72 0,63 0,64 0,65 0,64  0,01 96 0,28 0,29 0,30 0,29  0,01 120 0,05 0,07 0,05 0,06  0,01 2,11 192 2,21 2,08  0,15 1,45 1,52 1,38 1,45  0,07 1,27 1,29 1,28 1,28  0,01 1,15 1,19 1,20 1,18  0,03 0,71 0,68 0,70 0,70  0,01 1,39 1,56 1,36 1,44  0,11 1,29 1,28 1,23 1,27  0,03 1,24 1,23 1,16 1,21  0,04 0,76 0,77 0,75 0,76  0,01 2,08 2,10 2,28 2,15  0,11 24 1,97 1,86 1,89 1,91  0,06 48 1,90 2,00 1,92 1,94  0,06 72 1,48 1,46 1,57 1,50  0,06 96 1,04 0,97 1,01 1,00  0,03 120 0,75 0,80 0,78 0,78  0,03 1,99 1,91 2,01 1,97  0,06 1,95 2,00 2,05 2,00  0,05 24 1,91 1,95 1,88 1,91  0,03 48 1,56 1,69 1,66 1,64  0,07 72 1,12 1,28 1,17 1,19  0,08 18 15 96 0,81 0,88 0,74 0,81  0,07 120 0,48 0,52 0,54 0,52  0,03 1,88 1,95 1,90 1,91  0,03 1,52 1,46 1,37 1,45  0,08 1,29 1,32 1,32 1,31  0,02 1,20 1,20 1,18 1,19  0,01 0,71 0,72 0,70 0,71  0,01 1,87 1,81 1,84 1,84  0,03 24 1,88 1,86 1,90 1,88  0,02 48 1,59 1,68 1,69 1,65  0,06 72 1,07 1,18 1,12 1,12  0,06 96 0,80 0,75 0,83 0,79  0,04 120 0,52 0,57 0,54 0,55  0,02 19 Phụ lục 21 Độ bền nhiệt LacA đột biến Leu373Cys nồng độ chất khác Nồng độ chất (%) Thời gian (giờ) 0 45C 50C Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) 0,90 1,01 0,93 0,94  0,06 0,8 0,75 0,88 0,81  0,07 0,58 0,63 0,60 0,60  0,02 10 15 0,82 0,81 0,80 0,81  0,01 0,26 0,23 0,24 0,24  0,01 0,63 0,63 0,65 0,64  0,01 0,05 0,05 0,06 0,05  0,00 12 0,39 0,36 0,37 0,37  0,01 18 0,18 0,17 0,19 0,18  0,01 0,83 0,72 0,76 0,77  0,05 0,83 0,72 0,76 0,77  0,05 0,60 0,62 0,59 0,60  0,01 0,38 0,36 0,39 0,37  0,01 0,21 0,23 0,20 0,21  0,01 0,72 0,81 0,74 0,76  0,05 0,56 0,55 0,60 0,57  0,03 0,32 0,32 0,36 0,33  0,02 0,12 0,11 0,12 0,11  0,01 0,76 0,85 0,92 0,84  0,08 0,52 0,50 0,54 0,52  0,02 0,26 0,24 0,27 0,25  0,02 0,05 0,05 0,05 0,05  0,00 0,72 0,73 0,73 0,73  0,01 24 0,40 0,39 0,42 0,40  0,02 48 0,21 0,21 0,20 0,21  0,01 0,72 0,81 0,74 0,76  0,05 0,67 0,69 0,69 0,68  0,01 24 0,32 0,31 0,33 0,32  0,01 48 0,08 0,08 0,09 0,08  0,00 0,76 0,85 0,92 0,84  0,08 0,64 0,64 0,66 0,65  0,01 24 0,20 0,24 0,22 0,22  0,02 48 0,03 0,03 0,03 0,03  0,00 20 Phụ lục 22 Độ bền nhiệt LacA đột biến Leu373Met nồng độ chất khác Nồng độ chất (%) Thời gian (giờ) 0 45C 50C Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) 1,7 1,92 1,82 1,81  0,11 1,72 1,88 1,68 1,76  0,10 0,60 0,55 0,63 0,59  0,04 10 15 1,50 1,50 1,51 1,50  0,01 0,30 0,21 0,22 0,25  0,05 0,89 0,85 0,86 0,87  0,02 0,00 0,00 0,00 0,00  0,00 12 0,23 0,25 0,24 0,24  0,01 18 0,08 0,07 0,05 0,07  0,01 1,89 1,96 1,83 1,89  0,07 1,89 1,96 1,83 1,89  0,07 1,67 1,64 1,64 1,65  0,02 1,42 1,47 1,54 1,48  0,06 0,65 0,63 0,64 0,64  0,01 1,76 1,92 1,83 1,83  0,08 1,63 1,60 1,59 1,60  0,02 1,36 1,38 1,45 1,40  0,05 0,56 0,56 0,57 0,56  0,01 1,58 1,65 1,70 1,64  0,06 1,41 1,37 1,38 1,39  0,02 1,13 1,07 1,05 1,09  0,04 0,36 0,38 0,40 0,38  0,02 1,74 1,77 1,81 1,77  0,04 24 1,51 1,43 1,53 1,49  0,06 48 0,79 0,81 0,84 0,81  0,02 1,76 1,92 1,83 1,83  0,08 1,69 1,68 1,63 1,67  0,03 24 1,20 1,20 1,22 1,21  0,01 48 0,70 0,68 0,66 0,68  0,02 1,58 1,65 1,70 1,64  0,06 1,29 1,33 1,22 1,28  0,05 24 0,84 0,79 0,73 0,79  0,05 48 0,39 0,43 0,40 0,41  0,02 21 Phụ lục 23 Ảnh hưởng nồng độ chất đến hoạt tính LacA-WT biến thể Dòng đột biến Nồng độ oNPG (mg/ml) Hoạt tính (IU/mg) Lần Lần Lần Hoạt tính trung bình (IU/mg) WT 0,5 0,398 0,402 0,418 0,406  0,011 0,627 0,631 0,638 0,632  0,006 1,073 1,040 1,064 1,059  0,017 1,336 1,273 1,329 1,313  0,034 1,696 1,676 1,671 1,681  0,013 1,867 1,842 1,833 1,847  0,017 0,5 0,160 0,158 0,160 0,159  0,001 0,302 0,291 0,276 0,290  0,013 0,416 0,396 0,404 0,405  0,010 0,489 0,502 0,471 0,487  0,016 0,567 0,573 0,598 0,579  0,016 0,604 0,624 0,640 0,623  0,018 0,5 0,158 0,188 0,188 0,178  0,017 0,241 0,286 0,277 0,268  0,024 0,375 0,404 0,424 0,401  0,024 0,459 0,492 0,504 0,485  0,023 0,498 0,596 0,567 0,554  0,050 0,588 0,624 0,625 0,612  0,021 0,5 0,197 0,173 0,182 0,184  0,012 0,308 0,287 0,311 0,302  0,013 0,475 0,456 0,467 0,466  0,010 0,611 0,511 0,538 0,553  0,052 0,739 0,604 0,642 0,662  0,069 0,814 0,709 0,713 0,745  0,059 0,5 0,224 0,218 0,227 0,223  0,005 0,309 0,307 0,307 0,307  0,001 0,440 0,433 0,422 0,432  0,009 Ala301Glu Ala301Val Ala301Tyr Phe361Tyr 22 Leu373Cys Leu373Met 0,553 0,556 0,538 0,549  0,010 0,647 0,649 0,642 0,646  0,003 0,778 0,776 0,758 0,770  0,011 0,5 0,150 0,167 0,160 0,159  0,008 0,237 0,244 0,260 0,247  0,012 0,410 0,395 0,402 0,402  0,007 0,506 0,501 0,511 0,506  0,005 0,613 0,627 0,595 0,611  0,016 0,637 0,584 0,594 0,605  0,028 0,5 0,309 0,292 0,306 0,302  0,009 0,485 0,498 0,479 0,487  0,010 0,755 0,728 0,741 0,741  0,014 0,932 0,987 0,941 0,953  0,029 1,074 1,066 1,096 1,078  0,015 1,174 1,076 1,094 1,114  0,052 23 Bacillus subtilis strain G1 beta-galactosidase gene, complete cds GenBank: EU585783.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS APR-2008 DEFINITION cds ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM EU585783 2064 bp DNA linear BCT 12 Bacillus subtilis strain G1 beta-galactosidase gene, complete EU585783 EU585783.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus REFERENCE (bases to 2064) AUTHORS Quyen,D.T., Tran,V.G., Nguyen,S.L.T and Dinh,D.K TITLE Gene cloning, sequencing, expression and characterization of a galactosidase gene from Bacillus subtilis strain G1 JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 2064) AUTHORS Quyen,D.T., Tran,V.G., Nguyen,S.L.T and Dinh,D.K TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (21-MAR-2008) Enzyme Biotech, Institute of Biotechnology,Vietnamese Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet Road, Distr Caugiay, Hanoi 10600, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 2064 /organism="Bacillus subtilis" /mol_type="genomic DNA" /strain="G1" /db_xref="taxon:1423" CDS 2064 /codon_start=1 /transl_table=11 /product="beta-galactosidase" /protein_id="ACB72733.1" /translation="MMSKLEKTHVTKAKFMLHGGDYNPDQWLDRPDILADDIKLMKLS HTNTFSVGIFAWSALEPEEGVYQFEWLDDIFERIHSIGGRVILATPSGARPAWLSQTY PEVLRVNASRVKQLHGGRRNHCLTSKVYREKTRHINRLLAERYGNHPGLLMWHISNEY GGDCHCDLCQHAFREWLKSKYDNSLKALNQAWWTPFWSHTFNDWSQIESPSPIGENGL HGLNLDWRRFVTDQTISFYKNEIIPLKELTPDIPITTNFMADTPDLIPYQGLDYSKFA KHVDVISWDAYPVWHNDWESTADLAMKVGFINDLYRSLKQQSFLLMECTPSAVNWHNV NKAKRPGMNLLSSMQMIAHGSDSVLYFQYRKSRGSSEKLHGAVVDHDNSPKNRVFQEV AKVGETLERLSEVVGTKRPAQTAILYDWENHWAFGDAQGFAKATKRYPQTLQQHYRTF WEHDIPVDVITKEQDFSPYKLLIVPMLYLISEDTISRLKAFTADGGTLVMTYISGVVN EHDLTYTGGWHPDLQAIFGVEPLETDTLYPKDRNAVSYRSQIYEMKDYATVIDVKTAP VEAVYQEDFYARTPAVTSHQYQQGKAYFIGARLEDQFHRDFYEGLITDLSLSPVFPVR HGKGVSVQARQDQDNDYIFVMNFTEEKQLVTFDQSVKDIMTGDILSGDLTMEKYEVRI VVNTH" ORIGIN 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 gtgatgtcaa gactacaacc atgaagcttt ccggaggagg ataggcggcc acctatccgg cgcaaccact ttagcagaac gggggagatt tatgacaaca ttcaatgact ctgaatttag atcattccgc acaccggatt gtcatcagct gcgatgaagg ttaatggagt ggcatgaatc ttccaatacc gacaatagcc cggctgtccg gaaaatcatt caaacgcttc acgaaagaac agcgaggaca acgtatatca gaccttcaag cgaaacgctg gatgtaaaga gctgtcacaa gatcaatttc tttccggttc tatatttttg aaggacataa agaattgtcg agcttgaaaa ccgatcagtg ctcatacgaa gcgtatatca gggtcatatt aagttttgcg gcctcacatc gatacggaaa gccactgtga gcctcaaggc ggtcacaaat attggcgccg tgaaagaatt tgatcccgta gggacgctta tcggttttat gtacgccaag tgctgtcatc gcaaatcacg caaagaaccg aagttgtcgg gggcgttcgg agcagcatta aagacttttc ccatttcccg gcggggttgt ctatatttgg tcagctaccg ctgctccagt gccatcaata accgtgattt ggcatggaaa tgatgaactt tgacaggaga taaacacaca aacgcacgta gctggatcgg tacgttttct atttgaatgg agcaacgccg cgtcaatgcc taaagtctac tcacccgggg tctatgccag attgaaccag tgaaagccct gttcgtcacc gacgcctgat tcagggcctc tcctgtctgg caacgatctg cgcggtcaat catgcaaatg ggggtcatca cgtctttcaa aacgaagagg ggatgctcag ccgcacattc accatataaa tttaaaagcg gaatgagcat agttgagcct cagccaaata ggaagcggtg tcagcagggc ctatgagggt aggcgtctcc tacggaagaa catattgtca ttaa acaaaagcga cccgatattt gtcggtattt ctggatgata agcggagccc tcccgcgtca cgagaaaaga ctgttaatgt catgcttttc gcgtggtgga tcgccgatcg gatcaaacga atccctatca gactacagca cacaatgact taccgaagct tggcataacg attgcccacg gaaaaattac gaagtggcca ccggctcaaa gggtttgcga tgggaacacg ctgctgatcg tttacggctg gacttaacat cttgaaacgg tacgaaatga tatcaagagg aaggcgtatt ctgatcacag gtacaagcga aaacagctgg ggcgacctga aatttatgct tagctgacga ttgcatggag tttttgagcg gtccggcctg aacagctgca cacggcacat ggcacatttc gggagtggct cccctttttg gtgaaaatgg tttcgtttta caacgaattt aatttgcaaa gggaaagcac tgaagcagca tcaacaaggc gctcggacag acggagcggt aggtaggcga ccgcgatttt aggcgacaaa atatccctgt tcccgatgct acggcggcac acacaggcgg acaccctgta aggattatgc atttttacgc ttatcggcgc acctgtctct ggcaggatca tcacgtttga cgatggaaaa ccatggggga tatcaaactg cgcacttgag gattcacagt gctgtcgcaa cggcggaagg caaccgctta aaacgaatac gaaatcgaaa gagccatacg cttgcatggc taaaaatgaa tatggctgac gcatgtcgat agctgatttg gtctttctta aaagcgcccg cgtactctat tgtggatcat gacattggaa atatgactgg acgttatccg cgacgtcatt gtatttaatc cttagtcatg atggcatccg tccgaaggat aaccgtgatt ccgtacgcca gcgtttggag ttcacctgtt ggacaatgat ccagagtgtg gtatgaagtg ... amin tính chất β- galactosidase từ Bacillus subtilis VTCC- DVN- 12- 01 phân lập Việt Nam kỹ thuật ep- RCA đột biến điểm định hướng Mục đích nghiên cứu - Xác định vai trò số axit amin quan trọng  -galactosidase. .. VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Thảo NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA MỘT SỐ GỐC AXIT AMIN ĐỐI VỚI TÍNH CHẤT CỦA  -GALACTOSIDASE TỪ Bacillus subtilis VTCC- DVN1 2 -01 PHÂN LẬP Ở VIỆT... từ B subtilis VTCC- DVN- 12- 01 - Tìm LacA đột biến có tính chất so với enzyme ban đầu Nội dung nghiên cứu - Tạo đột biến ngẫu nhiên gen (lacA) mã hóa  -galactosidase từ B subtilis VTCC DVN- 12- 01