Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc thuộc lĩnh vực đề tà i

Burchell J và cộng sự (1999) đã nghiên cứu gene ST3Gal-I trên tế bào ung thư vú MDA-Ba-231 và đưa ra kết quả rằng ST3Gal-I chịu trách nhiệm gắn thêm acid sialic vào nhánh lõi galactose 1(GalB1,3 Gal NAc) O- glycan, do đó làm tăng khả năng di căn của TBUT (Burchell J et al., 1999). Schneider F và cộng sự (2001) đưa ra mối quan hệ giữa biểu hiện của TF trên bề mặt tế bào của SW480 (tế bào ung thư đại tràng) phụ thuộc vào tỷ lệ của ST3Gal-I. Phản ứng RT-PCR cho thấy biểu hiện của acid sialic sialyltransferases CMP phát hiện trong niêm mạc bình thường là 7% và trong các mẫu ung thư biểu mô tăng lên rõ ràng 57%. Biểu hiện hoạt động của alpha 2,3-sialyltransferases ST3Gal-I và mRNA của enzyme này được tăng lên đáng kể (p < 0,05) (Schneider F et al., 2001).

Trong các nghiên cứu ở chuột bị knock-down gene ST3Gal-I, các tác giả nhận thấy rằng các chuột này gần như bị thiếu hẳn các tế bào lympho CD8β T ngoại vi. Đồng thời các tác giả cũng nhận thấy rằng enzyme này tăng cường hoạt động ở những bệnh nhân ung thư đang có khối u di căn nhưng chưa biết được cơ chế cụ thể (Moody AM et al, 2003). Việc sử dụng siRNA để knock-down COX-2 và phân tích sự biểu hiện của COX-2 trong tế bào ung thư vú MDA-MB-231 cho thấy rằng COX-2 đã làm giảm biểu hiện của ST3Gal-I và ở 74 bệnh nhân ung thư (Sproviero D et al., 2012).

Các nghiên cứu trên cho thấy, sự biểu hiện quá mức của ST3Gal-I dường như là một phần của chuyển đổi gây ung thư. Các nghiên cứu đều thực hiện trên các gene và các dòng tế bào ung thư khác nhau tuy nhiên

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

chưa có nghiên cứu nào thực hiện knock-down gene ST3Gal-I trên mô hình tế bào ung thư vú MCF7.

PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu, hoá chất và thiết bị nghiên cứu

3.1.1. Vật liệu

Dòng tế bào ung thư vú MCF7 do GS. JM Pezzuto, Trường Đại học Hawaii, Mỹ cung cấp.

Đĩa nuôi cấy tế bào (96 giếng) của Corning (Mỹ) và một số vật liệu tiêu hao khác.

3.1.2. Hoá chất

 Môi trường DMEM và các hóa chất cần thiết khác được mua từ các hãng Fisher, Fermentas, Sigma, Gibco, Roche v.v.

 Bộ Kit chuyển nhiễm Lipofectamin TM

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

 siRNA đặc hiệu gene ST3Gal-I

(INVITROGEN#NM_003033.3_stealth_1726).

 Bộ Kit xác định khả năng sống và phát triển của tế bào alamarBlue®

kit của INVITROGEN.

 Bộ kit tách chiết và tinh sạch RNA Rneasy Mini Kit của Qiagen.

 Bộ kit tổng hợp và tinh sạch cDNA từ các mẫu RNA High-capacity cDNA reverse transcription (Applied Biosystem).

 Bộ kit TagmanR

Gene Expression Asay (Applied Biosystem) cho phản ứng Real Time - PCR.

 Bộ Pierce BCA Protein Assay Kit của Thermo Scientific.

3.1.3. Thiết bị

 Kính hiển vi soi ngược chụp ảnh hệ thống Clsi Confocal Microscope System (NIKON).

 Hệ thống 7300 Real-Time PCR System (Applied Biosystem).

 Hệ thống NanoDrop 3300 (Thermo Scientific).

 Hệ thống TYPHOON 9400 của GE Healthcare.

 ác trang thiết bị khác sử dụng trong nuôi cấy tế bào in vitro và cho phản ứng Reverse transcription - cDNA.

 Hệ thống phân tích khối phổ 4700 Proteomics Analyzer của Applied Biosystems (ABI) của Trung tâm nghiên cứu Genome, Viện Khoa học SINICA, Đài Loan. Phần mềm sử dụng là Mascot Daemon 2.0.

3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.

Thời gian từ 01/01/2011 đến 30/09/2012 tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.

3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Tế bào ung thư vú MCF-7 được nuôi cấy in vitro theo thường qui của Ngân hàng tế bào Hoa Kỳ ATCC. Tế bào được nuôi trong môi trường DMEM với 10% FBS, 1% PSF, 10% Sodium pyruvat và Insulin (Gibco). Tế bào được cấy chuyển liên tục 3 ngày/1 lần và được nuôi trong tủ ấm 370C, 5%CO2 và độ ẩm 100%.

3.3.2. Phương pháp knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA nhờ lipofectamin lipofectamin

Tế bào MCF7 nuôi trong môi trường không kháng sinh trong đĩa nuôi cấy 100 mm với tỉ lệ 1.5 x 106

tế bào/giếng trong 24h trước khi chuyển nhiễm. Quá trình chuyển nhiễm siRNA đặc hiệu gene ST3Gal-I (INVITROGEN # NM_003033.3_stealth_1726) được thực hiện theo đúng hướng dẫn của bộ kit chuyển nhiễm LipofectaminTM

RNAiMAX (Invitrogen). Cụ thể là:

1. Đối với mỗi giếng chuyển nhiễm, chuẩn bị hỗn hợp gồm RNAi duplex – Lipofectamin RNAiMAX gồm:

- 1 ml DMEM (basic) với 10l RNAiMAX (ống 1) - 1 ml DMEM (basic) với 5l siRNA (ống 2)

2. Trộn ống 1 và ống 2 rồi voltex thật nhẹ nhàng. 3. Ủ hỗn hợp trên ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.

4. Tế bào MCF7 được cấy chuyển 24 giờ trước khi chuyển nhiễm, được thay môi trường bằng 10 ml môi trường DMEM đầy đủ (không kháng sinh).

5. Sau thời gian ủ, đưa hỗn hợp siRNA và RNAiMAX vào đĩa tế bào đã được thay môi trường và lắc nhẹ trong 1 phút.

6. Ủ tế bào và siRNA trong 48 giờ tiếp theo (từ 24-72 giờ) ở 37o

C, sau đó kiểm tra hình thái tế bào sau khi knock-down gene và thu hoạch tế bào cho các nghiên cứu tiếp theo.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

3.3.3. Phân tích và so sánh hình thái tế bào sau khi bị knock-down

Thực hiện Phân tích và so sánh hình thái tế bào sau khi bị knock- down bằng kính hiển vi soi ngược chụp ảnh hệ thống C1si Confocal Microscope System (NIKON).

3.3.4.Xác định khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển nhiễm

Sử dụng alamarBlue®

kit của Invitrogen để xác định khả năng sống sót của tế bào sau khi chuyển nhiễm. Theo đó 5000 tế bào được nuôi trong các đĩa 96 giếng và được xác định số tế bào sống sót ở các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Cụ thể như sau:

 Cho 100 l tế bào/giếng sau đó thêm vào 10 l alamarBlue® pha loãng 10X.

 Ủ tế bào trong vòng 1-3 ngày ở 37oC, đọc kết quả ở bước sóng 570 nm bằng hệ thống Tecan Genios tại các thời điểm sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ.

 Thêm 50 l SDS 3% vào giếng tế bào để dừng phản ứng.

3.3.5.Thu nhận RNA tổng số bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen

Khi nồng độ tế bào đạt 0.5x106

thì tiến hành thu hoạch và phá vỡ tế bào. Thu RNA tổng số của tế bào MCF7 sau khi knock-down bằng RNeasy Mini Kit của Qiagen theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

3.3.6. Kiểm tra hiệu quả knock-down gene bằng RT-PCR theo bộ kit của Applied Biosystem Applied Biosystem

Sau khi thu được RNA tổng số thì tiến hành kiểm tra hàm lượng RNA tổng số thu được của các mẫu nghiên cứu bằng hệ thống NanoDrop 3300 của Thermo Scientific. Tiếp đó, tiến hành tổng hợp cDNA từ các mẫu RNA thu được ở trên với bộ High-capacity cDNA reverse transcription kit (Applied Biosystem) theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất. Theo đó, lượng mẫu RNA tổng số cho phản ứng là 1 µg trong 10 µl master mix (10

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

X RT buffer; 2 X dNTP mix 10 mM; 10 X random primer; Multiscribe reverse transciptase và Nuclease free H2O).

Sau khi có sản phẩm cDNA, tiến hành phản ứng RT-PCR. Quá trình được tiến hành trên mẫu tế bào MCF7 có knock-down ST3Gal-I bằng siRNA, mẫu tế bào MCF7 đối chứng sử dụng scramble RNA. Gene đối chứng được sử dụng là Hprt1. Phản ứng RT-PCR được thực hiện bằng kit TagmanGene Expression Assay (Applied Biosystem) trên hệ thống Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System. Hỗn hợp phản ứng gồm:

- 1,25 µl primer

- 6,25 µl master mix (từ kit) - 0,5 µl cDNA

- 12 µl DEPC H2O

- Tm của mẫu MCF7-siST3GalI-ST3GalI là 68.60C; của mẫu MCF7- scrambleRNA-ST3GalI là 71.30C; của mẫu MCF7-siST3GalI-Hprt.1 là 760C; của mẫu MCF7-scrambleRNA-Hprt.1 là 71.60

C.

- Chu trình nhiệt của phản ứng như sau: 50°C - 2 phút; 95°C - 10 phút; 95°C - 15 giây; 60°C - 1 phút; 95°C - 15 giây; 60°C - 1 phút; 95°C - 15 giây; 60°C - 15 giây; 4°C- 24 giờ; Primer cho ST3GAL-I là: forward, 5’-GGACCCTGAAAGTGCTCA-3’; reverse, 5’- TCTCCAGCATAGGGTCCA-3’ và HPRT1 là forward, 5’- TGACACTGGCAAAACAATGCA-3’; reverse, 5’- GGTCCTTTTCACCAGCAAGCT-3’.

3.3.7. Thu nhận Glycoprotein trên màng tế bào MCF7

Việc thu nhận Glycoprotein trên màng tế bào MCF7 để phục vụ cho phân tích khối phổ, được thực hiện với các đệm EDTA (Ethylene-Diamine- Tetraacetic Acid) và RIPA (Radioimmunoprecipitation assay buffer) cụ thể như sau:

 Dùng EDTA để đánh rời tế bào (5 ml EDTA 7.5 mM có bổ sung 1% BSA, pH 8.0 và 2 ml PBS, pH 7.4) trong 10 phút ở 37oC.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

 Thu nhận dịch tế bào và ly tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút.

 Cặn tế bào được rửa bằng PBS hai lần và ly tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút.

 Hòa cặn tế bào trong đệm RIPA và bổ sung protease inhibitor cocktail (Roche # 04693132001) và ủ trong 30 phút ở -20oC.

 Giải đông hỗn dịch trong đá trong 15 phút.

 Sử dụng kim tiêm kích cỡ 19-21G cùng với bơm tiêm cỡ 1 ml hút dịch lên và xuống khoảng 10 lần.

 Li tâm hỗn dịch trong 20 phút ở 4oC với tốc độ 15000 vòng/phút.

 Thu nhận dịch nổi và loại cặn tế bào.

 Cất giữ ở -20oC để tiếp tục sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.

3.3.8. Phương pháp xác định hàm lượng Glycoprotein tổng số

Xác định hàm lượng Glycoprotein tổng số bằng bộ Pierce BCA Protein Assay Kit của Thermo Scientific. Hàm lượng glycoprotein tổng số thu được để chuẩn bị cho thí nghiệm in-geldigestion. Phương pháp được thực hiện cụ thể như sau:

 Chuẩn bị đường chuẩn BSA ở các nồng độ 1 mg; 0.5 mg; 0.25 mg; 0.125 mg và 0 mg (2 ml mỗi nồng độ, BSA pha trong nước cất).

 Chuẩn bị mẫu bằng cách pha loãng mẫu 2 lần, 4 lần, 8 lần và 10 lần.

 Chuẩn bị mẫu đối chứng là đệm RIPA cũng được pha loãng tương tự như với mẫu thí nghiệm (RIPA:H2O là 1:1).

 Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất kit.

 Đọc kết quả ở máy BIORAD với bước sóng 562 nm.

 Tính toán kết quả.

3.3.9. Phương pháp điện di trên gel

Sử dụng bộ NuPAGE® Novex® Bis-Tris Mini Gels của Invitrogen và thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

 Rút bỏ hệ thống lược rồi rửa qua trong dung dịch nước.

 Đưa hệ thống gel vào bể điện di đã chuẩn bị sẵn đệm NuPAGE®

MOPS SDS Running Buffer.

 Cho mẫu và Ladder (Fermentas # SM1811) 40 µl vào mỗi giếng.

 Chạy gel ở 120V, 60-80 mA, 90 phút.

3.3.10. Phƣơng pháp Western blot để xác định mức độ biểu hiện của các protein các protein

Sau khi có bản gel chúng tôi chạy Western-blot.

 Chuyển gel sang màng PVDF (polyvinylidene difluoride), PDVF được tiền xử lí bằng methanol trong một phút. Chạy ở 4 o

C, 100V, 60 phút.

 Phủ màng bằng TTBS (hỗn dịch của Tris-Buffered Saline và Tween 20) có bổ sung 3% BSA (Bovine Serume Albumin)ở nhiệt độ phòng trong 90 phút.

 Rửa màng 3 lần bằng TTBS, mỗi lần 10 phút.

 Ủ với kháng thể 1 (PNA-Biotin pha loãng 2500X hoặc p-Akt pha loãng 2000X hoặc β -actin pha loãng 2000 lần) ở 4oC qua đêm và lắc.

 Rửa màng 3 lần bằng TTBS, mỗi lần 10 phút.

 Tiếp theo màng được ủ với kháng thể 2 trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ phòng và lắc (SA-AP pha loãng 5000 lần hoặc Goat α Rabbit- Alkaline Phosphate pha loãng 10000 lần).

 Rửa màng 3 lần bằng TTBS, mối lần 10 phút.

 Cuối cùng màng được hiện màu bằng cơ chất ECF pha loãng 10 lần.

 Đọc kết quả bằng hệ thống TYPHOON 9400 của GE Healthcare.

3.3.11. Phương pháp nhuộm gel bằng siver staining

Tiến hành nhuộm gel bằng siver staining theo phương pháp của E.Mortz et al., 2001 như sau:

 Để bản gel trong 50% methanol, 12% HAc, 0,05% formalin trong 2 giờ hoặc qua đêm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

 Rửa gel bằng ethanol 30%, 20 phút và lắc ở nhiệt độ phòng, 3 lần.

 Đặt gel vào dung dịch Na2S2O3, lắc nhẹ bằng tay trong 2 phút. Đổ bỏ dung dịch.

 Rửa gel bằng nước sạch, lắc ở nhiệt độ phòng, 3 lần, mỗi lần 5 phút.

 Nhuộm gel trong dung dịch 0,2% AgNO3 + 0,076% formalin (45ml) trong 20-60 phút.

 Rửa gel bằng nước sạch và lắc, 2 lần, mỗi lần 1 phút.

 Tiếp tục để gel trong dung dịch 6% Na2CO3 + 0,05% formalin + 0,0004% Na2S2O3 trong một vài phút (cho đến khi sạch).

 Dừng phản ứng nhuộm trong 50% methanol, 12% HAc trong 5-10 phút. Đổ bỏ dung dịch, thêm nước sạch để nhiệt độ phòng để chụp ảnh hay làm in-gel digestion ngay hoặc bảo quản bản gel ở 4o

C trong dung dịch 1% HAc cho những thí nghiệm tiếp theo.

3.3.12. Phương pháp in-gel digestion

 Cắt những điểm quan tâm từ gel, cắt thành những mẩu nhỏ 1 mm2

, cho vào ống eppendof.

 Thêm 100µl (hoặc đủ để phủ hết bề mặt gel) 25 mM NH4HCO3 25mM/50% acetonitrile vào ống eppendorf, ủ 10 phút.

 Hút bỏ NH4HCO3.

 Lặp lại bước 2&3, 2 lần (hoặc cho đến khi mẩu gel không còn màu).

 Làm khô các mẩu gel trong hệ thống Speed Vac (20 phút) (có thể giữ ở -20oC cho thí nghiệm tiếp theo).

 Thêm dung dịch trypsin để phủ các mẩu gel (thể tích trypsin bằng 3 lần thể tích gel, nằm trong khoảng 5-25 µl).

 Rehydrate các mẩu gel trong đá hoặc ở 4oC trong 10 phút. Tiếp tục lắc và thêm một lượng 25mM NH4HCO3 đủ để phủ các mẩu gel.

 Lắc và ủ ở 37oC trong 4 giờ hoặc qua đêm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

 Thêm 30 µl (đủ để phủ) 50% acetonitrile/5% TFA (Trifloro acetic acid) vào ống chứa các mẩu gel, ủ 30 phút. Hút dung dịch này vào ống eppendof T1. Lặp lại bước này một vài lần.

 Làm giảm thể tích mẫu trong ống eppendof T1 xuống 10 µl trong hệ thống Speed Vac.

 Sử dụng 1 µl các mẫu dịch thôi gel để đi phân tích MALDI-TOF-MS hoặc bảo quản mẫu ở -80o

C.

3.3.13. Phương pháp phân tích khối phổ

Phân tích khối phổ được thực hiện trên hệ thống phân tích khối phổ 4700 Proteomics Analyzer của hãng Applied Biosystems (ABI) do Trung tâm nghiên cứu Geneome, Viện Khoa học SINICA, Đài Loan thực hiện. Phần mềm sử dụng là Mascot Daemon 2.0.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Hình thái tế bào MCF7 sau khi knock-down gene ST3Gal-I bằng siRNA siRNA

Tế bào MCF7 sau khi nuôi cấy thường qui được tiến hành chuyển nhiễm siRNA nhằm knock-down gene ST3Gal-I. Sau 3 ngày chuyển nhiễm, tế bào được quan sát sự biến đổi về hình thái dưới hệ thống kính hiển vi chụp ảnh. Hình ảnh tế bào thu được trong hình 4.1 cho thấy tế bào MCF7 bị chuyển nhiễm siRNA có một số biến đổi nhất định. Cụ thể là tế bào có xu hướng co cụm, tạo các khối tế bào và không dàn trải đều để tạo đơn lớp như các tế bào đối chứng. Kết quả này của chúng tôi cũng phù hợp so với các nghiên cứu trên tế bào ung thư vú di căn mạnh MDA-BA-231 (kết quả không trình bày ở đây). Điều này có thể giải thích được, bởi ST3Gal-I được xem là có vai trò nhất định đối với quá trình di căn của tế bào ung thư vú. Do vậy, khi gene này bị knock-down tế bào ung thư có xu hướng co cụm lại và không lan rộng ra các phía như hình ảnh ở tế bào đối chứng.

(A) (B)

Hình 4.1. Hình ảnh tế bào MCF7 sau 3 ngày chuyển nhiễm ở độ